Summary
يوصف نموذج كدمة من إصابة الحبل الشوكي الشديدة. يتم وصف خطوات تفصيلية قبل العملية، المنطوق وبعد العمليات الجراحية للحصول على نموذج ثابت.
Abstract
وينبغي التحقيق في احتمال متعدية من العلاجات رواية في إصابة الحبل الشوكي الشديدة (SCI) نماذج كدمة. ووصف منهجية مفصلة للحصول على نموذج ثابت من اصابات النخاع الشوكي الشديدة. استخدام إطار المجسم والمسبار الكمبيوتر التي تسيطر عليها يسمح لخلق الإصابة استنساخه. انخفاض حرارة الجسم والتهاب المسالك البولية تشكل تحديات كبيرة في الفترة اللاحقة للعمليات الجراحية. رصد دقيق للحيوانات مع صحيفة تسجيل الوزن والتعبير المثانة يسمح للكشف المبكر عن مضاعفات ما بعد الجراحة. النتائج الفنية لهذا النموذج كدمة تعادل نماذج عانى من قطع. ويمكن استخدام نموذج كدمة لتقييم فعالية من كلا النهجين اعصاب وneuroregenerative.
Introduction
اختيار نموذج الإصابة المناسبة أمر بالغ الأهمية لتقييم ما قبل السريرية من العلاجات رواية لاصابات الحبل الشوكي (النخاع الشوكي). 1،2،13 في دراسة حديثة من الأطباء والعلماء في مجال رضح عصبي نموذج كدمة، في مقابل تنصيف أو نماذج عانى من قطع كامل ، والمقبولة عالميا لتكون وثيقة الصلة سريريا. ويستند هذا الرأي على 8 ملاحظة أن غالبية اصابات الحبل الشوكي في البشر هو contusive في الطبيعة. 10 بيولوجيا كدمة ويبدو أيضا أن يكون مختلفا عن تنصيف أو عانى من قطع النماذج. Iseda 11، وآخرون آل. مقارنة تأثير داخل النخاع chondroitinase ABC حقن على neuroregeneration بشكل منفصل في تنصيف ونماذج كدمة. 4 تجدد المحاور وحظ في الجسر العصبية في تنصيف ولكن ليس مجموعة اصابات النخاع الشوكي كدمة. وتنصيف أو نماذج عانى من قطع كامل أيضا تهيئة الظروف تعرف أنها موجودة في فقط مجموعة فرعية صغيرة جدا من CLالظروف inical. على سبيل المثال، قد استخدمت العديد من المحققين التدخلات القائمة على السقالة لزرع في تجويف آفة بعد تنصيف أو عانى من قطع كامل لتعزيز التجدد. 6 يصبح هذا النهج غير ذي صلة سريريا لخلق تجويف داخل الحبل الشوكي المصاب هو غير عملي وربما غير أخلاقية.
تقلب في الانتعاش وظيفية لا يزال يشكل تحديا كبيرا للنماذج كدمة. 5،12 هذا التغير يمكن التقليل من استخدام المسبار الكمبيوتر التي تسيطر عليها وتثبيت العمود الفقري قبل تأثير لتسليم قوة موحدة عبر حجم الحبل الشوكي وخاصة مسارات للسيارات يقع البطني . وتجدر الإشارة إلى أن اللدونة ومساهمة ضمانات من المحاور قيد الحياة هي الآلية الغالبة من الانتعاش بعد إصابة الحبل الشوكي. 1 الاختلافات لذلك، ولو كانت بسيطة في تقنية كدمة قد تسفر عن نتائج مختلفة إلى حد كبير. تحقيقا لهذه الغاية وضعنانموذج من إصابة الحبل الشوكي الشديدة التي ينتج عنها حجم كدمة متسقة والانتعاش وظيفية قابلة للمقارنة مع نماذج عانى من قطع. يمكن استخدام هذا النموذج للتحقيق في كل من العصبية واستراتيجيات neuroregeneration كدليل على مفهوم للفعالية العلاج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التحضير قبل اصابات الحبل الشوكي
الأدوات الجراحية اللازمة لهذا الإجراء هي مشرط، بيك آب مع وبدون أسنان، المرقأة، الكامشات الاحتفاظ النفس، قراضة غيض غرامة، سائق إبرة، الغرز للامتصاص، والجلد مقطع تطبيقها. الإمدادات الجراحية الأخرى المطلوبة هي الستائر الجراحية، وصحائف عقيمة لحقل الجراحية، والإسفنج الشاش، القطن تطبيقها تلميح، واحباط المعدنية. الأوتوكلاف الأدوات والمعدات الجراحية قبل الجراحة. استخدام مجموعة من الأدوات الفردية والإمدادات اللازمة لحيوان واحد. تنظيف المنطقة الجراحية وجهاز (المسبار، مصدر الضوء، والإطار المجسم، والزجاج حبة التعقيم، ومنصات التدفئة) مع مناديل الكحول.
