La production de disulfure stabilisées complexes peptide transmembranaire pour des études structurales

Summary

Les études biophysiques et biochimiques des interactions entre les domaines de la protéine membranaire embarqués face à de nombreux défis techniques, dont le premier est l'obtention de matériel d'étude approprié. Cet article décrit un protocole de production et de purification du disulfure stabilisées complexes peptide transmembranaire qui sont appropriés pour l'analyse structurale par une solution de résonance magnétique nucléaire (RMN) et d'autres applications analytiques.

Abstract

Interactions physiques entre les lipides incorporés hélice alpha domaines de protéines membranaires jouent un rôle crucial dans le repliement et l'assemblage des complexes protéiques membranaires et dans des processus dynamiques tels que transmembranaire (TM) de signalisation et de régulation de la teneur en protéines de la surface cellulaire. Comprendre les caractéristiques structurelles de conduite de l'association des séquences particulières nécessite des analyses sophistiquées biophysiques et biochimiques de complexes peptidiques TM. Cependant, l'hydrophobie extrême de domaines TM rend très difficile à manipuler à l'aide des techniques standard de chimie des peptides, et la production de matériel d'étude approprié s'avère souvent prohibitif difficile. Identifier les conditions dans lesquelles les peptides peuvent adopter des conformations hélicoïdales stables et forment des complexes ajoute spontanément un autre niveau de difficulté. Nous présentons ici un procédé pour la production d'homo-ou hétéro-dimères complexes peptidiques TM à partir de matériaux qui sont exprimées dans E. coli, ce qui permet l'incorporation de marqueurs isotopiques stables pour la résonance magnétique nucléaire (RMN) ou non-naturelles des acides aminés pour d'autres applications relativement peu de frais. La principale innovation de cette méthode est que les complexes de MC sont produites et purifiées comme covalente disulfure associés (réticulé) qui peuvent former des assemblages de structures stables, stoechiométrique et homogène après reconstitution dans un détergent, lipides ou d'autres matériaux de membrane-mimétiques. Nous présentons également des procédures soigneusement optimisés pour l'expression et la purification qui sont également applicables si la production de simples domaines TM ou complexes réticulés et donner des conseils pour adapter ces méthodes à de nouvelles séquences TM.

Introduction

Ce protocole détaille une procédure que nous avons développé pour produire des complexes disulfure stabilisées transmembranaire (TM) de peptides destinés à des études structurales par RMN solution. La procédure prend avantage de l'expression robuste offerte par le système ΔtrpLE1413 fusion (voir ci-dessous) et permet des complexes peptidiques TM de composition définie pour être générés en utilisant des techniques sophistiquées d'étiquetage des isotopes stables pour les modernes des expériences de RMN multidimensionnelles. Nous avons utilisé ces techniques pour déterminer les structures RMN plusieurs qui ont révélé de nouveaux renseignements importants sur la façon d'activation des lymphocytes immunorécepteurs sont assemblées à partir de plusieurs sous-unités de protéines membranaires par des interactions entre leurs domaines TM (récemment revu à ^1). Ces techniques sont applicables à de nombreux autres systèmes de protéines membranaires, ainsi que toute une gamme de méthodes analytiques en aval, en plus de RMN en solution. Bien que l'exemple donné ici utilise des résidus cystéine nativespour créer un complexe qui imite la nature liaisons disulfure des protéines, le design est aussi bien adapté pour la création de ponts disulfures d'ingénierie pour stabiliser des complexes qui sont normalement maintenues ensemble par des faibles, des interactions non covalentes comme homo-et hétéro-dimères complexes de MC Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-protéines de la famille ou des hétérodimères αβ ^04.02 complexes intégrines ^5,6.

Extrêmement séquences peptidiques hydrophobes tels que ceux issus de la bicouche lipidique, couvrant des portions de protéines TM sont des sujets extrêmement difficiles pour les études biochimiques et biophysiques. En plus d'être très difficile à manipuler à l'aide de protéines standard et des techniques de chimie des peptides, ils sont souvent très toxiques pour les cellules et sont donc difficiles à produire par recombinaison. Nous et les autres ^{7,8 9-11} ont connu un succès important en exprimant ces séquences peptidiques difficiles chez les bactéries que dans le même cadre carboxy-terminalefusions avec une version modifiée de la séquence dérivée de la ΔtrpLE1413 E. coli opéron trp ^12. Le polypeptide ~ 13 kDa trpLE codée par cette séquence peut être produite à des niveaux élevés en vertu d'un promoteur T7 et est entièrement localisée à corps d'inclusion où les problèmes liés à la toxicité et / ou d'instabilité sont contournées. Modification de la séquence par l'addition d'un amino-terminale 9-histidine étiquette ¹³ et l'élimination des résidus internes de méthionine et de cystéine de la séquence trpLE ¹⁴ souhaités trpLE-peptide fusions d'être purifiés par des ions métalliques et la chromatographie d'affinité digéré à l'aide de bromure de cyanogène (CNBr ) pour libérer la séquence peptidique désirée. Nous avons utilisé avec succès ce système pour exprimer plus d'une douzaine de séquences différentes sous forme de fusions trpLE représentant des fragments de protéines membranaires qui contiennent moins de quatre domaines TM ^(7,8 et résultats non publiés; voir également la section Discussion).

