Summary
Un modello contusione di gravi lesioni del midollo spinale è descritto. Fasi di pre-operatoria, operatoria e post-operatoria dettagliate sono descritte di ottenere un modello coerente.
Abstract
Il potenziale traslazionale di nuovi trattamenti deve essere esaminata a gravi lesioni del midollo spinale (SCI) modelli contusione. Una metodologia dettagliata è descritta di ottenere un modello consistente di grave SCI. Uso di un telaio stereotassico e simulazione controllato da computer consente la creazione di lesioni riproducibile. Ipotermia e infezioni delle vie urinarie rappresentano sfide significative nel periodo post-operatorio. Un attento monitoraggio di animali con la registrazione del peso giornaliero e di espressione della vescica permette per la diagnosi precoce delle complicanze post-operatorie. I risultati funzionali di questo modello contusione sono equivalenti ai modelli transection. Il modello contusione può essere utilizzata per valutare l'efficacia di entrambi gli approcci neuroprotettivi e neurorigenerativo.
Introduction
Scelta di un adeguato modello di lesione è cruciale per la valutazione preclinica di nuovi trattamenti per le lesioni del midollo spinale (SCI). 1,2,13 In una recente indagine di medici e scienziati nel campo del modello contusione neurotrauma, al contrario di emisezione o modelli completi transection , è stato universalmente accettato di essere clinicamente rilevante. 8 Il presente parere si basa sulla constatazione che la maggior parte delle lesioni del midollo spinale nell'uomo è contusivo in natura. 10 La biologia della contusione sembra anche essere diverso da emisezione o transection modelli. Iseda 11, et al. confrontato l'effetto di intraspinal condroitinasi iniezione ABC il neuroregeneration separatamente nei modelli contusione emisezione e. 4 rigenerazione assonale è stato osservato nel ponte neuronale in emisezione ma non il gruppo SCI contusione. Il modelli completi transection emisezione o anche creare le condizioni noti presenti in solo un piccolo sottoinsieme di clcircostanze inical. Ad esempio, diversi ricercatori hanno impiegato interventi impalcatura a base per l'impianto nella cavità della lesione dopo emisezione o resezione completa per promuovere la rigenerazione. 6 Questo approccio diventa clinicamente irrilevante, perché la creazione di una cavità all'interno midollo spinale danneggiato è impraticabile e probabilmente immorale.
Variabilità nel recupero funzionale rimane una sfida importante per i modelli contusione. 5,12 Questa variabilità può essere minimizzato con l'uso di urto e di stabilizzazione della colonna vertebrale computer controllati prima dell'impatto per la consegna vigore uniforme in tutto il volume del midollo spinale in particolare le vie motorie situati ventralmente . Si deve notare che la plasticità e il contributo collaterale da assoni sopravvissuti è il meccanismo predominante di recupero dopo la lesione del midollo spinale. 1 variazioni Quindi anche minori in tecnica contusione possono produrre risultati molto diversi. A tal fine abbiamo sviluppatoun modello di gravi lesioni del midollo spinale da cui si ricava il volume contusione coerenti e recupero funzionale comparabile con i modelli transection. Questo modello può essere utilizzato per lo studio sia per la neuroprotezione e strategie neuroregeneration come prova di concetto per l'efficacia del trattamento.
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Protocol
1. Preparazione Prima di lesioni del midollo spinale
Gli strumenti chirurgici necessari per questa procedura sono bisturi, pickup con e senza denti, emostatiche, divaricatori auto di sostegno, multa rongeurs punta, driver aghi, suture riassorbibili, e la pelle applicatori di clip. Altre forniture chirurgiche necessarie sono teli chirurgici, lenzuola sterili per campo operatorio, spugne garza, applicatori di cotone-tip e lamina metallica. Autoclave gli strumenti chirurgici e le forniture prima della chirurgia. Utilizzare il set individuale di strumenti e forniture per un animale. Pulire l'area chirurgica e apparecchi (simulazione, fonte di luce, cornice stereotassica, perle di vetro sterilizzatori, e rilievi di riscaldamento) con cotone imbevuto di alcol.
Aprire i teli chirurgici e usare guanti sterili per coprire il campo chirurgico evitando accuratamente la contaminazione. Aprire i singoli strumenti sterilmente e posizionare con cura quelli nel campo chirurgico. Coprire le manopole e maniglie di secoloApparecchi e probabilmente necessario durante la procedura con la lamina metallica sterile. Accensione sulla sferetta sterilizzatore vetro per essere pronti per l'uso durante la procedura.
