Summary
Astrocytes बहुमुखी कोशिकाओं मौलिक जैविक प्रक्रियाओं कि सामान्य मस्तिष्क के विकास और समारोह, और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की मरम्मत के लिए आवश्यक हैं में भाग लेने के लिए मान्यता दी गई है. यहाँ हम एक तेजी से प्रक्रिया शुद्ध माउस astrocyte संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र की कोशिकाओं के इस प्रमुख वर्ग के जीव विज्ञान का अध्ययन प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
Astrocytes स्तनधारी मस्तिष्क में प्रचुर मात्रा में सेल प्रकार के हैं, अभी तक बहुत अपने आणविक और कार्यात्मक विशेषताओं के बारे में सीखा जा रहता है इन विट्रो astrocyte सेल संस्कृति प्रणालियों में इन glial कोशिकाओं के विस्तार में जैविक कार्यों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस वीडियो प्रोटोकॉल पता चलता है कि कैसे प्राप्त करने के लिए माउस पिल्ले की मिश्रित cortical कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति से शुद्ध astrocytes. विधि व्यवहार्य न्यूरॉन्स के अभाव और astrocytes oligodendrocytes, और microglia, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के तीन मुख्य glial सेल संस्कृति में, आबादी की जुदाई पर आधारित है. संस्कृति के पहले दिन के दौरान प्रतिनिधि छवियों एक मिश्रित सेल आबादी की उपस्थिति का प्रदर्शन और Timepoint संकेत मिलता है, जब astrocytes मिला हुआ हो और microglia और oligodendrocytes से अलग किया जाना चाहिए. इसके अलावा, हम पवित्रता और सुसंस्कृत अच्छी तरह से स्थापित के लिए immunocytochemical stainings का उपयोग astrocytes के astrocytic morphology प्रदर्शन औरनव astrocyte मार्करों वर्णित है. इस संस्कृति प्रणाली आसानी astrocyte जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए शुद्ध माउस astrocytes और astrocyte वातानुकूलित माध्यम से प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
Astrocytes एक बहुत ही प्रचुर मात्रा में केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में सेल प्रकार हैं. चूहों और चूहों के प्रांतस्था में astrocytes के न्यूरॉन्स अनुपात 01:03 है, जबकि वहाँ में मानव प्रांतस्था 1 1.4 न्यूरॉन प्रति astrocytes. Astrocyte समारोह में ब्याज नाटकीय रूप से हाल के वर्षों में वृद्धि हुई है. Astrocytes का एक प्रमुख कार्य 2,3 न्यूरॉन्स के लिए संरचनात्मक और चयापचय समर्थन प्रदान करने में उनकी भूमिका है. Astrocytes के लिए नव की खोज की भूमिकाओं कार्यों का एक व्यापक स्पेक्ट्रम कवर. ये 4-6 विकास दौरान विकासशील axons और कुछ neuroblasts के प्रवास मार्गदर्शन, synaptic प्रसारण में काम करता है, synapse और तंत्रिका 7-9 सर्किट द्वारा सूचना संसाधन शक्ति, रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) में भूमिकाओं 10 गठन और 11-13 अखंडता और cerebrovascular टोन 14 के विनियमन और. Astrocytes का एक अन्य प्रमुख विशेषता उनके चोट करने के लिए जवाब है. रोग की स्थिति astrocyt के तहततों प्रतिक्रियाशील बन गया है और और मध्यवर्ती रेशा glial fibrillary अम्लीय (GFAP) प्रोटीन और निरोधात्मक कोशिकी मैट्रिक्स (ईसीएम) प्रोटीन 15,16 की अभिव्यक्ति upregulate. रिएक्टिव astrocytes स्वस्थ ऊतकों से एक glial निशान, जो chondroitin सल्फेट proteoglycan परिवार (CSPG) के astrocyte secreted ईसीएम प्रोटीन की मुख्य रूप से शामिल द्वारा निर्मित चोट साइट हदबंदी करना, प्रमुख कारक है कि CNS 15-17 चोट के बाद axonal उत्थान रोकती हैं.