Lainnovation majeure dans ce protocole est l'identification des conditions dans lesquelles les non-structurées et très peu soluble trpLE-TM fusions peuvent être efficacement disulfure réticulé dans le contexte d'un flux de travail optimisé. Plusieurs aspects de l'expression à haut rendement, la manipulation et la purification des produits peptidiques ont également été soigneusement optimisé, ainsi que les recommandations présentées ici sont tout aussi pertinentes pour la production de disulfure non-réticulés (monomère) produits peptidiques TM.

Protocol

1. Le clonage et la conception Construct

Cloner les séquences d'intérêt dans le vecteur PMM-peptide (qui peut être fourni sur demande) en utilisant HindIII et sites de restriction BamHI (voir Figure 1). L'insert d'ADN double-brin doit intégrer, dans l'ordre suivant: un site HindIII; un seul codon méthionine pour le clivage par CNBr; l'E. coli codon optimisé séquence codant pour un peptide, un codon d'arrêt, un site BamHI. Tous les autres méthionines dans le peptide doit être éliminée et la séquence dipeptide Asp-Pro doit être évitée car elle sera également clivé dans des conditions acides.

Un résidu de cystéine unique doit être introduit dans chaque séquence peptidique selon le positionnement souhaité de la réticulation disulfure dans le complexe final, et tous les autres cystéines doit être muté en sérine. Le plasmide porte une cassette de résistance à la kanamycine pour la sélection.

2. Expression de trpLE-PeptiFusion de

1. Assurez-vous et stérile milieu filtrant M9/Kan une croissance minime (0,1 mM CaCl _{2, 2} mM MgSO _4, 3 g / L KH ₂ PO _4, 7,5 g / L de Na ₂ HPO ₄ · 2H ₂ O, 0,5 g / L de NaCl, 1 g / L de NH ₄ Cl, 4 g / L de glucose, 50 mg / l de sulfate de kanamycine). Supplément avec Centrum complet de A à Zinc de fournir des vitamines B et d'oligoéléments:. Dissoudre 1 comprimé dans 40 ml H ₂ O avec le mélange pendant 30 min, centrifuger pour éliminer la matière insoluble et stérile filtre le surnageant d'orange Solution mère Conserver à 4 ° C dans l'obscurité pendant 2 semaines et utiliser 4 ml / L dans M9.
   NOTE: ¹⁵ N-NH ₄ Cl enrichi, ¹³ C-enrichie glucose ou d'autres précurseurs des isotopes stables marqués peuvent être inclus dans un milieu M9 à ce stade si vous le souhaitez.
2. Inoculer une culture de 100 ml démarreur fraîchement transformé E. BL21 (DE3) souche coli dans un milieu M9/Kan. Développer une nuit à 37 ° C sous agitation à 200 rpm.
3. Le lendemain matin, cochez la DO ₆₀₀ de la culture de départ - ce qui devrait être de l'ordre de 2 ou plus. Diluer la culture de 100 ml de démarrage dans 1 litres total de Centrum supplémenté en milieu M9. Divisé en deux 2 flacons à chicanes L (500 ml de culture dans chaque flacon) et de croître à 37 ° C sous agitation à 140 tours par minute jusqu'à ce que la DO ₆₀₀ atteigne 0,6.
4. Réglez la température agitateur à 18 ° C et continuer agitation pendant 1 h, ce qui permet aux cultures de se refroidir complètement avant l'induction.
5. Prélever un échantillon de pré-induction pour analyse SDS-PAGE (équivalent de 50 ul d'une culture à une DO ₆₀₀ = 1), puis ajouter IPTG à une concentration de 0,1 mM final pour induire l'expression de la fusion trpLE-peptide. Continuer à croître à 18 ° C/140 rpm nuit (16-20 heures) sous induction IPTG.

3. Préparation corps d'inclusion et reliure matrice de nickel

1. La finale DO ₆₀₀ de cultures d'expression au jour le jour dans un milieu minimal est variable et should se situer entre 2,5 et 5,0. Prélever un échantillon pour analyse SDS-PAGE (équivalent de 50 ul d'une culture à une DO ₆₀₀ = 1) et prélever des cellules par centrifugation pendant 20 min à 5000 x g.
2. Resuspendre culot cellulaire de 1 L de culture dans 50 ml de tampon de lyse (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM de β-ME, 0,2 M de NaCl). Les suspensions cellulaires peuvent être conservés congelés pour un traitement ultérieur.
3. Lyser les cellules par sonication sur glace à la puissance maximale pendant 1 min et reste sur la glace pendant 5 min. Nous utilisons un Sonicator Misonix 3000 (max de sortie 600 watts) à panne ½ pouces haute intensité remplaçable. Répétez sonication / refroidissement pour les trois cycles.
4. Recueillir des corps d'inclusion insolubles (IB) matériau par centrifugation pendant 15 minutes à 20.000 xg et jeter le surnageant. Un lâche, mince couche de débris cellulaires de couleur claire peut être visible sur le dessus de la pastille dense IB, ce qui peut être emportée avec de l'eau ou un tampon en agitant doucement. Étapes 3.3 et 3.4 peut être répété pour améliorer la pureté de la fraction IB si desirouge. Des échantillons de granulés et de matériel surnageant doit être pris pour analyse SDS-PAGE pour confirmer la localisation de fusion trpLE-TM de corps d'inclusion.
5. Dissoudre IB pellets en solution de guanidine (6 M guanidine-HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1% de Triton X-100, 5 mM β-ME), en utilisant 25-50 ml par litre de culture traitée. Cette étape nécessitera plusieurs heures avec agitation occasionnelle et sonication douce.
6. Effacer le lysat par centrifugation IB pendant 1 heure à 75,000-100,000 xg et 20 ° C. Décanter le surnageant et filtrer à travers une membrane de 0,2 um.
7. Combiner le lysat effacé IB, dans un tube de 50 ml conique ou un plus grand récipient pouvant être fermé solidement, avec de la résine d'affinité au nickel qui a été lavé avec de l'eau et on équilibre à une solution de guanidine. Utiliser 3-4 ml de résine réglé par litre de culture traitée pour des fusions qui expriment à un degré similaire à celle trpLE-DAP12TM montré ici (figure 3, ligne 2). Bind lots, en incubant nuit à t salle empérature en mélangeant doucement.