2. Preparazione degli animali
Portare i ratti alla zona laboratorio poche ore prima della procedura reale. Somministrare farmaci antidolorifici almeno un ora prima della procedura prevista (tipicamente buprinorphine 1,5 ml di 0,006 mg / ml per via sottocutanea). Somministrare antibiotici preoperatori (tipicamente Baytril 4 mg / kg per via sottocutanea). Anestetizzare i topi con 90 mg / kg di ketamina e aspettare fino a quando non vi è alcuna risposta in punta pizzico. Palpare il processo spinoso più prominente nella spina dorsale toracica. Questo livello corrisponde in genere con T10 processo spinoso. Segnare la posizione del livello previsto in relazione al T10. Nel nostro laboratorio eseguiamo una lesione T10. La narrazione segue descrive la tecnica del T10 SCI. Shave un cm x 6 cm rettangolo di 3 longitudinalmente e centrata a livello T10. Pulire la pelle tre volte wisoluzione di Betadine esimo. Applicare oftalmica lubrificante su ogni occhio. Trasferire il ratto in una posizione comoda per il campo chirurgico evitando accuratamente contaminazioni. Inserire una sonda di temperatura rettale per monitorare la temperatura interna e regolare il riscaldamento di conseguenza per mantenere la temperatura animale come vicino al normale (~ 37,5 ° C) come possibile. Coprire il ratto con un telo chirurgico con una finestra sopra il sito chirurgico.
3. Procedura chirurgica
Inizia con un approssimativo 4 centimetri incisione con una lama di 10 ° centrato sul marchio T10. Procedere a sezionare con pazienza fascia e strati muscolari lontano dalle T9-T11 processi spinosi e lamine. Posizionare divaricatori per ritrarre muscolo e fascia dall'osso. Mentre la stabilizzazione del processo spinoso di T9 nettamente dividere il legamento interspinoso tra T9 e T10 con le forbici sottili. Allo stesso modo stabilizzare il processo spinoso T10 e dividere il legamento interspinoso tra T10-T11. Utilizzare ingrandimento loop per complete la divisione dei legamenti tutto il percorso attraverso il legamento giallo (Figura 1). Il sacco durale è evidente una volta che il legamento giallo è scollegato. Utilizzare multa rongeurs punta per eseguire attentamente spicciolata laminectomia bilaterale a T10. Massima attenzione è presa per evitare una pressione al ribasso sul sacco durale e lesioni involontarie dalle punte rongeur. La lamina e il processo spinoso di T10 viene completamente rimosso.
Spostare l'animale in posizione sulla piattaforma di stabilizzazione. Utilizzare fascette stabilizzanti per immobilizzare la colonna vertebrale fissando gli aspetti laterali del corpo vertebrale T11 seguiti dagli aspetti laterali del corpo vertebrale T9. Fare attenzione a non comprimere il topo nella piattaforma con i morsetti di stabilizzazione poiché ciò limiterebbe lo spazio per i movimenti respiratori e aggiungere stress indesiderati l'animale. Dopo aver fissato le impostazioni della colonna vertebrale sul dispositivo di simulazione computerizzato vengono controllati. Usiamo tipicamente punta d'urto di 3,0 mm alla speed di 4 cm / s con una profondità di 2 mm ed un tempo di permanenza di 0,3 sec. Estendere la punta del pendolo e abbassarlo fino a che raggiunge la superficie del cavo. Ritrarre la punta e abbassare il dispositivo di due millimetri verso la superficie del midollo spinale. Rilasciare pistone dopo 4 cm / sec a causare gravi lesioni del midollo spinale contusione. Raggiungere emostasi utilizzando solo una pressione sufficiente a mantenere l'applicatore cotone-tip a posto, facendo attenzione a non creare alcuna pressione eccessiva sul cavo. Sutura muscolare e strati fascia con una figura-8 punti facendo attenzione a non tirare il troppo stretto con suture assorbibili. Chiudere la pelle con un minimo di 2 piccoli punti metallici, fino a 4 o 5 punti metallici possono essere utilizzati se le parti della incisione rimangono aperti dopo le prime 2 o 3 punti.
3. -Procedura di cure post
Luogo topi in un ambiente caldo di circa 33-35 ° C per 24 ore dopo l'intervento. Ciò comporta un incubatore (mentre sono inconsci) e uno spazio gabbia riscaldata una volta che iniziano a muoversi. Una volta che i ratti sono completamente awake, somministrare 5 ml di soluzione fisiologica, 1,5 ml (0.006 mg / ml) di buprinorphine, e 0,1 ml di Baytril tutti per via sottocutanea. Continuare con buprinorphine per via sottocutanea due volte al giorno per le prime 24-48 ore e Baytril una volta al giorno per 7 giorni. Vesciche dovrebbero essere espressi manualmente tre volte al giorno fino al ritorno della funzione vescicale (<2 ml di urina in espressione di mattina presto per 3 giorni consecutivi). Gli animali devono essere controllati in questo periodo per l'infezione (sangue nelle urine, di colore biancastro, o cattivo odore), ridotta attività fisica o di problemi con la guarigione della ferita. Presenza di infezione deve essere contrastata con un aumento del dosaggio (o ri-avvio) di antibiotici, in consultazione con i veterinari locali. Pesare i ratti cominciano quotidiano il giorno dopo l'intervento per valutare il loro recupero.