Astrocytes देर embryogenesis और प्रसव के बाद जीवन की शुरुआत के दौरान रेडियल glial कोशिकाओं (आरजी) से उत्पन्न. Astrocyte विनिर्देश के बाद हुआ है, astrocyte व्यापारियों उनके अंतिम पदों के लिए विस्थापित, जहां वे vivo में टर्मिनल भेदभाव की प्रक्रिया शुरू, astrocytes को जन्म के बाद तीन से चार सप्ताह में परिपक्व हो उनके ठेठ 18,19 आकारिकी द्वारा संकेत के रूप में दिखाई देते हैं. आरजी कोशिकाओं के एक subpopulation subventricular क्षेत्र astrocytes (प्रकार की कोशिकाओं बी) में परिवर्तित. बीoth आरजी, और प्रकार बी कोशिकाओं astrocyte की तरह विकास के दौरान और वयस्क में तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) के रूप में कार्य, क्रमशः. Astrocytes, आरजी, और प्रकार बी कोशिकाओं की तरह भी astrocyte विशिष्ट ग्लूटामेट (GLAST) ट्रांसपोर्टर, मस्तिष्क लिपिड बाध्यकारी प्रोटीन (BLBP), और GFAP व्यक्त, यह दर्शाता है कि विशेष रूप से इन मार्करों के लिए विशेष रूप से वयस्क astrocytes लेबल नहीं इस्तेमाल किया जा सकता है. वयस्क parenchymal astrocytes, जो स्वस्थ मस्तिष्क, आरजी, और प्रकार बी कोशिकाओं आत्म नवीकरण क्षमता के रूप में प्रदर्शनी स्टेम सेल संभावित विभाजन नहीं के विपरीत. Astrocytes की dysregulation कई विकृतियों में फंसा दिया गया अल्जाइमर रोग 20,21, हटिंगटन 22 रोग, पार्किंसंस रोग 23, 24 Rett सिंड्रोम और सिकंदर के रोग 25 सहित,. इसके अलावा, astrocytes सीएनएस के सभी अपमान के लिए प्रतिक्रिया, astrocyte सक्रियण और astrocytic glial निशान 16,26 गठन के लिए अग्रणी. astrocytic glial निशान कि निम्न मस्तिष्क tr रूपोंAUMA या रीढ़ की हड्डी में चोट के लिए प्रधानमंत्री neuronal उत्थान रोकने 15 बाधा माना जाता है.
विश्वसनीय तरीकों के विकास के लिए अलग और कोशिकाओं की आबादी शुद्ध बनाए रखने के तंत्रिका तंत्र के बारे में हमारी समझ के लिए अनिवार्य किया गया है. McCarthy और डी Vellis द्वारा अग्रणी काम तिथि जांचकर्ताओं नवजात चूहे के ऊतकों से 27 astrocytes के लगभग शुद्ध संस्कृतियों तैयार करने के लिए सक्षम बनाता है. बहुत astrocyte जीव विज्ञान का उपयोग कर इस विधि है, जो यहाँ माउस cortical astrocytes को अलग करने के लिए एक थोड़ा संशोधित रूप में प्रस्तुत किया जाता है के बारे में सीखा है. Vivo अध्ययन, astrocytes के रूप में के रूप में अच्छी तरह से वातानुकूलित मध्यम प्राप्त इन विट्रो संस्कृति में वर्णित का उपयोग में पूरक, मूल्यवान आगे astrocyte कार्यों में अंतर्दृष्टि लाभ कर रहे हैं.
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Protocol
1. अलगाव और मिश्रित cortical कोशिकाओं के चढ़ाना
मिश्रित astrocyte संस्कृतियों के लिए cortical सेल अलगाव P1 P4 माउस पिल्ले के लिए उपयोग किया जा सकता है. आदेश में उचित astrocyte घनत्व को प्राप्त करने के लिए यह जरूरी है कि 4 प्रति T75 ऊतक संस्कृति फ्लास्क माउस पिल्ला cortices का उपयोग. इसलिए, निम्न प्रोटोकॉल में मात्रा 4 माउस पिल्ले का उपयोग एक सेल तैयार करने के लिए गणना कर रहे हैं.
- विच्छेदन प्रक्रिया शुरू करने से पहले, astrocyte संस्कृति मीडिया के prewarm 30 मिलीलीटर (DMEM, उच्च ग्लूकोज + 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम + 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन; तालिका देखें) 37 डिग्री सेल्सियस कोट एक सेल संस्कृति ग्रेड पानी में 50 ग्राम / मिलीलीटर की 37 में 1 घंटे के लिए एकाग्रता ° सीओ 2 इनक्यूबेटर में सी में 20 मिलीलीटर पाली - डी lysine (PDL) के साथ T75 फ्लास्क.