4. La réticulation oxydative sur colonne

1. Chargez la suspension de résine IB lysat / nickel dans une colonne à écoulement par gravité vide avec support de lit poreux, ajoutant en continu jusqu'à ce que la totalité du volume traverse. Recueillir et mettre de côté le flux continu, qui peut encore contenir des protéines de fusion non lié.
2. Laver la résine de nickel par écoulement gravitaire avec 5 volumes de lit de solution d'urée (8 M d'urée, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl) contenant 5 mM de β-ME.
3. Laver la résine de nickel à nouveau avec 5 volumes de lit de solution d'urée sans β-ME.
4. Laver la résine de nickel pour la troisième fois avec 5 volumes de lit de solution d'urée qui a été complétée par 20 uM CuSO ₄ et 2 mM de glutathion oxydé. Après ce lavage, fermer la sortie de la colonne et incuber 30 minutes à température ambiante pour permettre la formation de pont disulfure maximale.

5. Élution TFA et quantification

contenu "> ATTENTION: L'acide trifluoroacétique (TFA) provoque de graves brûlures au contact avec la peau et les vapeurs sont extrêmement irritantes concentré TFA doit être utilisé que dans une hotte chimique approuvé fumées avec des lunettes de protection et des gants sans latex Vérifier la compatibilité chimique de tous.. les matériaux utilisés, le polypropylène est compatible avec toutes les étapes de ce protocole.

1. Laver la solution d'urée oxydant avec 10 volumes de lit d'eau et sécher le lit de la colonne en appliquant une ligne vide à la sortie de la colonne.
2. Fermez la sortie de la colonne et ajoutez 1,5 volumes de lit de neat (99-100%) TFA. Mélanger la résine de nickel avec une petite spatule à assurer une exposition à l'acide et incuber pendant 5 min. Ouvrir la sortie de la colonne et recueillir l'éluat acide, sous pression lentement avec une seringue ou d'air comprimé si nécessaire pour faire sortir tout le liquide.
3. Répéter l'étape d'élution acide avec encore 1,5 volumes de lit de TFA pur. Travailler rapidement à cette étape pour éviter la dissolution totale de l'Beaded matrice d'agarose. Production de protéine peut être déterminée à ce stade, selon l'équation de Beer-Lambert et le coefficient d'extinction molaire théorique de la séquence trpLE-peptide. Diluer un échantillon de l'éluat TFA (1:20 à 1:50) dans le trifluoroéthanol (TFE) et de mesurer l'absorbance à 280 nm, en utilisant un mélange TFA / TFE à la même dilution en blanc.

6. La digestion par CNBr

ATTENTION: Le bromure de cyanogène (CNBr) est extrêmement toxique et doit être manipulé que sous une hotte chimique approuvé fumées. PPE, y compris des lunettes de sécurité, blouse de laboratoire et gants sans latex sont absolument nécessaires. CNBr est réactif à l'humidité et doit être amené à température ambiante avant ouverture. Communiquez avec votre bureau de la sécurité institutionnelle pour obtenir des instructions sur la neutralisation / élimination des CNBr contaminés par des solutions et des matériaux.