فتح الستائر الجراحية واستخدام قفازات معقمة لثنى الجراحي الميداني تجنب بعناية التلوث. فتح الصكوك الفردية sterilely ووضع بعناية العاملين في الميدان الجراحية. تغطية المقابض ومقابض من المن المرجح حاجة جهاز البريد أثناء الإجراء مع رقائق معدنية معقمة. التحول في حبة تعقيم الزجاج لتكون جاهزة للاستخدام أثناء العملية.
2. إعداد الحيوانات
جعل الفئران إلى المختبر منطقة القليلة ساعة قبل الإجراء الفعلي. إدارة الدواء الألم ساعة واحدة على الأقل قبل إجراء متوقع (عادة buprinorphine 1.5 مل من 0.006 ملغ / مل تحت الجلد). إدارة المضادات الحيوية قبل الجراحة (عادة Baytril 4 ملغ / كغ تحت الجلد). تخدير الفئران باستخدام 90 ملغم / كغم من الكيتامين وانتظر حتى لم يكن هناك استجابة قرصة أخمص القدمين. جس العملية الشائكة الأبرز في الفقرات الصدرية. هذا المستوى يتوافق عادة مع T10 العملية الشائكة. وضع علامة على موقع من مستوى المقصود فيما يتعلق T10. في مختبرنا نقوم اصابة T10. يصف السرد التالي من تقنية T10 اصابات النخاع الشوكي. حلاقة 3 سم × 6 سم المستطيل طوليا، وتركزت على مستوى T10. تنظيف البشرة ثلاث مرات وايال حل بتدين. تطبيق مواد التشحيم العيون على كل عين. نقل الفئران في وضع مريح إلى الميدان الجراحية تجنب بعناية التلوث. إدراج التحقيق في درجة الحرارة المستقيم لمراقبة درجة الحرارة الأساسية وضبط التدفئة وفقا لذلك للحفاظ على درجة حرارة الحيوان أقرب إلى وضعها الطبيعي (~ 37.5 ° C) ممكن. تغطية الفئران مع ثنى الجراحية مع نافذة فوق موقع الجراحية.
3. إجراء العمليات الجراحية
بادئ ذي بدء تقريبي 4 سم شق باستخدام شفرة # 10 تركزت على علامة T10. الشروع في تشريح بصبر اللفافة وطبقات العضلات بعيدا عن العمليات الشائكة T9-T11 والصفائح. ضع الكامشات لسحب العضلات واللفافة بعيدا عن العظام. حين استقرار العملية الشائكة من T9 تقسيم حاد في الرباط بين السناسن بين T9 T10 وباستخدام مقص غرامة. وبالمثل استقرار العملية الشائكة T10 وتقسيم الرباط بين السناسن بين T10-T11. استخدام التكبير حلقة لمجمعات لالشركة المصرية للاتصالات تقسيم الأربطة على طول الطريق من خلال الرباط الأصفر (الشكل 1). الكيس قرابي غير بادية للعيان مرة يتم قطع الرباط الأصفر. استخدام رينجرز غيض غرامة لأداء بعناية الثقب المجزأ ثنائيا في T10. يتم أخذ أقصى درجات الحرص لتجنب الضغط الهبوطي على كيس قرابي والإصابات غير المتعمدة من النصائح قراضة. تتم إزالة الصفيحة والعملية الشائكة من T10 تماما.