- विच्छेदन प्रक्रिया के लिए सभी आवश्यक अभिकर्मकों और सामग्री तैयार करते हैं. शल्य कैंची, चिकनी ठीक संदंश, फ्लैट टिप संदंश, कागज तौलिये, कचरा बैग, 70% इथेनॉल: आप की आवश्यकता होगीघ 2 बर्फ पर विदारक व्यंजन (3.5 सेमी व्यास) 2 मिलीलीटर HbSS प्रत्येक के साथ भरा.
- धीरे पकड़ और और 70% इथेनॉल के साथ पिल्ला माउस के सिर और गर्दन स्प्रे. पशु कैंची का प्रयोग शिरच्छेद द्वारा बलिदान है.
- एक midline चीरा, खोपड़ी प्रकट खोपड़ी के साथ पूर्वकाल के पीछे, प्रदर्शन.
- कपाल को गर्दन से नाक को ध्यान से कट. दो अतिरिक्त कटौती करने के लिए मस्तिष्क के लिए आगे पहुँच की अनुमति देने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं: पहली कट घ्राण बल्ब, खोपड़ी आधार से कपाल काट सेरिबैलम के अन्य एक अवर के पूर्वकाल किया जाता है.
- फ्लैट टिप संदंश का प्रयोग, कपाल फ्लैप धीरे ओर करने के लिए रूप से फ़्लिप हैं और दिमाग से बाहर ले लिया है और 1 विदारक HbSS साथ भरा पकवान में रखा. पकवान बर्फ पर वापस प्लेस और सभी 4 दिमाग की कटाई जारी है.
- विच्छेदन प्रक्रिया के शेष एक stereomicroscope तहत प्रदर्शन है. सबसे पहले, घ्राण बल्ब और सेरिबैलम ठीक का उपयोग कर हटा रहे हैंविदारक संदंश (चित्रा 1 बी).
- आदेश में cortices पुनः प्राप्त करने के लिए, ठीक संदंश के साथ मस्तिष्क के पीछे के अंत हड़पने, गोलार्द्धों के बीच एक midline चीरा प्रदर्शन, बनाया ग्रोव संदंश की एक दूसरे सेट डालने और दूर छील थाली की तरह से प्रांतस्था की संरचना मस्तिष्क.
- ध्यान प्रांतस्था गोलार्द्धों से ठीक संदंश (चित्रा 1D ') के साथ खींच कर meninges काटना. इस कदम अंतिम astrocyte संस्कृति की मस्तिष्कावरणीय कोशिकाओं और fibroblasts द्वारा प्रदूषण से बचा जाता है. 2 HbSS साथ भरा पकवान में तैयार प्रांतस्था गोलार्द्धों स्थानांतरण और यह बर्फ पर वापसी कर सकते हैं. तदनुसार सभी 4 cortices के साथ जारी है.
- अंत में, छोटे टुकड़ों में तेज ब्लेड (लगभग 4 से 8 बार) का उपयोग कर प्रत्येक प्रांतस्था गोलार्द्ध में कटौती.
- बाँझ शर्तों के तहत, स्थानांतरण एक 50 मिलीलीटर बाज़ ट्यूब में प्रांतस्था टुकड़े और 22.5 मिलीलीटर की कुल मात्रा HbSS जोड़ें.
- 2.5% trypsin मिश्रण के 2.5 मिलीलीटर जोड़ें और सेते हैं37 पर पानी में स्नान ऊतक ° C 30 मिनट के लिए. हर 10 मिनट हिला सामयिक द्वारा मिक्स.
- 300 XG पर गोली प्रांतस्था ऊतक टुकड़े करने के लिए 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
- ध्यान से निस्तारण द्वारा तैरनेवाला हटा दें. आदेश में ऊतक गोली खोने से बचने के लिए आप यंत्रवत् यह एक pipet का उपयोग कर रख सकता है. एक एकल कक्ष निलंबन में 10 मिलीलीटर astrocyte चढ़ाना मध्यम और जोरदार pipetting एक 10 मिलीलीटर की प्लास्टिक विंदुक का उपयोग कर जब तक ऊतक टुकड़े एकल कक्षों dissociated में (20 से 30 गुना) हैं जोड़कर ऊतक अलग कर देना. 20 मिलीलीटर astrocyte चढ़ाना माध्यम का उपयोग करने के लिए मात्रा समायोजित. आप एक hematocytometer का उपयोग गिनती एकल कक्षों में द्वारा प्रांतस्था ऊतक की हदबंदी सबूत. 4 माउस पिल्ला cortices की एक तैयारी 10-15 x10 6 dissociated एकल कक्षों उपज चाहिए.