1. Diluer l'éluat acide à la concentration de TFA 80% final par addition goutte à goutte de l'eau tout en mélangeant délicatement. Si un précipité se forme, unjj revenir un petit volume (0,5 à 1 ml) de TFA pur jusqu'à ce que la solution devienne limpide, puis re-bonne à 80% avec de l'eau. Prenez un 5 pl pré-digérer l'échantillon pour analyse SDS-PAGE, le gel dans de l'azote liquide et lyophilisation de l'échantillon immédiatement.
2. Ajouter cristaux CNBr à environ 0,2 g / ml, en prenant soin de peser le produit chimique toxique en toute sécurité dans des lieux fermés, pré-pesés tubes ou à l'aide d'un équilibre intérieur de la hotte pour vapeur chimique. Mélanger doucement jusqu'à dissolution complète. Rincer et sceller le récipient de réaction sous gaz inerte (azote ou argon flux) et incuber 3-4 heures à la température ambiante, à l'abri de la lumière.
3. Prenez un 5 pl post-digestion de l'échantillon pour analyse SDS-PAGE et de geler immédiatement et lyophiliser. Transférer la réaction de digestion à une cassette de dialyse en cellulose régénérée ou le tube (acétate de cellulose se dissout dans l'acide concentré) avec un seuil de coupure de poids moléculaire de 3,5 kDa ou moins, en fonction de la taille du complexe peptide attendu. Dialyser pendant une nuit à 4 litres d'eau dans lehotte pour réduire la concentration de TFA et décomposer toute CNBr n'ayant pas réagi. Laissez de la place dans la cassette de dialyse ou le tube pour une augmentation significative du volume (autant que de deux à trois fois) pendant la dialyse pendant la nuit.
4. Retirer la solution de réaction dialysée avec précipité en suspension à partir de la cassette de dialyse ou un tube (plus de la protéine va précipiter lorsque la concentration de TFA est réduite) et transférer la suspension de tubes de 50 ml coniques. Geler et lyophiliser pour éliminer l'eau et des traces de CNBr / TFA. Cette étape est susceptible de nécessiter plusieurs jours.
   ATTENTION: Tant la réaction de dialyse digest et l'eau de dialyse devraient continuer à être traité comme toxiques et manipulés / éliminés avec les précautions qui s'imposent.
5. Des échantillons de cultures de stades pré-induction et de récolte, de corps d'inclusion surnageant et le culot, éluat TFA et CNBr digéré matériau peut être analysé par SDS-PAGE. Préparer des échantillons par chauffage à 95 ° C dans Invitrogen NuPAGE sampl LDSe tampon. Éluat TFA et digérer des échantillons doivent être préparés dans des conditions réductrices et à la fois non réductrice afin de faciliter l'identification des produits et l'évaluation de réticulation oxydative.
6. Séparez les échantillons sur un 12% NuPAGE bis-tris gel d'acrylamide préfabriqué en utilisant MES-tampon SDS courir pour une résolution optimale des produits plus petits digérer.

7. En phase inverse Purification HPLC de disulfure réticulés complexes peptidiques

1. Dissoudre jusqu'à 100 mg de produits lyophilisés digérer dans 2-3 ml d'acide formique pur et la charge sur une échelle préparative (21,2 x 150 mm) Agilent ZORBAX SB-300 C3 PrepHT colonne dans le solvant A (typiquement 10-20% d'acétonitrile ou 5 -10% d'isopropanol dans de l'eau avec 0,1% de TFA).
2. Éluer les produits de digestion dans un gradient de solvant B (acétonitrile ou de l'isopropanol avec 0,1% de TFA) pendant au moins 5 volumes de colonne. Voir la discussion des suggestions sur le choix des conditions optimales pour gradient séquences peptidiques différentes.
3. Prendre50-100 échantillons ul de chaque fraction HPLC pour analyse SDS-PAGE et congeler et lyophiliser immédiatement. L'élimination des solvants HPLC est rapide et devrait être achevée en 1-2 heures.
4. Préparer des échantillons lyophilisés pour HPLC SDS-PAGE en chauffant à 95 ° C dans un tampon d'échantillon NuPAGE Invitrogen LDS sans agent réducteur. Laisser refroidir et diviser chaque échantillon de façon égale dans 2 tubes à centrifuger, ajouter 100 mM de DTT à l'un d'eux et le réchauffage brièvement.
5. Séparer les échantillons réduits et non réduits HPLC sur un 12% de bis-tris NuPAGE gel d'acrylamide préfabriqué avec MES-SDS exécutant tampon que ci-dessus. Les petits peptides hydrophobes souvent ne prennent pas de Coomassie tache bien et peut ne pas fonctionner à leurs poids moléculaires attendus. Cependant, la comparaison des échantillons réduits et non réduits devrait faciliter l'identification des produits peptidiques réticulés et l'évaluation de la pureté.
6. Analyser les candidats peptide fractions contenant par laser assistée par matrice ionisation par désorption temps de vol (MALDI-AF) spectrométrie de masse (voir la discussion) afin d'identifier les espèces d'intérêt et de confirmer sa masse attendue.
7. Mélanger, geler et lyophiliser les fractions HPLC contenant le pur, réticulé TM peptide complexes et prennent du poids sec du produit final pour déterminer le rendement. Fractions ayant un contenu élevé isopropanol ne peut pas rester congelés. Si fractions peptidiques sécher vers le bas pour un film plutôt qu'un produit lyophilisé moelleux, re-dissoudre complètement le film dans un petit volume de pure hexafluoroisopropanol (HFIP), congeler et lyophiliser nouveau. Le produit HFIP traité devrait être un petit cône blanc qui est facilement renversée et pesés.

Representative Results

Le niveau d'expression atteint des fusions trpLE est variable et dépend fortement de la séquence d'acides aminés du peptide ci-joint. Figure 3 montre l'analyse par SDS-PAGE de pré-induction (piste 1) et l'heure de la récolte (piste 2) échantillons provenant d'une culture qui a produit environ 120 mg de pur, intact trpLE-DAP12TM de fusion de 1 litre de culture et de 4 ml matrice de nickel. Tous de la fusion trpLE-DAP12TM a été localisé le corps d'inclusion de pellets (piste 4), par opposition à surnageant (piste 3).

