Summary
Topi transgenici o vettori virali sono stati usati per aumentare l'espressione della proteina all'interno del polmone. Tuttavia, queste tecniche sono lunghi, tecnicamente complesse e hanno effetti off-target che possono confondere i risultati. Il nostro protocollo di trasfezione proteina utilizza un reagente di trasfezione basata lipidico e un MICROIRRIGATORE ultrafine per fornire uniformemente proteina attiva di cellule polmonari.
Abstract
Aumentare l'espressione della proteina permette ai ricercatori di comprendere meglio il ruolo funzionale di quella proteina nella regolazione dei processi biologici chiave 1. Nel polmone, questo è stato realizzato tipicamente attraverso approcci genetici che utilizzano topi transgenici 2,3 o vettori virali o non virali che elevano livelli di proteina tramite incremento dell'espressione genica 4. Topi transgenici sono costosi e che richiede tempo per generare e l'inserzione casuale di un'espressione genica transgene o cronica possono alterare il normale sviluppo del polmone e quindi limitare l'utilità del modello 5. Mentre transgenici condizionali scongiurare problemi associati con l'espressione genica cronica 6, le transattivatore (rtTA) topi tetraciclina controllati inversa, che vengono utilizzati per generare un'espressione condizionale, sviluppano spontanea allargamento dello spazio aereo 7. Come con transgenici, l'uso di vettori virali e non virali è costoso 8 e può provocare dose-drisposte infiammatorie ependent che confondono risultati 9 e ostacolano l'espressione 10. Inoltre, l'efficacia di dosi ripetute sono limitati dalla migliorate le risposte immunitarie al vettore 11,12. I ricercatori stanno sviluppando associati adeno-virale (AAV) vettori che provocano meno infiammazione e hanno un'espressione più lunga all'interno del polmone 13.
Utilizzando β-galattosidasi, presentiamo un metodo per aumentare l'espressione di proteine rapidamente ed efficacemente all'interno del polmone utilizzando una tecnica diretta trasfezione proteina. Questo protocollo mescola una quantità fissa di proteina purificata con 20 pl di un reagente di trasfezione base lipidica (Pro-Ject, Pierce Bio) per consentire la penetrazione nel tessuto polmonare stesso. La miscela proteica liposomiale viene poi iniettato nei polmoni dei topi attraverso la trachea utilizzando un MICROIRRIGATORE (Century Penn, Philadelphia, PA). Il MICROIRRIGATORE genera un bel pennacchio di aerosol liquidi durante i polmoni. Utilizzando la tecnicaabbiamo dimostrato deposizione uniforme della proteina iniettata durante le vie aeree e gli alveoli dei topi 14. La tecnica di transfezione lipidi permette l'uso di una piccola quantità di proteine per realizzare l'effetto. Questo limita la risposta infiammatoria che altrimenti sarebbe provocata dalla somministrazione di proteine. Infatti, con questa tecnica abbiamo pubblicato che siamo stati in grado di aumentare in modo significativo l'attività PP2A nel polmone senza influire polmone lavanda cellularità 15. Polmone lavanda cellularità preso 24 ore dopo sfida era paragonabile ai controlli (27 ± 4 Controllo vs 31 ± 5 albumina transfettate; N = 6 per gruppo). Inoltre, i livelli di proteina aumenta senza indurre alterazioni dello sviluppo polmonare o modifiche architettoniche che si possono verificare in modelli transgenici. Tuttavia, la necessità di ripetute somministrazioni può rendere questa tecnica meno favorevole per studi di esaminare gli effetti di incremento a lungo termine nell'espressione proteica. Ciò sarebbe particolarmente true per le proteine con breve emivita.
Protocol
1. Preparazione di proteine Transfezione reagente
- Sciogliere il reagente Pro-Ject aggiungendo 250 ml di metanolo e cloroformio al tubo contenente il film secco.
- Vortex per 10-20 secondi alla massima velocità.
- Pipettare 20 ml di reagente di Pro-Ject in tubi microcentrifuga separate.
- Evaporare il solvente ponendo le provette da microcentrifuga contenenti il reagente Pro-Ject sotto cappa a flusso laminare per un minimo di 6 ore a temperatura ambiente. Esso deve essere completamente asciutto. Alternativamente, essiccare il reagente Pro-Ject utilizzando un essiccatore a vuoto.
- Conservare le provette a -20 ° C. Essi sono buoni per un anno a questa temperatura.