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Representative Results
Lesione del volume
Abbiamo ottenuto grandi volumi e coerente lesioni mediante seguendo la tecnica descritta sopra. Utilizzando un Luxol veloce colorazione blu un volume delle lesioni media di 2,04 mm 3 (95% CI 1,9-2,18) (n = 5 animali) è stato ottenuto. Figura 2 mostra significa volume della lesione con una colorazione rappresentante utilizzando Luxol blu veloce attraverso l'epicentro della lesione.
Funzionali punteggi
I punteggi comportamentali come misurato dal Bresnahan (BBB) scala Basso, Beattie, sono mostrati in Figura 3. A 12 settimane i topi del gruppo di controllo hanno ottenuto un punteggio medio di 2,2 ± BBB 1,1 (n = 10 animali).
Altri parametri
Sulla base della nostra esperienza più recente con 32 interventi chirurgici sugli animali il tasso di sopravvivenza di questa tecnica è il 93,4%. Tutti i decessi sono stati collegati con persistente infezione del tratto urinario (UTI) seguito dal sacrificio di animali per evitare eccessivo dolore e la sofferenza. Dopo aver terminato il ciclo di antibiotici per 7 giorni 16,7% animali hanno sviluppato UTI. Il numero medio di giorni per il rilevamento di UTI post-operatorio è stato del 14,6 ± 7,6 giorni. È interessante notare che gli animali raggiungono il controllo della vescica in media 13 giorni dopo la lesione (media 13,33 ± 3,6 giorni). I ratti che hanno sviluppato UTI hanno preso più tempo per raggiungere il controllo della vescica rispetto ai topi senza UTI (controllo della vescica nei ratti con IVU - 16 ± 1 giorni contro 12,8 ± 3,7 giorni per il controllo della vescica nei ratti senza UTI, p = 0.03). Nella coorte che ha raggiunto il controllo della vescica nei 14 giorni successivi UTI non è stato rilevato. Come mostrato in figura 4, vi è stato un guadagno iniziale in peso dopo SCI probabile da ritenzione di liquidi. Il peso successivamente abbassata e stabilizzata ad un livello inferiore (circa il 10-12% inferiore rispetto al basale) in circa 10 giorni.
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Figura 1. Anatomia vertebrale del ratto dal approccio posteriore (sinistra) dimostrando i processi spinosi e lamine. La posizione del legamento giallo (LF) è raffigurata nello spazio tra le lamine. Mid-sezione sagittale (a destra) che mostra la posizione relativa del legamento giallo e il legamento interspinoso in relazione al midollo spinale.
Figura 2. Grafico a barre che mostra il volume delle lesioni (in mm 3, asse Y) in animali trattati con gravi lesioni del midollo spinale (a sinistra). Una sezione longitudinale rappresentativo attraverso epicentro infortunio dopo Luxol veloce colorazione blu (a destra).
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Figura 3. BBB (asse Y) punteggio di ratti nel corso dei tre mesi di follow-up (asse X) dimostrando minimo recupero tipico di grave SCI significare.
Figura 4. Schema di linea che mostra variazioni di peso al giorno (in g, asse Y) su ratti oltre due settimane la durata (asse X) dopo l'induzione di lesioni del midollo spinale.
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Discussion
Diversi nuovi trattamenti hanno recentemente mostrato risultati promettenti inizi nel campo della ricerca sulle lesioni spinali. 3 valutazione attenta di questi trattamenti è indispensabile clinicamente rilevante modello di SCI per selezionare le strategie con il massimo potenziale traslazionale. Uno schema di classificazione è stato recentemente sviluppato per valutare la forza di studi preclinici. 9 Questo schema ha sottolineato l'importanza di utilizzare modello contusione grave SCI. Qui si descrive un modello di grave contusione SCI con volumi consistenti lesioni e punteggi funzionali simili a quelle dei modelli transection. Questo modello può essere utilizzato come un 'proof of concept' per stabilire l'efficacia del trattamento sia per la neuroprotezione e strategie neuroregeneration.