Environ 70% du nickel purifié trpLE-DAP12TM fusion était disulfure réticulé à la forme dimère (Figure 3, lignes 5 et 6: échantillons non réduits et une réduction de l'éluat TFA). Il s'agit d'un résultat typique pour la fusion trpLE-DAP12TM, mais l'efficacité de réticulation variera en fonction du placement des cystéines ingénierie. Les produits peptidiques DAP12TM ne sont pas facilement identifiables dans le total des échantillons à digérer CNBr (lignes 7 et 8),Mais la comparaison de la fusion intacte et les bandes de fragments trpLE dans l'échantillon réduit de digestion (piste 8) indique que la digestion de la fusion était d'environ 60%.

La figure 4 montre la séparation des produits de digestion par HPLC en phase inverse en utilisant une colonne préparative échelle C3 (capacité totale de fixation ~ 200 mg de protéine). Parce que la teneur en aromatiques de la fusion est faible, nous surveillent habituellement l'absorbance à 214 nm plutôt que 280 nm. Pour cette course de 90 mg d'oxyde, CNBr digéré trpLE-DAP12TM de fusion a été dissous dans 3 ml d'acide formique pur et chargé sur la colonne dans 100% de solvant A (60% H ₂ O, 40% d'acétonitrile, TFA à 0,1%). Produits liés ont été élues dans un gradient à deux étages de 0-60% suivie par 60-90% de solvant B (75% d'isopropanol, de l'acétonitrile 25%, TFA 0,1%) à un débit de 10 ml / min. Les principaux produits contenus dans chaque fraction selon l'une analyse SDS-PAGE (figure 5) sont indiquées ci-dessus le chromatogramme en utilisant le code assigned à la figure 2. Voir Optimisation du gradient d'élution HPLC dans la section Discussion pour plus de détails sur l'optimisation des conditions de gradient de séquences peptidiques différentes.

Produits peptidiques sont facilement identifiables dans la SDS-PAGE (Figure 5) et MALDI-TOF (Figure 6) analyse des fractions HPLC majeurs. Peptides DAP12TM et, dans notre expérience, de nombreux autres peptides hydrophobes TM, courir avec les taux de migration significativement réduits par rapport à leurs poids moléculaires attendus (3366 Dalton monomère et dimère 6730 Dalton pour les ¹⁵ N-labellisés espèces présentées ici). Ce comportement est directement liée à la quantité de peptide chargé sur le gel et les résultats dans un continuum de poids moléculaires apparents que le montant chargé est varié (données non présentées). Cependant, l'altération de la mobilité électrophorétique de pic 5 sur la réduction de 100 mM de DTT (comparer les pistes 7 et 8) identifie ce que le peptide réticuléproduit. MALDI-TOF MS confirme l'identité du peptide dimérique avec le pic majeur à 6729,2 daltons et ne révèle pas d'autres produits majeurs (Figure 6). Le rendement final du disulfure de pur réticulé homodimère DAP12TM peptide de cette préparation était de 7,5 mg par litre de culture.

Figure 1. Séquence d'ADN de la région trpLE-DAP12TM codage avec sa traduction en acides aminés. Régions clés de la séquence polypeptidique sont mis en évidence et un code de couleur des étiquettes vers la droite. Les internes uniques méthionine (Met) et la cystéine (Cys) pour le bromure de cyanogène (CNBr) clivage oxydatif et la réticulation sont mis en évidence dans le cyan et le violet, respectivement. HindIII et sites de restriction BamHI (en gras et souligné) sont uniques dans le plasmide et may être utilisée pour remplacer la séquence peptidique TM avec une autre séquence d'intérêt.

Figure 2. Schéma de la procédure. Les principales étapes du protocole sont indiqués sur les étiquettes de texte. Les principaux segments de la fusion trpLE-DAP12TM sont codés par couleur comme dans la figure 1. Les principaux produits polypeptidiques de la réticulation et les étapes de digestion sont étiquetés AF et sont listés ici, avec leur description et attendus poids moléculaires ⁽¹⁵ N-libellées): [A] trpLE fragment: 13.769 Daltons; [B] intacte trpLE-DAP12TM fusion: 17.118 Daltons [C] intacte trpLE-DAP12TM fusion dimère: 34.233 Daltons; [D] seul-fendues trpLE-DAP12TM fusion dimère: 20.482 Daltons; [E] monomère DAP12TM peptide: 3366 Daltons; [F] dimère DAP12TM peptide: 6730 Daltons. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3. Analyse SDS-PAGE des étapes expression, la purification, réticulation et digérer trpLE-DAP12TM échantillons Culture (piste 1, pré-induction, étape 2.5; piste 2, la récolte, l'étape 3.1). Corps d'inclusion et d'échantillons de préparation (piste 3, surnageant; voie 4, pastille; étape 3.4) ont été réduites de 100 mM de DTT. TFA éluat de la colonne de nickel (voies 5 et 6; étape 6.1) et post-CNBr échantillon (pistes 7 et 8; étape 6.3) ont été exécutés non réduit (NR) et réduite avec 100 mM de DTT (R) comme indiqué pour confirmer la disulfure de produits réticulés. * Produit de peptide monomérique et dimériques E et F sont mal visualisés par coloration au bleu de Coomassie et par conséquent ne sont pas détectables sur ce gel.