- T75 संस्कृति फ्लास्क से PDL Aspirate, थाली dissociated एकल कक्ष निलंबन और 37 पर सेते ° सी सीओ 2 इनक्यूबेटर में.
2. एक Enr प्राप्तiched astrocyte संस्कृति
- मिश्रित cortical कोशिकाओं और सभी 3 दिनों के बाद चढ़ाना के बाद मध्यम 2 दिनों बदलें.
- 7 से 8 दिन बाद, जब astrocytes संगामी और overlaying microglia बैठते हैं astrocyte परत पर उजागर कर रहे हैं या पहले से ही astrocyte परत (2 चित्रा) से अलग, 180 rpm पर एक कक्षीय हिलनेवाला के लिए microglia को हटाने पर 30 मिनट के लिए T75 फ्लास्क हिला. तैरनेवाला युक्त microglia त्यागें या अगर आप संस्कृति के लिए कामना करता हूं और microglia की जांच, यह नीचे स्पिन और 28,29 संस्कृति के लिए थाली.
- 20 मिलीलीटर ताजा astrocyte संस्कृति के माध्यम जोडें और 6 घंटे के लिए 240 rpm पर फ्लास्क मिलाने के लिए oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं (OPC) को हटाने के द्वारा जारी है. चूंकि कुछ OPCs astrocyte परत से पूरी तरह से अलग नहीं होगा, हाथ से सख्ती से 1 मिनट के लिए हिला जारी आदेश में OPC प्रदूषण को रोकने के लिए. तैरनेवाला त्यागें या यह स्पिन नीचे और प्लेट, अगर आप संस्कृति के लिए 29 OPCs इच्छा.
- शेष conflue कुल्लाNT पीबीएस के साथ astrocyte परत दो बार, Pbs aspirate, 37 पर 5 मिलीग्राम trypsin - EDTA और सीओ 2 इनक्यूबेटर में सेते डिग्री सेल्सियस Astrocytes हर 5 मिनट की टुकड़ी की जाँच करें और अपने हाथ की हथेली (2-3 बार) के खिलाफ फ्लास्क मार astrocytes की टुकड़ी को लागू कर सकते हैं.
- बाद astrocytes संस्कृति फ्लास्क से अलग कर रहे हैं, astrocyte संस्कृति मध्यम, 5 मिनट के लिए 180 XG पर स्पिन कोशिकाओं के 5 मिलीलीटर जोड़ने, तैरनेवाला aspirate और 40 मिलीलीटर ताजा astrocyte चढ़ाना मध्यम जोड़ें. एक T75 ऊतक संस्कृति फ्लास्क पहली कोशिका विभाजन के बाद चारों ओर 1x10 6 कोशिकाओं उपज चाहिए. दो T75 संस्कृति बोतल और सेते में 37 प्लेट कोशिकाओं ° सीओ 2 इनक्यूबेटर में सी. मध्यम बदलें हर 2 से 3 दिनों.
- 1 विभाजन astrocytes बाद 12-14 दिनों के प्रयोग का प्रदर्शन करने से पहले उचित सेल एकाग्रता 24-48 घंटा चढ़ाया जाता है. एक T75 ऊतक संस्कृति फ्लास्क दूसरी कोशिका विभाजन के बाद चारों ओर 1.5-2 x10 6 कोशिकाओं उपज चाहिए.
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Representative Results
माउस (चित्रा 1 ए) मस्तिष्क, सेरिबैलम और घ्राण बल्ब (चित्रा 1B) हटाया जा सकता है के अलगाव पर. cortices माउस मस्तिष्क स्टेम (चित्रा 1C) और व्यक्ति प्रांतस्था (चित्रा 1D ') की meninges की खुली रहे हैं ध्यान से हटा दिया (चित्रा 1E). Meninges मस्तिष्कावरणीय धमनी प्रणाली और अंतिम astrocyte संस्कृति का मस्तिष्कावरणीय कोशिकाओं और fibroblasts द्वारा संदूषण में अधूरा हटाने के परिणाम से स्पष्ट कर रहे हैं.