La generazione di uniforme contusivo SCI rimane impegnativo. Per la riproducibilità, è essenziale che il pregiudizio essere eseguita nel modo più uniforme possibile. Il livello mirata del midollo spinale deve essere identificato in modo coerente from animale ad animale. Rimozione dell'osso durante laminectomia deve essere fatto con attenzione per garantire che non frammenti ossei sono lasciati nel canale spinale, questi potrebbero causare lesioni di compressione e di introdurre variazioni indesiderate nei meccanismi di lesione e le potenzialità di recupero. Abbiamo adottato diverse misure per garantire l'uniformità tra cui le dimensioni del dispositivo di simulazione, la stabilizzazione della colonna vertebrale rigida su un telaio con montati bracci stabilizzatori, con una velocità d'impatto uniforme e la profondità di compressione. E 'importante che il ratto essere posizionata comodamente quando le pinze stabilizzanti vengono serrati ai corpi vertebrali. Eventuali variazioni di allineamento spinale o stress eccesso durante il serraggio possono alterare la biomeccanica impatto. Abbiamo utilizzato un dispositivo di simulazione 2,5 mm poiché la dimensione media di ratto midollo spinale nella nostra regione di interesse è 2,5-3 mm. Il tempo di contatto o di sosta è stato fissato in maniera uniforme a 0,3 sec nei nostri esperimenti. Tuttavia nella nostra osservazione e segnalazioni di altri laboratori, per un modello di grave SCI la profondità di impatto è la più importanteparametro. Negli esperimenti descritti in questo documento l'impatto è stato consegnato ad una profondità costante di 2 mm. Altri fattori che influenzano l'uniformità comprendono la formazione del personale, chiara visualizzazione del tessuto, e la punta di simulazione di garantire un impatto diretto nel tessuto del midollo (e non le strutture ossee).
I ratti devono essere costantemente osservati durante la procedura per le necessarie funzioni vitali, soprattutto, temperatura al cuore e la respirazione. L'ipotermia è la principale causa di mortalità durante e immediatamente dopo la somministrazione dell'anestesia. Monitoraggio della temperatura interna con sonda rettale e adeguati rilievi di riscaldamento sarà evitare questa complicazione. Se la respirazione diventa irregolare o l'animale cessa di respirare, la procedura dovrà essere immediatamente interrotta fino a quando la respirazione ritorna allo stato iniziale. Dolore eccessivo e involontario o sovradosaggio di dolore e di anestetico farmaci possono anche causare problemi respiratori. I ratti devono essere attentamente monitorati post-procedura. Il loro wotto devono essere misurate con precisione e una perdita di> 20% dal peso di base richiede un'indagine in cibo e acqua di aspirazione, infezione delle vie urinarie, lesioni cutanee, post-SCI ileo, ecc consultazione preventiva con il personale veterinario per la valutazione e il trattamento è fondamentale in tali situazioni. Come discusso in precedenza, i topi che non hanno ripreso il controllo della vescica dal giorno 14 deve essere iniziato di nuovo in antibiotici per evitare una potenzialmente mortale infezione del tratto urinario.
Lesioni del midollo spinale può essere indotta sia da un metodo di spostamento o metodo forza costante. 5,12 La tecnica descritta in questo documento è metodo dislocamento cui forza è consegnato a profondità fissa all'interno del tessuto del midollo spinale. L'uso di un urto computer controllato permette un livello di controllo che non è ottenibile con altri metodi comuni di sperimentale SCI. La tecnica di compressione clip non consentire un ottuso, forza contusivo con rilascio immediato, mentre l'impatto NYUo dipende dalla gravità per determinare la forza di contusione. Queste tecniche, anche se riproducibile, non consentono la simulazione di condizioni incontrate durante un incidente automobilistico, la causa più comune di SCI acuto nell'uomo. Studi precedenti hanno dimostrato che la gravità delle lesioni è direttamente correlata con la profondità di impatto rispetto alla velocità di impatto. 7 Perciò questo modello permette una grave SCI da eseguire regolarmente con il potenziale di modificare la gravità attraverso una più ampia gamma di combinazioni di forza e spostamento .
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Disclosures
Informativa finanziaria nessuno
Finanziamento divulgazione nessuno.
Acknowledgments
Gli autori sono grati al Dr. N. Banik e Dr. D. Mitchell per la loro guida nello sviluppo di questo modello.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Computer controlled impactor | Leica or the Infinite Horizons (formerly OSU) impactor | ||
| Surgical instruments | |||
| Scissors | Fine Science Tools Inc | 14094-11 or 14060-09 | |
| Forceps | Fine Science Tools Inc | 11006-12 and 11027-12 or 11506-12 | |
| Hemostats | Fine Science Tools Inc | 13009-12 | |
| Retractors | Fine Science Tools Inc | 17011-10 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools Inc | 16020-14 | |
| Needle driver | Fine Science Tools Inc | 12001-13 | |
| Stereotactic frame | Leica or RWD Life Science Co. or TSE systems | ||
| Buprinorphine | |||
| Baytril | Bayer | ||
| Ketamine | |||
References
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