Figure 4. En phase inverse purification par HPLC du dimère du disulfure réticulé DAP12TM. Oxydé, CNBr digéré et lyophilisé produits de fusion trpLE-DAP12TM (90 mg) ont été dissous dans 3 ml d'acide formique (100%) et chargé sur un Agilent ZORBAX SB-300 PrepHT C3 (21,2 x 150 mm) colonne dans le solvant A (60% H ₂ O, 40% d'acétonitrile, 0,1% de TFA). Un gradient en deux étapes de 0-60%, suivie de 60-90% de solvant B (75% d'isopropanol, l'acétonitrile 25%, TFA à 0,1%) a été effectué à un débit de 10 ml / min pour éluer les produits assortis. Les fractions recueillies dans le flux continu (FT) et comporte quatre pics principaux sont indiqués ci-dessus la trace d'absorbance 214 nm (UA: non arbitraireson) et les principaux produits contenus dans chaque fraction sont indiquées par les codes affectés à la figure 2. Le pic souhaité DAP12TM produit réticulé est à l'ombre.

Figure 5. Analyse SDS-PAGE des produits HPLC en phase inversée. Accréditives (FT) et le pic des échantillons de 1 ont été exécutés non réduite. Échantillons Peak 2, 3 et 4 ont été effectués à la fois non réduit (NR) et réduite par un traitement avec 100 mM de DTT (R) afin de vérifier l'identité des produits réticulés disulfure. Les produits principaux dans chaque fraction (avec leurs codes attribués à la figure 2) sont [FT, PK1]: Un fragment, trpLE; [Pk2]: B, intact trpLE-DAP12TM fusion monomère et C, dimère de fusion intacte; [Pk3]: D, seule-fendues trpLE-DAP12TM dimère et E, DAP12TM monomère peptidique; [PK4]: F, disulfure dimère réticulé DAP12TM. * Tel que discuté (voir reults représentant), un décalage dépendant de la concentration de la mobilité rend les produits à faible MW en Pk3 (NR et R) et PK4 (R) semblent être des poids moléculaires différents, même si les deux produits sont peptide monomérique.

Figure 6. D'analyse de masse MALDI-TOF spectrométrie de dimère purifié par HPLC DAP12TM peptide. Un échantillon de la fraction HPLC 4 (1 pi) a été mélangé 1:1 avec une solution saturée d'acide sinapinique (SA) de matrice dans l'acétonitrile et repéré sur le dessus d'une couche mince de matrice séchée SA à partir d'une solution saturée préparée dans l'éthanol. Analyse MALDI-TOF révèle un produit au peptide DAP12TM attendu réticulé dimère de massede 6730 daltons (6729,2098; ¹⁵ N-libellées) ainsi que d'un produit mineur à 3365,7105, très probablement les espèces double-ionisés. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Discussion

Expression de trpLE-TM fusions. D'après notre expérience, trpLE-TM fusions sont mal exprimé dans un milieu de culture riche à 37 ° C, et les conditions de culture décrites ici ont fait leurs preuves pour de nombreuses séquences différentes contenant de une à quatre domaines TM avec des rendements allant 50 à 150 mg / L de pur, de fusion intacte. Fusions encodage de trois ou quatre fragments TM RCPG (CCR5 humain TM1-TM3 et TM4-TM7, respectivement) ou un fragment de noyau catalytique de peptidase du peptide signal humain (TM quatre domaines, voir ref ¹⁵⁾ représentent la plus faible dans cette gamme d'expression niveaux, tout variantes DAP12TM étroitement liés à la séquence utilisée ici représentent le plus haut de la fourchette (données non publiées). La concentration d'IPTG optimale doit être déterminée expérimentalement pour chaque nouvelle séquence. Notre standard est de 0,1 mM et des concentrations plus élevées (jusqu'à 1 mM) entraînent généralement un rendement réduit de façon significative en raison de deux niveaux d'expression plus faibles et faible densité de la culture d'unerécolte t (voir par exemple la figure 1A en référence ^7).

Variations sur le protocole présenté. Le protocole décrites ici décrit la production d'un complexe disulfure réticulé TM peptide, l'homodimère DAP12TM ^8. Alternativement, le protocole est facilement adapté pour produire des peptides monomères en omettant les deux étapes de lavage conçus pour éliminer l'agent réducteur et d'oxyder les produits assortis (4,3 et 4,4). Nous avons déjà utilisé une autre variante de la procédure indiquée ici afin de produire une liaison covalente stabilise TM complexe peptide représentant le trimère DAP12-DAP12-NKG2C TM montage (voir référence ⁸ et les méthodes qui y sont décrites). Dans cette application, un 1-TM-trpLE DAP12 de fusion et une 2-TM-trpLE DAP12-NKG2C de fusion ont été mélangés au stade de la récolte de culture avant la préparation de corps d'inclusion (étape 3.1 à 3.2). La procédure comprenait une étape supplémentaire HPLC pour isoler le hétérodimérique réticulé trpLEproduit de fusion de l'éluat acide (étape 5.3) avant CNBr digest. Purification des produits C3 peptides conduit à la récupération d'un dimère disulfure réticulé DAP12TM dans lequel un brin réalisé le domaine TM NKG2C comme dans la trame de fusion C-terminale. La structure RMN solution de ce complexe dans des micelles de détergent a confirmé que le domaine NKG2C TM assemblé avec DAP12 dans son origine, l'orientation anti-parallèle ^8. Les étapes supplémentaires dans cette variante a réduit significativement le rendement du produit final: une préparation typique a abouti à 8-10 mg de peptide "trimère" d'une fusion de 4L combiné avec un excès de la seconde. Cette variation représente un bon protocole de départ pour les chercheurs désireux de produire disulfure stabilisé complexes contenant deux séquences TM.

