Summary
Трансгенные мыши или вирусные векторы были использованы для увеличения экспрессии белка в легких. Однако, эти методы требуют больших затрат времени, технически сложных и есть вне целевой эффекты, которые может поставить в тупик результаты. Наша белка трансфекции протокол использует на основе липидов реагента трансфекции и microsprayer ультрадисперсных равномерно доставки активных белков в клетках легких.
Protocol
1. Подготовка реагентов трансфекции белков
- Растворить Pro-Ject Реагент добавлением 250 мкл метанола и хлороформа в пробирку, содержащую сухой пленки.
- Vortex в течение 10-20 сек при максимальной скорости.
- Внесите 20 мкл Pro-Ject реагента в отдельные пробирки микроцентрифужные.
- Выпаривают растворитель путем размещения микроцентрифужных пробирках, содержащих Pro-Ject реагента при ламинарном потоке в течение не менее 6 часов при комнатной температуре. Она должна быть абсолютно сухой. Кроме того, сухой Pro-Ject реагента использованием вакуум-эксикаторе.
- Хранить трубы при -20 ° C. Они действительны в течение одного года при этой температуре.
2. Добавление белка Pro-Ject Реагент
- 50 мкл PBS, содержащего 2,0 мкг белка, представляющего интерес, в пробирку, содержащую 20 мкл сухого Pro-Ject реагента для трансфекции.
- После добавления белков, перемешать раствор при интенсивном перемешивании при низкой скорости Fили 3-5 с последующей инкубацией в течение 30 мин при комнатной температуре.
3. Интратрахеального введение белковых
- Обезболить мышей путем внутрибрюшинной инъекции кетамина / ксилазина (100 мг / кг и 10 мг / кг).
- После седативный эффект достигается, мыши подвешены на их верхних резцов с помощью специально разработанного платформе (Рис. 1).
- Использование щипцов и скрепкой как ларингоскоп, ротоглотки открывается таким образом, что катетер может быть введен (рис. 2). Голосовые связки визуализируются путем размещения источника света против трахеи мыши.
- Белок / проекта реагент смеси (50 мкл) вводили через трахею использованием Microsprayer Penn веке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Чтобы продемонстрировать эффективность нашей методики мы использовали microsprayer (Penn Century) для введения в трахею мышей с 2 мкг мышь альбумин (Sigma), растворенного в 50 мкл PBS, содержащий 20 мкл Pro-Ject реагента для трансфекции. Альбумин обработанных мышей по сравнению с мышами, которых обрабатывали идентичным образом с 2 мкг бета-галактозидазы белка (Pierce Bio). Через двадцать четыре часа, мышей умерщвляли и легких были обработаны для гистологического анализа. Иммуногистохимическое для бета-галактозидазы проводили на фиксированных формалином ткани легкого секции из альбумина и бета-галактозидазы мышей. Даже через 24 часа после трансфекции белков, мы обнаружили интенсивное окрашивание в дыхательных путях (большие стрелки), бета-галактозидазу мышей, но не альбумина мышей (фиг. 3А и 3В).
_upload/50080/50080fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Для позиционирования мышей внутритрахеальной инъекции, древесина платформа была построена, который имеет рампе под углом 45 ° от основания 16. Мышах подвешены резцов с помощью металлической проволоки, которая прикреплена к двум металлическими крючками в верхней части рампы. Язык мягко приложена пинцетом и ларингоскопа скрепку используется, чтобы открыть дыхательные пути.
Рисунок 2. После размещения источника света на шеи, гортани могут быть визуализированы для внутритрахеальной инъекции 16.
Рисунок 3. β-галактозидазы immunostains проводили на 4-мкм срезы легких у мышей вводили внутритрахеально с 2 мкгальбумин (А) или β-галактозидазы (B). Стрелки указывают β-галактозидазы окрашивание в дыхательные пути. Изображения при 40-кратном увеличении. Шкала бар = 100 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Преимущество этого метода по сравнению с другими методами является то, что он производит увеличение уровня белка и активность в легочной ткани непосредственно. Кроме того, он проникает в наиболее дистальных отделах легких в отличие от отдыха только в дыхательные пути. Мы измерили повышение активности белка в рационе наших инъектата даже после lavaging Airways физиологическим раствором 15. Анализ тканей активности показывают, что белок в клетки и не только остаются в воздушные полости мыши. Это было дополнительно подтверждено иммуногистохимию демонстрируя диффузное окрашивание нашей вводится белка в альвеолах и дыхательных путей мыши (рис. 3). Важно отметить, что этот протокол не спровоцировать воспаление легких или экспрессии протеазы. Таким образом, любые изменения, которые происходят можно отнести к воздействию вводимого белка. Отсутствие воспалительного ответа позволяет использовать повторных инъекций для изучения эффекта на кордеГ периода времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют конфликта интересов раскрывать.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья (7R01HL098528-03) и клинической премии Новатор FAMRI автора.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pro-Ject | Pierce Bio | 89850 | |
| Microsprayer | Penn Century | FMJ-250 | |
| Beta-galactosidase | Pierce Bio | 89850 | |
| Beta-galactosidase antibody | Santa Cruz Bio | SC-19119 | |
| Mouse serum albumin | Sigma Aldrich | A3139 | |
| Ketamine/xylazine | Sigma Aldrich | K113 |
References
- Glasser, S. W., Korfhagen, T. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Transgenic models for study of pulmonary development and disease. Am. J. Physiol. 267, 489-497 (1994).
- D'Armiento, J., Dalal, S. S., Okada, Y., Berg, R. A., Chada, K. Collagenase expression in the lungs of transgenic mice causes pulmonary emphysema. Cell. 71, 955-961 (1992).
- Foronjy, R. F., et al. Superoxide dismutase expression attenuates cigarette smoke- or elastase-generated emphysema in mice. Am. J. Respir Crit. Care Med. 173, 623-631 (2006).
- Foronjy, R., et al. The divergent roles of secreted frizzled related protein-1 (SFRP1) in lung morphogenesis and emphysema. Am. J. Pathol. 177, 598-607 (2010).
- Costa, R. H., Kalinichenko, V. V., Lim, L. Transcription factors in mouse lung development and function. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 280, 823-838 (2001).
- Perl, A. K., Tichelaar, J. W., Whitsett, J. A. Conditional gene expression in the respiratory epithelium of the mouse. Transgenic Research. 11, 21-29 (2002).
- Morimoto, M., Kopan, R. rtTA toxicity limits the usefulness of the SP-C-rtTA transgenic mouse. Dev. Biol. 325, 171-178 (2009).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nature reviews. Genetics. 8, 573-587 (2007).
- Crystal, R. G., et al. Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis. Nat. Genet. 8, 42-51 (1994).
- Merkel, O. M., Zheng, M., Debus, H., Kissel, T. Pulmonary gene delivery using polymeric nonviral vectors. Bioconjugate Chemistry. 23, 3-20 (2012).
- Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses. J. Virol. 69, 2004-2015 (1995).
- Liu, Q., Muruve, D. A. Molecular basis of the inflammatory response to adenovirus vectors. Gene Ther. 10, 935-940 (2003).
- Pfeifer, C., Aneja, M. K., Hasenpusch, G., Rudolph, C. Adeno-associated virus serotype 9-mediated pulmonary transgene expression: effect of mouse strain, animal gender and lung inflammation. Gene Ther. 18, 1034-1042 (2011).
- Wallace, A. M. Protein phosphatase 2A regulates innate immune and proteolytic responses to cigarette smoke exposure in the lung. Toxicol. Sci. 126, 589-599 (2012).
- Wallace, A. M. Protein Phosphatase 2a (Pp2a) Regulates Innate Immune and Proteolytic Responses to Cigarette Smoke Exposure in the Lung. Toxicol. Sci. , (2012).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