2. L'aggiunta di proteine a Pro-Ject reagente
- Pipettare 50 ml di PBS, contenente 2,0 mg di proteina di interesse, in una provetta contenente 20 ml di reagente di trasfezione Pro-Ject essiccato.
- Dopo aver aggiunto la proteina, miscelare la soluzione nel vortex a bassa velocità fo 3-5 sec seguita da incubazione per 30 minuti a temperatura ambiente.
3. Amministrazione tracheale di Proteine
- Anestetizzare topi mediante iniezione intraperitoneale di ketamina / xilazina (100 mg / kg e 10 mg / kg).
- Dopo sedazione è raggiunto, i topi sono sospesi dalla incisivi superiori con una piattaforma appositamente progettata (Figura 1).
- Con pinze e una graffetta come laringoscopio, dell'orofaringe viene aperta in modo che il catetere può essere introdotto (Figura 2). Le corde vocali sono visualizzati semplicemente posizionando una sorgente di luce contro la trachea del mouse.
- La miscela reagente proteina / progetto (50 ml) viene iniettato attraverso la trachea usando un secolo MICROIRRIGATORE Penn.
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Representative Results
Per dimostrare l'efficacia della nostra tecnica abbiamo usato una MICROIRRIGATORE (Penn sec) per iniettare la trachea di topi con 2 pg di topo albumina (Sigma) disciolto in 50 ml di PBS che conteneva 20 ml di reagente di trasfezione Pro-Ject. I topi trattati con albumina sono stati confrontati con i topi che sono stati trattati in modo identico con 2 mg di proteina beta-galattosidasi (Pierce Bio). Dopo ventiquattro ore, i topi sono stati sacrificati ed i polmoni sono stati processati per l'analisi istologica. Immunoistochimica per beta-galattosidasi è stato condotto su sezioni di tessuto polmonare fissati in formalina dai topi trattati albumina e beta-galattosidasi. Anche 24 ore dopo la trasfezione proteina, abbiamo rilevato intensa colorazione all'interno delle vie respiratorie (frecce grandi) dei topi trattati beta-galattosidasi ma non i topi trattati albumina (Figure 3A e 3B).
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Figura 1. Per posizionare i topi per l'iniezione intratracheale, una piattaforma di legno è stato costruito che ha una rampa ad un angolo dalla sua base 16 45. I topi sono sospesi dai loro incisivi da un filo metallico che è collegato a due ganci metallici in cima la rampa. La lingua è riposizionato delicatamente con una pinza e graffetta laringoscopio viene utilizzato per aprire le vie aeree.
Figura 2. Dopo aver piazzato una sorgente luminosa sul collo, la laringe può essere visualizzato per l'iniezione intratracheale 16.
Figura 3. immunoistochimiche β-galattosidasi sono state condotte su sezioni polmonari a 4 micron da topi iniettati intratracheale con 2 mg dialbumina (A) o β-galattosidasi (B). frecce indicano colorazione β-galattosidasi entro vie aeree. Le immagini sono ad ingrandimento 40X. Barra di scala = 100 micron.
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Discussion
Il vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi è che produce aumenti dei livelli della proteina e l'attività all'interno del tessuto polmonare stesso. Inoltre, penetra alle regioni più distali del polmone rispetto a stare solo all'interno delle vie respiratorie. Abbiamo misurato un aumento dell'attività delle proteine del nostro iniettato anche dopo lavaging le vie aeree con soluzione fisiologica 15. Analisi di attività del tessuto indicano che la proteina sta entrando cellule e non solo rimangono nelle intercapedini del mouse. Ciò è stato ulteriormente confermata mediante immunoistochimica dimostrando colorazione diffusa della nostra proteina iniettata entro gli alveoli e le vie aeree del topo (Figura 3). È importante sottolineare che questo protocollo non provoca infiammazione polmonare o l'espressione della proteasi. Pertanto, le eventuali modifiche che si verificano possono essere attribuiti agli effetti della proteina somministrata. La mancanza di risposta infiammatoria permette l'uso di iniezioni ripetute per esaminare gli effetti su una longer periodo di tempo.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (7R01HL098528-03) e Clinica Innovator Award FAMRI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pro-Ject | Pierce Bio | 89850 | |
| Microsprayer | Penn Century | FMJ-250 | |
| Beta-galactosidase | Pierce Bio | 89850 | |
| Beta-galactosidase antibody | Santa Cruz Bio | SC-19119 | |
| Mouse serum albumin | Sigma Aldrich | A3139 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma Aldrich | K113 |
References
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