Notes sur nickel purification par affinité. L'élution de la protéine à partir de la colonne de nickel séchée avec de l'acide concentré est une procédure inhabituelle et ne se prête pas à nouveau-Utilisation de la matrice de nickel. Les tentatives pour éluer les très hydrophobes trpLE-TM fusions en utilisant l'imidazole ou EDTA donné lieu à une récupération incomplète des protéines et des espèces réticulées ont été préférentiellement retenus sur la colonne (résultats non publiés). La quantité recommandée de matrice de nickel et la nuit par lots liaison de protocole ont été soigneusement optimisé pour saturer la matrice avec trpLE-TM protéines et de réduire ainsi la co-purification des contaminants. Nous avons l'habitude de récupérer des produits très purs avec des rendements qui dépassent largement la capacité annoncée de liaison de l'Sigma SA-Sélect Nickel matrice d'affinité (15-20 mg / ml de résine). L'élution acide élimine également les étapes intermédiaires nécessaires à la transition dans le résumé CNBr, et le rendement accru de produits réticulés fait plus que compenser le coût de la matrice de nickel, en particulier lors de l'étiquetage de coûteux isotopes stables réactifs pour la RMN.

Le bromure de cyanogène conditions digest. Libération de l'fusionnées peptides TM de trpLE dans CNBr est généralement réalisée en utilisant 70% d'acide formique comme solvant parce que le taux de réaction et la solubilité des protéines sont très favorables dans ces conditions. Cependant, les temps de traitement doit être maintenu relativement courte (moins d'1 heure pour digérer) pour éviter d'estérification formyle des résidus sérine et thréonine ^16,17 et j'ai peut-formylation des résidus tryptophane ^18, modifications qui sont détectables par spectrométrie de masse des espèces dont la masse observée est +28 (n) Daltons par rapport à la masse attendue. Notre préférence pour les TFA comme décrit ici permet d'éviter ces modifications tout à fait. Le clivage enzymatique d'une fusion trpLE-TM en utilisant le facteur Xa protease dans 1% de Triton X-100 a été rapporté ^11, mais la faible solubilité de la plupart des trpLE-TM fusions et les complications de l'inaccessibilité site de clivage dans des micelles de détergent probablement limiter l'utilité générale des cette approche.

En phase inverse purification par HPLC de Peptiproduits de la digestion de CNBr est l'étape la plus difficile dans cette procédure et est susceptible d'exiger d'optimisation pour chaque nouvelle trpLE-TM séquence. Les observations suivantes proviennent de la transformation de nombreuses séquences différentes et sont susceptibles de détenir vrai pour la plupart trpLE-TM fusions:

Sélection de phase stationnaire Nous trouvons Agilent ZORBAX Stable-Bond colonnes C3 (300 Å taille des pores; taille des particules 5 um). Comme une phase stationnaire supérieure en termes de sélectivité, pouvoir de résolution et la stabilité sous forte exposition à l'acide concentré. Semi-préparatives (9,4 mm de diamètre) et préparative échelle (21,2 mm de diamètre) tailles sont disponibles et ont très bien performé dans nos mains. C4, diphényle et cyanopropyle phases stationnaires peuvent également fournir des informations utiles sélectivité peptide alternative dans une gamme hydrophobicité similaire par rapport à C3.

Préparation de produits à digérer pour HPLC. Dissolution de produits lyophilisés digérer CNBr en propre pourmicro acide donne les meilleurs résultats pour la séparation HPLC. Préparation dans du TFA ou des solvants organiques tels que l'acétonitrile, le diméthylformamide et le trifluoroéthanol se traduit souvent par une solubilité plus faible, réduire la colonne de liaison et / ou d'élution de produits contenant des pics larges à des espèces multiples. Des précautions doivent être prises pour préparer les produits dans l'acide formique immédiatement avant le chargement colonne car une exposition prolongée peut entraîner une modification des chaînes latérales peptidiques formyle ^16-18 comme indiqué plus haut.