نقل الحيوانات الى الموقف على منصة الاستقرار. استخدام المشابك استقرار لشل حركة العمود الفقري من قبل لقط النواحي الجانبية من الجسم الفقري T11 تليها النواحي الجانبية من الجسم T9 الفقري. يجب الحرص على عدم ضغط الفئران في منصة مع المشابك استقرار لأن هذا من شأنه أن يقيد مساحة للحركات التنفس وإضافة الإجهاد غير المرغوب فيها الحيوان. بعد تأمين يتم فحص إعدادات العمود الفقري على المسبار الكمبيوتر التي تسيطر عليها. نحن عادة استخدام طرف المسبار من 3.0 ملم في SPالعيدين من 4 سم / ثانية على عمق 2 ملم ووقت يسكن من 0.3 ثانية. تمديد طرف المسبار وخفضه حتى يلمس فقط سطح الحبل. سحب طرف وخفض الجهاز 2 ملم نحو السطح الحبل الشوكي. مكبس إطلاق في 4 سم / ثانية تسبب كدمة إصابة الحبل الشوكي الشديدة. تحقيق الإرقاء باستخدام الضغط ما يكفي للحفاظ على قضيب من القطن ذات طرف في المكان، والحرص على عدم خلق أي ضغط لا لزوم لها على الحبل. خياطة العضلات وطبقات اللفافة مع شخصية-8 غرزة والحرص على عدم سحب ضيقة جدا باستخدام الخيوط الجراحية القابلة للامتصاص. إغلاق الجلد مع الحد الأدنى من 2 الدبابيس الصغيرة، ويمكن استخدام ما يصل إلى 4 أو 5 أجزاء من المواد الغذائية إذا شق تبقى مفتوحة بعد أول 2 أو 3 من السلع الاساسية.
3. العناية بعد العملية
مكان الفئران في بيئة دافئة من حوالي 33-35 درجة مئوية لمدة 24 ساعة بعد الجراحة. وهذا يستتبع حاضنة (بينما هم اللاوعي) ومساحة القفص ساخنة مرة واحدة فإنها تبدأ في التحرك. مرة واحدة الفئران هي AW تماماأك، إدارة 5ML من المياه المالحة، 1.5 مل (0.006 ملغ / مل) من buprinorphine، و 0.1 مل من Baytril جميع تحت الجلد. تواصل مع buprinorphine تحت الجلد مرتين في اليوم لمدة ساعة الأولى 24-48 وBaytril مرة واحدة يوميا لمدة 7 أيام. وينبغي التعبير عن قربة يدويا ثلاث مرات يوميا حتى عودة وظيفة المثانة (<2 مل من البول في التعبير الصباح الباكر لمدة 3 أيام متتالية). وينبغي أيضا أن يتم التحقق الحيوانات خلال هذا الوقت للعدوى (دم في البول، بيضاء اللون، أو رائحة كريهة)، انخفاض النشاط البدني أو مشاكل مع التئام الجروح. ولذا ينبغي التصدي جود عدوى مع جرعة زيادة (أو إعادة بدء) للمضادات الحيوية في التشاور مع الأطباء البيطريين المحليين. وزن الفئران التي تبدأ يوميا بعد يوم من عملية جراحية لتقييم تعافيهم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
حجم الآفة
لقد حصلنا على كميات كبيرة الآفة ومتسقة باتباع تقنية الموضحة أعلاه. باستخدام Luxol سريع الأزرق تلطيخ حجم الآفة متوسط 2.04 مم 3 (95٪ CI 1،9 حتي 2،18) (ن = 5 حيوانات) تم الحصول عليها. الشكل 2 يبين يعني حجم الآفة مع تلطيخ ممثل باستخدام الأزرق سريع Luxol من خلال مركز الزلزال الآفة.
عشرات الوظيفية
وسيتم عرض عشرات السلوكية مقاسا بريسناهان (BBB) مقياس باسو، بيتي، في الشكل 3. في 12 أسبوعا حقق الفئران في المجموعة الضابطة ومتوسط درجة BBB من 2.2 ± 1.1 (ن = 10 الحيوانات).