मिश्रित cortical सेल निलंबन के चढ़ाना के बाद, कुछ astrocytes पहले से ही 24 घंटे के भीतर (2A चित्रा) संस्कृति फ्लास्क करने के लिए देते हैं. हालांकि, सेल संस्कृति तैरनेवाला 1 3 से 5 दिन (चित्रा 2A - सी) के लिए सेल मलबे और मर न्यूरॉन्स होते हैं, के रूप में संस्कृति मध्यम और glial कोशिकाओं के अस्तित्व और विकास के पक्ष में जाएगा. एक बार मिला हुआ astrocytes और microglia astrocyt पर उजागर बैठई परत, मिश्रित cortical कोशिकाओं के अलगाव के बाद 7 दिन में आम तौर पर, astrocytes मिलाते हुए (चित्रा 2 डी) द्वारा microglia और OPCs से अलग किया जाना चाहिए. पहली विभाजित कोशिकाओं के बाद 2 दिनों astrocyte morphology दिखा. इस बिंदु astrocyte घनत्व कम है और astrocytes स्थूल हैं (चित्रा 2E, काला तीर एक सेल के निशान). T75 ऊतक संस्कृति फ्लास्क प्रति के बारे में 4-6 x10 5 कोशिकाओं के साथ इस बिंदु पर उम्मीद की उपज कम है. हालांकि, कोशिकाओं को अभी भी पैदा करना और इस Timepoint संस्कृति में परिपक्व. Astrocytes आम तौर पर 21 दिन में 28 (चित्रा 2 एफ) को प्रयोगों के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं पृथक astrocytes के एक परिपक्व phenotype सुनिश्चित. इस बिंदु पर उम्मीद की उपज T75 टिशू कल्चर फ्लास्क 1.5-2 प्रतिशत के बारे में x10 6 कोशिकाओं है.
astrocyte संस्कृति पवित्रता इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी morphological अध्ययन, सेल मार्कर अभिव्यक्ति और औषधीय 27 जवाबदेही द्वारा बताया गया है. एक के संदूषणstrocyte संस्कृति microglia (आईबीए-1) और OPCs (O4) के लिए मार्कर का उपयोग करके जांच की जा सकती है. प्राप्त astrocyte संस्कृति पवित्रता और परिपक्वता immunocytochemical GFAP प्रोटीन के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग परीक्षा द्वारा जांच की जानी चाहिए. यह उम्मीद है कि कोशिकाओं के बहुमत एक गहन, filamentous संकेत (3 चित्रा) दिखा. हमारे cortical astrocytes के अलगाव और संस्कृति विधि 98% से अधिक की एक astrocyte शुद्धता के परिणामस्वरूप, GFAP प्रोटीन (3 चित्रा) के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग करके पता चला. यदि प्रक्रिया सफल रहा था, contaminating कोशिकाओं दुर्लभ हैं (<2%) और microglia और OPCs होते हैं, जो क्रमश: आईबीए-1 और O4, का उपयोग करके कलंकित किया जा सकता है. अगर वांछित, Aquaporin-4, BLBP S100B, और GLAST जैसे अन्य astrocyte मार्करों के आगे के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. GFAP के अलावा, इन मार्करों सभी 28 दिनों के पुराने astrocyte संस्कृतियों द्वारा व्यक्त किया गया. शुद्ध astrocyte आबादी के हाल के जीन की अभिव्यक्ति की रूपरेखा नए संभावित ast का पता चलाफोलेट चयापचय एंजाइम 30,31 ALDH1L1, जो भी अलग cortical astrocytes (3 चित्रा) के बहुमत के द्वारा व्यक्त की है के रूप में इस तरह के rocyte मार्करों.
चित्रा 1. प्रसवोत्तर (पी 3) माउस प्रांतस्था के विच्छेदन) पूरे मस्तिष्क. घ्राण बल्ब और सेरिबैलम के हटाने के बाद ब्रेन बी). सी) से मस्तिष्क से प्रांतस्था की थाली की तरह संरचना छीलने द्वारा cortices का अलगाव. डी, डी 'meninges (काला तीर मस्तिष्कावरणीय धमनियों से संकेत मिलता है) के साथ उदर और पृष्ठीय साइट से प्रांतस्था). ई) प्रांतस्था meninges बिना. स्केल बार, 1.5 मिमी.