Optimisation de la HPLC gradient d'élution. Nous commençons normalement avec de l'acétonitrile à 10-20% ou 5-10% d'isopropanol dans l'eau avec 0,1% de TFA comme solvant A. trpLE-TM fusions et de leurs produits de digestion dissous dans l'acide formique liera la colonne C3 en tant que jusqu'à 40% d'acétonitrile comme indiqué ici (figure 4). Une grande partie du fragment trpLE libéré peut traverser dans ces conditions (Notez que fragment trpLE est le produit protéique que dans le FTfraction: la figure 5, ligne 1), et nous avons profité de cette observation pour augmenter la capacité globale de liaison de la colonne pour les produits désirés. L'acétonitrile et l'isopropanol sont très efficaces comme solvants de gradient, et nous arrivent souvent à nos conditions de gradient finales en mélangeant préexistantes solutions de solvants pour modifier les profils d'élution, ce qui entraîne parfois des recettes bizarres mais efficaces tels que l'isopropanol, 75% d'acétonitrile 25%, 0,1 solution de TFA% utilisé comme solution B pour la purification DAP12TM montré ici. Produits extrêmement hydrophobes qui posaient problème ont été élues en utilisant l'acétonitrile ou l'isopropanol avec addition d'un maximum de 10% trifluoroéthanol (TFE) et des concentrations accrues de TFA (jusqu'à 0,3%) à la fois A et B (résultats non publiés). D'autres ont rapporté de bons résultats en utilisant phases acides butanol / acide acétique mobiles avec une phase stationnaire C4 ^9.

L'analyse des produits de digestion. Tant la technique d'analyse majeurs utilisé ici, SDS-PAGE et MALDI-TOF MS, peut être compliquée par la nature extrêmement hydrophobe de trpLE-TM produits. Lyophilisés échantillons d'analyse des réactions de digestion par CNBr / TFA et les fractions HPLC parfois fonctionner aussi haut poids moléculaire des agrégats sur les gels SDS-PAGE. Nous constatons que le traitement des échantillons lyophilisés avec un petit volume de HFIP et re-lyophilisation avant la préparation pour SDS-PAGE souvent remédie à ce problème. TM séquences peptidiques peuvent également pas facilement lors de l'ionisation MALDI-TOF MS, et peut donc donner des signaux très faibles. Nous avons utilisé une procédure optimisée pour la préparation des échantillons peptidiques TM dans lequel une solution saturée d'acide sinapinique (SA) dans l'éthanol est d'abord repéré sur la plaque et séchée pour former une couche mince et uniforme de la matrice. Un échantillon de peptides contenant de la fraction HPLC mélange 1:1 avec une solution saturée de SA dans l'acétonitrile est alors repérée sur le dessus de la couche de matrice sèche. Dans nos mains, cela donne de méthode entre deux et six fois plus de signal-sur-bruit comparerd pour repérer le peptide: SA mélange directement sur une plaque de propreté MALDI.

Applications en aval. Méthodes de reconstitution TM complexes peptidiques dans les systèmes lipidiques ou de détergent pour RMN en solution et d'autres applications en aval varient beaucoup et doivent généralement être soigneusement adaptée pour chaque nouveau système et l'application. Une discussion complète des paramètres intervenant est donc bien au-delà de la portée de cet article protocole. Pour des détails sur la préparation des échantillons à partir d'applications réussies en utilisant la RMN solution, nous renvoyons le lecteur à ces critiques récentes sur le sujet et les références citées ^1,19.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cyanogen bromide	ALDRICH	P.No- C91492,CAS-506-68-3	HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Very toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Contact with acids liberates very toxic gas. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.
Trifluoroacetic acid	SIGMA-ALDRICH	P.CODE-1000984387, CAS Number 76-05-1	HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS., Causes severe burns. Harmful by inhalation. Harmful to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.
2-Mercapt–thanol	SIGMA-ALDRICH	P.No M7154, CAS Number 60-24-2	HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Irritating to skin. Risk of serious damage to eyes. May cause sensitization by skin contact. Very toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic environment.
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol	SIGMA-ALDRICH	Product Number 52512, CAS-No. 920-66-1	HAZARDOUS SUBSTANCE. DANGEROUS GOODS. Harmful by inhalation and if swallowed. Causes burns.
Formic acid	Merck KGaA	K41186564	Flammable liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage.
Urea	UNIVAR, AJAX FINECHEM	Product Number, 817, CAS-No 57-13-6	When heated, decomposes to carbon dioxide and ammonia; if burned, emits small amounts of nitrogen oxides. Can cause redness and irritation of skin and eyes.
GUANIDINE HYDROCHLORIDE	Amresco	P.No-M110, CAS Number: 50-01-1	Harmful if swallowed, Causes serious eye irritation,Causes skin irritation, Acute Toxicity Oral, Skin Irritant, Eye Irritant.
TRITON X-100	SIGMA	Product Number- T8532 CAS No: 9002-93-1	Triton X-100 is a nonionic detergent, 100% active ingredient, which is often used in biochemical applications to solubilize proteins. Triton X-100 has no antimicrobial properties and considered a comparatively mild non-denaturing detergent
His-Select Nickel-Affinity gel	SIGMA-ALDRICH	Catalog Num- P6611	IS-Select Nickel Affinity Gel is an immobilized metal- ion affinity chromatography (IMAC) product. The HIS-Select Nickel Affinity gel is a proprietary quadridentate chelate on beaded agarose charged with nickel that is designed to specifically bind histidine containing proteins.
(-)-Glutathione, oxidized	SIGMA-ALDRICH	Catalog num 150568
Misonix S-3000 sonicator	QSONICA	S-3000 (discontinued)	Max power output 600 watts. 1/2-inch replaceable-tip probe takes 1/2-inch high-intensity, high-volume tips and a range of high-intensity, low-volume tips. Closest models currently available from this company are Q500 and Q700.
RP-HPLC: BioLogic DuoFlow chromatography system, