Summary
转基因小鼠或病毒载体已用于肺内，以增加蛋白质的表达。然而，这些技术是费时，技术上具有挑战性，并有脱靶效应，可以混淆结果。蛋白转染协议使用基于脂质的转染的试剂和超细microsprayer的均匀地提供肺细胞的活性的蛋白质。
Abstract
增加蛋白质表达，使研究人员能够更好地了解这种蛋白质的功能作用，在调控的关键生物过程1。在肺中，这已被典型地实现通过遗传方法，利用转基因小鼠的2,3或蛋白水平提升的病毒或非病毒载体，通过基因表达增加4。是昂贵的和费时的，以产生转基因小鼠，和随机插入 的转基因或慢性的基因的表达，可以改变正常肺发育，从而限制在模型5的效用。虽然避免与慢性基因表达6，反向四环素控制的反式激活（rtTA）小鼠，这是用来生成条件表达式相关联的问题的条件的转基因品种，开发自发空气空间扩大7。与转基因植物，病毒和非病毒载体的使用是昂贵的，并可引发剂量-D炎症反应，ependent混淆的结果，阻碍表达10。此外，反复给药的功效的增强免疫反应的载体11,12的限制。研究人员正在开发的腺相关病毒（AAV）载体，引起炎症较轻，并有较长的表达式中肺13。
使用β-半乳糖苷酶，我们提出了一个方法，迅速和有效地提高蛋白表达在肺部直接使用蛋白转染技术。此协议混合固定量的纯化的蛋白质，用脂质体转染试剂20μl的（亲Ject的皮尔斯生物技术），以允许渗透到肺组织本身。的蛋白脂质体混合物，然后注入经由气管使用microsprayer（宾州世纪，费城，宾夕法尼亚州）的小鼠的肺中。的microsprayer产生罚款羽整个肺部的液体气溶胶。使用该技术我们已经证明了均匀注入的蛋白质沉积，整个呼吸道和肺泡的小鼠14。的脂质转染技术允许使用一个小的量的蛋白质来实现的效果。这限制了炎症反应，否则将挑起高蛋白管理。事实上，使用这种技术，我们发表，我们能够显着提高PP2A活性而不影响在肺肺灌洗细胞型15。肺灌洗细胞构成挑战后24小时可比对照组（27±4控制为31±5白蛋白转;每组N = 6）。此外，它增加蛋白水平的而诱导肺发育变化或架构变更，可发生在转基因模型。然而，需要重复给药可能使这种技术逊于长期增加蛋白表达的影响研究。这将是特别是TRUE蛋白质半衰期短。
Protocol
1。蛋白质转染试剂的制备
- 含干膜管加入250μl的甲醇或氯仿中溶解的Pro-Ject的试剂。
- 涡以最快的速度为10-20秒。
- 项目临试剂吸取20微升到单独的微量离心管。
- 减压蒸除溶剂，通过将含有至少6小时，在室温下在层流罩下的Pro-Ject的试剂的微量离心管中。它必须是完全干燥的。另外，干燥的Pro-Ject的试剂使用真空干燥器。
- 管，于-20℃下保存他们是很好的一年，在此温度下。
2。临项目试剂添加蛋白质
- 吸取50微升PBS，含2.0μg的感兴趣的蛋白质，含干燥的Pro-Ject的转染试剂20μl的成筒。
- 加入蛋白后，在较低速度f振荡混合溶液或3-5秒，然后在室温下孵育30分钟。
3。气管内注射蛋白质
- 麻醉小鼠腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪（100毫克/公斤和10毫克/公斤）。
- 镇静后，小鼠采用特殊设计的平台（ 图1）上切牙暂停。
- 使用镊子和一个文件夹作为一个喉镜，口咽打开，使得该导管可以被引入（ 图2）。气管的鼠标放置一个光源对声带的可视化。
- 蛋白质/项目试剂混合物（50微升）注射通过气管使用宾州世纪Microsprayer。
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Representative Results
为了证明我们的技术的有效性，我们使用了microsprayer（宾州世纪）注入小鼠的小鼠用2微克白蛋白（Sigma公司）溶解在50μlPBS中含有临Ject的转染试剂20μl的气管。白蛋白处理的小鼠相比，与β-半乳糖苷酶蛋白的2微克（皮尔斯生物技术），以相同的方式处理的小鼠。二十四小时后，将小鼠处死并肺部组织学分析处理。福尔马林固定，白蛋白和β-半乳糖苷酶处理的小鼠的肺组织切片进行免疫组化β-半乳糖苷酶。 ，我们发现即使蛋白转染后24小时内的气道的强染色（大箭头）的β-半乳糖苷酶处理的小鼠，但不白蛋白处理的小鼠（ 图3A和3B）。
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图1。要定位的气管内注射的小鼠，构建了一个木平台具有从其底座16成45°角的斜坡。暂停小鼠由金属线是连接到顶部的两个金属钩的门牙坡道。舌头轻轻地重新定位，用钳子，使用回形针喉镜开放气道。
图2。光源放置在脖子上后，可以可视化的喉气管内注射16。
图3。 β-半乳糖苷酶进行免疫组化染色，用2微克的气管内注射的小鼠在4μm的肺切片白蛋白（A）或β-半乳糖苷酶（B）。箭头表示呼吸道内β-半乳糖苷酶染色。图片是在40倍的放大倍率。比例尺= 100微米。
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Discussion
与其他方法相比，这种技术的优点是，它产生在肺组织内本身的蛋白水平和活性增加。此外，它渗透到肺，而不是只是停留于气道的最前端区域。我们测量蛋白活性增加我们的注射液，甚至气道灌洗后用生理盐水15。组织活动的分析表明，该蛋白进入细胞，并不会只留在空气空间的鼠标。通过免疫组化显示弥漫我们注入的蛋白质染色肺泡内和呼吸道的鼠标（ 图3），这进一步证实。更重要的是，该协议不会引发肺部炎症或蛋白酶的表达。因此，确实发生任何变化可以归因于管理的蛋白质的影响。炎症反应的缺乏允许使用重复注射，检查超过寿命长的效果ŗ一段时间。
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Disclosures
作者有没有利益冲突的披露。
Acknowledgments
支持这项工作是由美国国立卫生研究院（7R01HL098528-03）和FAMRI的临床创新奖。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pro-Ject | Pierce Bio | 89850 | |
| Microsprayer | Penn Century | FMJ-250 | |
| Beta-galactosidase | Pierce Bio | 89850 | |
| Beta-galactosidase antibody | Santa Cruz Bio | SC-19119 | |
| Mouse serum albumin | Sigma Aldrich | A3139 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma Aldrich | K113 |
References
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