चित्रा 2. पृथक मिश्रित cortical कोशिकाओं के अलगाव के बाद अलग timepoints पर और शुद्ध astrocyte संस्कृति morphological सिंहावलोकन.ए) मिश्रित cortical कोशिकाओं के चढ़ाना के बाद 1 दिन. पहला astrocytes कुप्पी के नीचे (काला तीर) से जुड़े होते हैं और मर रहा न्यूरॉन्स तैरनेवाला में हैं. बी) 3 दिनों मिश्रित cortical कोशिकाओं के चढ़ाना के बाद. Astrocyte परत बनाने (काला तीर). न्यूरॉन्स लगभग अनुपस्थित हैं. सी) 5 दिन मिश्रित cortical कोशिकाओं के चढ़ाना के बाद. पहले microglia और OPCs एक astrocyte परत के शीर्ष पर (काला तीर). डी) मिश्रित cortical कोशिकाओं के चढ़ाना के बाद 7 दिनों. Astrocyte परत पूरी तरह से मिला हुआ है. ई) और बंटवारे के बाद जोरदार झटकों के 2 दिन के द्वारा microglia और OPCs को हटाने के बाद, कम घनत्व (तीर एक सेल से संकेत मिलता है) के साथ संलग्न कोशिकाओं astrocyte morphology दिखा. एफ) astrocyte परत 2 सप्ताह 1 विभाजन के बाद उच्च घनत्व से पता चलता है. स्केल बार, 10 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 3. प्राथमिक astrocyte संस्कृति की पवित्रता प्राथमिक माउस astrocyte संस्कृति के Immunolabeling.GFAP, GLAST, S100B, Aquaporin-4, ALDH1L1 और BLBP (सभी हरा) मार्कर के साथ tures शुद्ध प्राथमिक astrocyte संस्कृति का पता चला. नाभिक 4 ', (DAPI) 6'diamidino 2 - phenylindole (नीला) के साथ दाग रहे हैं. स्केल बार: 10 सुक्ष्ममापी.
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Discussion
यहाँ उल्लिखित विधि कृंतक नवजात दिमाग है, मूल रूप से 27 1980 में McCarthy और डी Vellis द्वारा वर्णित से astrocyte संस्कृति तैयारी पर आधारित है. प्रसवोत्तर P1 से P4 माउस मस्तिष्क में cortical astrocytes के अलगाव और संस्कृति का संशोधित विधि यहाँ प्रस्तुत तेजी से है, पैदावार शुद्ध प्राथमिक astrocytes और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. इस तकनीक को आसानी से चूहे या सुअर से और रीढ़ की हड्डी के रूप में अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों से जैसे अन्य प्रजातियों से astrocytes को अलग करने के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है. जबकि McCarthy और deVellis विधि द्वारा astrocyte पूर्वज नवजात मस्तिष्क से सेल अलगाव उत्पन्न अत्यधिक proliferative कोशिकाओं, सेल प्रसार और प्रसवोत्तर P1-P4 माउस पिल्ले की अलग astrocytes के प्रसार को सीमित है. बंटवारे astrocytes के बाद इन विट्रो में 7 दिन में एक बार (DIV), वे विकसित होगा confluency और परिपक्व vivo में, सबसे astrocyte प्रसार बड़े पैमाने पर 32 p14 पूरा है. वहकर रहे हैं, हम 21 से 28 DIV (चित्रा 2 एफ) के दिन में प्रयोगों के लिए astrocytes को पृथक astrocytes के परिपक्व phenotype सुनिश्चित करने के लिए उपयोग की सलाह देते हैं. आंतरिक संयम astrocyte संस्कृतियों पैदा होने के कारण अधिक से अधिक 3 बार splitted नहीं किया जा चाहिए.
वर्णित अलगाव विधि में महत्वपूर्ण कदम cortices के पाचन और एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए पचा ऊतक के निम्नलिखित विचूर्णन हैं. इसलिए, यह आवश्यक है trypsin एकाग्रता और पाचन समय का अनुकूलन के क्रम में 20-30 बार के लिए मस्तिष्क प्रांतस्था ऊतक के विचूर्णन के बाद एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त. कम से कम करने के लिए आदेश में भिन्नता trypsin और aliquoted किया जाना चाहिए फ्रीज पिघलना चक्र से बचा जाना चाहिए. वर्णित प्रक्रिया PDL लेपित संस्कृति बोतल, है जो astrocytes के बंधन को भरोसा दिलाते हैं और चढ़ाना के बाद कई दिनों एक सहधारा astrocyte परत को बढ़ावा देता है पर मिश्रित cortical कोशिकाओं चढ़ाना पर निर्भर करता है. हालांकि PDL कोटिंग astrocyte मीटर के लिए आवश्यक नहीं हैaintenance microglia और oligodendrocytes से उनकी जुदाई के बाद, यह immunofluorescene धुंधला हो जाना जैसे कुछ बहाव के अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है. पहली कोशिका विभाजन के समय अच्छा सेल अखंडता और उपज के लिए महत्वपूर्ण है. यदि astrocytes परे वे confluency पर पहुंच गया संवर्धित कर रहे हैं, तो आप पहली कोशिका विभाजन के दौरान अपर्याप्त टुकड़ी के कारण कोशिकाओं के बहुमत खो सकते हैं. इस टुकड़ी के लिए trypsin साथ व्यापक ऊष्मायन समय नकारात्मक सेल अखंडता को प्रभावित करती है के बाद से समय में वृद्धि से काबू नहीं किया जा सकता है. इसके विपरीत, cortical सेल निलंबन भी शायद ही चढ़ाना एक सहधारा astrocyte सेल परत की अपर्याप्त गठन में परिणाम देगा. पहली कोशिका विभाजन के लिए सबसे अच्छा समय मिश्रित cortical कोशिकाओं के चढ़ाना के बाद 7 से 8 दिन है, जब astrocytes मिला हुआ हैं और microglia कोशिकाओं astrocyte परत के सर्वोच्च स्थान पर बैठते हैं.
वर्णित cortical सेल संस्कृति में, astrocytes सेलुलर विजातिता दिखाने के लिए (<strong> चित्रा 3) के रूप में यह 33,34 vivo में astrocytes के लिए वर्णित किया गया है. हालांकि, विविध astrocyte morphology और कार्यक्षमता को परिभाषित मार्करों की सीमित संख्या के द्वारा बाधा उत्पन्न किया गया है की पहचान करने और संभावित विषम astrocyte उपप्रकारों भेद. परिपक्व रेशेदार और प्रतिक्रियाशील astrocytes के एक अच्छी तरह से विशेषता मार्कर GFAP है. हालांकि, GFAP बमुश्किल परिपक्व पुरस - संबंधी astrocytes द्वारा व्यक्त किया जाता है, सभी astrocytes के लिए एक मार्कर के रूप में इसके प्रयोग को सीमित और यह भी विकास के दौरान और वयस्क में बी कोशिकाओं द्वारा आरजी कोशिकाओं द्वारा व्यक्त की है, एक मंच विशिष्ट मार्कर के रूप में इसके उपयोग सीमित. GLAST, ALDH1L1 या BLBP सहित astrocytes, अन्य मार्करों भी अपरिपक्व astrocytes द्वारा व्यक्त कर रहे हैं और इसलिए विशेष रूप से परिपक्व astrocytes चिह्नित नहीं करते हैं. अंत में, GFAP, Aquaporin-4, और S100B जैसे परिपक्व astrocyte मार्कर (3 चित्रा) प्रसवोत्तर परिपक्वता के दौरान तेजी से विनियमित हैं.