غيرها من المعلمات
استنادا إلى تجربتنا الأخيرة مع 32 عملية جراحية الحيوانية في معدل البقاء على قيد الحياة من هذه التقنية هو 93.4٪. وتتعلق جميع الوفيات إلى استمرار التهاب المسالك البولية (UTI)، يليه التضحية الحيوانية لتجنب الألم المفرط والمعاناة. بعد الانتهاء من تناول المضادات الحيوية لمدة 7 أيام وضعت الحيوانات 16.7٪ UTI. وكان متوسط عدد أيام للكشف عن التهاب المسالك البولية بعد العملية 14.6 ± 7.6 يوما. ومن المثير للاهتمام الحيوانات تحقيق السيطرة على المثانة في المتوسط 13 يوما بعد الإصابة (يعني 13.33 ± 3.6 يوما). الفئران الذين طوروا التهاب المسالك البولية استغرق وقتا أطول لتحقيق السيطرة على المثانة بالمقارنة مع الفئران دون التهاب المسالك البولية (السيطرة على المثانة في الفئران مع التهاب المسالك البولية - 16 ± 1 أيام مقابل 12.8 ± 3.7 يوما عن السيطرة على المثانة في الفئران دون UTI، P = 0.03). في الفوج أن يتحقق السيطرة على المثانة في غضون 14 يوما لم يتم اكتشاف أي التهاب المسالك البولية اللاحقة. كما هو مبين في الشكل (4)، كان هناك مكاسب أولية في الوزن بعد اصابات النخاع الشوكي المحتمل من احتباس السوائل. انخفض الوزن في وقت لاحق واستقرت إلى مستوى أدنى (أقل ما يقرب من 10-12٪ من خط الأساس) في حوالي 10 أيام.
/ files/ftp_upload/50111/50111fig1highres.jpg "/>
الشكل 1. تشريح العمود الفقري من الفئران من النهج الخلفي (يسار) مما يدل على العمليات الشائكة والصفائح. ويصور موقف الرباط الأصفر (LF) في الفضاء بين الصفائح. القسم منتصف saggital (يمين) تبين الوضع النسبي للflavum الرباط والرباط بين السناسن فيما يتعلق الحبل الشوكي.
الشكل 2. الرسم البياني شريط يظهر حجم الآفة (في مم 3، محور Y) في الحيوانات تلقي إصابة الحبل الشوكي شديد (إلى اليسار). A المقطع الطولي ممثل من خلال مركز الزلزال الاصابة بعد Luxol تلطيخ الأزرق سريع (يمين).
g3highres.jpg "/>
الشكل (3). يعني BBB (Y محور) نقاط من الفئران على مدى 3 أشهر للمتابعة (X المحور) مما يدل الحد الأدنى من الانتعاش نموذجية من اصابات النخاع الشوكي الشديدة.
الشكل 4. الرسم البياني خط يظهر التباين في الوزن يوميا (في ز، Y محور) من الفئران مدة أكثر من 2 أسابيع (X محور) بعد تحريض من إصابة الحبل الشوكي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أظهرت العديد من العلاجات رواية مؤخرا الوعد في وقت مبكر في مجال البحوث اصابات النخاع الشوكي. 3 تقييم دقيق لهذه العلاجات هو أساسي في نموذج ذات الصلة سريريا من اصابات النخاع الشوكي لتحديد الاستراتيجيات مع أقصى قدر من إمكانات متعدية. وقد وضعت خطة للتصنيف مؤخرا لتقييم قوة من الدراسات قبل السريرية. 9 أكدت هذه الخطة على أهمية استخدام نموذج كدمة شديدة من اصابات النخاع الشوكي. نحن هنا وصف مثل هذا النموذج من كدمة شديدة اصابات النخاع الشوكي مع حجم الآفة بما يتفق ودرجات وظيفية تشبه تلك النماذج عانى من قطع. يمكن استخدام هذا النموذج باعتباره 'دليلا على مفهوم' لإقامة فعالية العلاج سواء بالنسبة العصبية واستراتيجيات neuroregeneration.
الجيل موحدة contusive اصابات النخاع الشوكي يظل تحديا. للاستنساخ، فمن الضروري أن يتم تنفيذ إصابة كما موحد قدر الإمكان. يجب تحديد المستوى المستهدف من الحبل الشوكي باستمرار الابام حيوان إلى حيوان. وينبغي أن يتم التخلص من العظام خلال الثقب بعناية لضمان يتم ترك أي شظايا العظام في القناة الشوكية، وهذه يمكن أن تسبب إصابات الضغط وإدخال التغيرات غير المرغوب فيها في آليات الإصابة وإمكانية الانتعاش. لقد اعتمدت عدة خطوات لضمان الاتساق بما في ذلك حجم المسبار، وتثبيت العمود الفقري جامدة على الإطار مع الأسلحة التي شنت استقرار، وذلك باستخدام سرعة تأثير موحد وعمق الانحشار. من المهم أن الفئران وضعه بشكل مريح عندما يتم فرضت ملقط الاستقرار إلى الهيئات الفقري. أي اختلافات في محاذاة العمود الفقري أو الإجهاد الزائد أثناء لقط قد يغير من تأثير الميكانيكا الحيوية. استخدمنا مم المسبار 2.5 لأن متوسط حجم الفئران الحبل الشوكي في منطقتنا من الفائدة 2.5-3 ملم. وقت الاتصال أو يسكن تم تعيين موحد في 0.3 ثانية في تجاربنا. ولكن في ملاحظتنا والتقارير الواردة من مختبرات أخرى، لنموذج شديد من اصابات النخاع الشوكي عمق الأثر هو الأكثر أهميةالمعلمة. في التجارب المذكورة في هذه الورقة تم تسليمها للتأثير على عمق ثابت من 2 ملم. العوامل الأخرى التي تؤثر على التوحيد وتشمل تدريب الموظفين، والتصور الواضح للأنسجة، وطرف المسبار لضمان تأثير مباشر في أنسجة الحبل (وليس الهياكل العظمية).
ينبغي التقيد الفئران باستمرار خلال إجراءات العلامات الحيوية اللازمة الأهم من درجة الحرارة الأساسية والتنفس. انخفاض حرارة الجسم هو السبب الرئيسي للوفيات أثناء ومباشرة بعد إدارة التخدير. ورصد درجة الحرارة الأساسية مع مسبار المستقيم ومنصات التدفئة المناسبة تجنب هذه المضاعفات. إذا يصبح التنفس غير منتظم أو يتوقف الحيوان على التنفس، يجب أن تتوقف فورا حتى إجراء التنفس يعود إلى خط الأساس. الألم المفرط وغير مقصود أو أكثر من جرعة من الألم والتخدير الدواء قد يؤدي أيضا إلى مشاكل في التنفس. الفئران ينبغي رصدها بعناية بعد الإجراء. ث بهميجب أن تقاس بدقة الثمانيات وفقدان> 20٪ من الوزن الأساسي يجب ان يدفع التحقيق في الغذاء والماء المتناولة، والتهاب المسالك البولية، وانهيار الجلد، وبعد اصابات النخاع الشوكي العلوص، الخ التشاور المبكر مع الكوادر البيطرية للتقييم والعلاج أمر حاسم في مثل هذه الحالات. كما نوقش في وقت سابق، يجب أن تبدأ الفئران الذين لم يستعيدوا السيطرة على المثانة بواسطة 14 يوما يعود على المضادات الحيوية لتجنب قاتلة التهاب المسالك البولية.
يمكن أن يتسبب إصابة الحبل الشوكي عن طريق إما طريقة الإزاحة أو أسلوب قوة ثابتة. 5،12 تقنية وصفها في هذه الورقة هو طريقة الإزاحة حيث يتم تسليم القوة إلى عمق ثابت داخل الأنسجة الحبل الشوكي. استخدام المسبار الكمبيوتر التي تسيطر عليها يسمح لمستوى التحكم الذي لا يمكن تحقيقه من خلال الطرق الشائعة الأخرى من التجريبية اصابات النخاع الشوكي. تقنية ضغط مقطع لا يسمح لغير حادة، قوة contusive مع الإفراج الفوري، في حين أن تأثير جامعة نيويوركأو يعتمد على الجاذبية لتحديد قوة من كدمة. هذه التقنيات على الرغم من استنساخه، لا تسمح المحاكاة لظروف واجهتها خلال حادث سيارة، والسبب الأكثر شيوعا لاصابات النخاع الشوكي الحاده في البشر. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن شدة الإصابة هي مرتبطة مباشرة مع عمق تأثير من سرعة التأثير. 7 لذلك هذا النموذج يسمح لاصابات النخاع الشوكي الشديدة التي يتعين القيام بها بشكل روتيني مع احتمال لتعديل شدة من خلال مجموعة أكبر من مزيج من القوة والتشريد .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا شيء الإفصاح المالي
التمويل الكشف عن لا شيء.
Acknowledgments
المؤلفون ممتنون للدكتور N. بانيك والدكتور D. ميتشل لتوجيهاتهم في تطوير هذا النموذج.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer controlled impactor | Leica or the Infinite Horizons (formerly OSU) impactor | ||
| Surgical instruments | |||
| Scissors | Fine Science Tools Inc | 14094-11 or 14060-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools Inc | 11006-12 and 11027-12 or 11506-12 | |
| Hemostats | Fine Science Tools Inc | 13009-12 | |
| Retractors | Fine Science Tools Inc | 17011-10 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools Inc | 16020-14 | |
| Needle driver | Fine Science Tools Inc | 12001-13 | |
| Stereotactic frame | Leica or RWD Life Science Co. or TSE systems | ||
| Buprinorphine | |||
| Baytril | Bayer | ||
| Ketamine | |||
References
- Blesch, A., Tuszynski, M. H. Spinal cord injury: plasticity, regeneration and the challenge of translational drug development. Trends Neurosci. 32, 41-47 (2009).
- Dobkin, B. H. Curiosity and cure: translational research strategies for neural repair-mediated rehabilitation. Dev. Neurobiol. 67, 1133-1147 (2007).
- Fehlings, M. G., Cadotte, D. W., Fehlings, L. N. A series of systematic reviews on the treatment of acute spinal cord injury: a foundation for best medical practice. J. Neurotrauma. 28, 1329-1333 (2011).
- Iseda, T., Okuda, T., Kane-Goldsmith, N., et al. Single, high-dose intraspinal injection of chondroitinase reduces glycosaminoglycans in injured spinal cord and promotes corticospinal axonal regrowth after hemisection but not contusion. J. Neurotrauma. 25, 334-349 (2008).
- Khan, T., Havey, R. M., Sayers, S. T., et al. Animal models of spinal cord contusion injuries. Laboratory Animal Science. 49, 161-172 (1999).
- Kim, B. G., Kang, Y. M., Phi, J. H., et al. Implantation of polymer scaffolds seeded with neural stem cells in a canine spinal cord injury model. Cytotherapy. 12, 841-845 (2010).
- Kim, J. H., Tu, T. W., Bayly, P. V., et al. Impact speed does not determine severity of spinal cord injury in mice with fixed impact displacement. Journal of Neurotrauma. 26, 1395-1404 (2009).
- Kwon, B. K., Hillyer, J., Tetzlaff, W. Translational research in spinal cord injury: a survey of opinion from the SCI community. J. Neurotrauma. 27, 21-33 (2010).
- Kwon, B. K., Okon, E. B., Tsai, E., et al. A grading system to evaluate objectively the strength of pre-clinical data of acute neuroprotective therapies for clinical translation in spinal cord injury. J. Neurotrauma. 28, 1525-1543 (2011).
- Norenberg, M. D., Smith, J., Marcillo, A. The pathology of human spinal cord injury: defining the problems. J. Neurotrauma. 21, 429-440 (2004).
- Siegenthaler, M. M., Tu, M. K., Keirstead, H. S. The extent of myelin pathology differs following contusion and transection spinal cord injury. J. Neurotrauma. 24, 1631-1646 (2007).
- Talac, R., Friedman, J. A., Moore, M. J., et al. Animal models of spinal cord injury for evaluation of tissue engineering treatment strategies. Biomaterials. 25, 1505-1510 (2004).
- Tator, C. H. Review of treatment trials in human spinal cord injury: issues, difficulties, and recommendations. Neurosurgery. 59, 957-982 (2006).