हमारे हाथ में, ast4 सप्ताह की एक साल की उम्र में rocyte संस्कृतियों vivo में परिपक्व astrocytes की विशेषताओं है. प्राथमिक astrocyte संस्कृतियों का उपयोग हम आणविक तंत्र कैसे रक्त का जन्म प्रोटीन फाइब्रिनोजेन astrocyte 17 सक्रियण लाती पहचान सकता है. हमारे अध्ययन से पता चला कि फाइब्रिनोजेन अव्यक्त TGF-β का एक वाहक है. सक्रिय गठन TGF-बीटा और 17,26 astrocytes में TGF-β/Smad संकेतन मार्ग के सक्रियण नेतृत्व फाइब्रिनोजेन साथ प्राथमिक astrocytes के उपचार. इन परिणामों vivo में फाइब्रिनोजेन इंजेक्शन का उपयोग कर पुष्टि की गई है. इसके अलावा, astrocytes पदार्थ है, जो astrocyte वातानुकूलित मध्यम कटाई और अन्य प्रकार की कोशिकाओं को इस वातानुकूलित मध्यम लगाने से विश्लेषण किया जा सकता है के स्राव से अन्य प्रकार की कोशिकाओं को नियंत्रित करते हैं. हम पहले astrocyte वातानुकूलित माध्यम का इस्तेमाल करने के लिए एक कार्यात्मक परख वातानुकूलित फाइब्रिनोजेन का इलाज astrocytes के माध्यम neurite परिणाम को प्रभावित करता है में विश्लेषण. रिएक्टिव astrocytes एक्सप्रेस और छिपानाCSPG परिवार का प्रोटीन है, जो neurite 16 परिणाम रोकना. दरअसल, फाइब्रिनोजेन का इलाज astrocytes से वातानुकूलित मध्यम काफी दोनों neurite लंबाई और neurite 17 परिणाम दिखा कोशिकाओं के प्रतिशत की कमी हुई.
अलगाव और cortical इस प्रोटोकॉल में वर्णित astrocytes के संस्कृति astrocyte जीव विज्ञान की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है, के बाद से विभिन्न अनुप्रयोगों में उनके manageability बहुत vivo में अपनी जांच पूरी कर सकते हैं. हालांकि, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि इन विट्रो में प्राप्त astrocytes सुसंस्कृत किया गया है और जबकि वे कई astrocyte विशेषताओं को प्रतिबिंबित करते हैं, वे भी vivo astrocytes में से अलग है. इसलिए, प्रत्यक्ष और 35 या एंटीबॉडी आधारित FACS 36 अलगाव immunopanning द्वारा astrocytes के अलगाव के चयन के अन्य तरीकों के आगे astrocytes के बुनियादी गुणों की जांच करने के लिए नए रास्ते का प्रतिनिधित्व करते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
एसएस, शिक्षा और अनुसंधान के संघीय मंत्रालय KB और यूरोपीय आयोग FP7 PIRG08 GA-2010 २,७६,९८९ अनुदान, NEUREX (01 BMBF EO 0803), और जर्मन रिसर्च फाउंडेशन अनुदान 1442 / SCHA Fazit फाउंडेशन ग्रेजुएट फैलोशिप द्वारा समर्थित सीएस को 3-1 लेखकों परस्पर विरोधी कोई वित्तीय हित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Astrocyte culture media | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 31966-021 | |
| FBS, heat-inactivated | Life Technologies | 10082-147 | Final Concentration: 10% |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | Final Concentration: 1% |
| Solution for brain tissue digestion | |||
| HBSS | Life Technologies | 14170-088 | |
| 2.5% Trypsin | Life Technologies | 15090-046 | Final Concentration: 0.25% |
| Other | |||
| 70% (vol/vol) ethanol | Roth | 9065.2 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | 50 μg/ml |
| Water | PAA | S15-012 | cell culture grade |
| PBS | PAA | H15-002 | cell culture grade |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-062 | |
| 0.45 μm Sterile filter | Sartorius | 16555 | |
| 3.5 cm petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| 15 ml Falcon tube | BD Falcon | 352096 | |
| 50 ml Falcon tube | BD Falcon | 352070 | |
| 75 cm2 Tissue culture flask | BD Falcon | 353136 | |
| Forceps, fine | Dumont | 2-1032; 2-1033 | # 3c; # 5 |
| Forceps, flat tip | KLS Martin | 12-120-11 | |
| 13 cm surgical scissors | Aesculap | BC-140-R | |
| Stereomicroscope | Leica | MZ7.5 | |
| Stereomicroscope + Camera | Leica | MZ16F; DFC320 | |
| Microscope + Camera | Zeiss; Canon | Primo Vert; PowerShot A650 IS | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5805000.017 | Centrifuge5804R |
| Orbital Shaker | Thermo Scientific | SHKE 4450-1CE | MaxQ 4450 |
| Water bath | Julabo | SW20; 37 °C | |
References
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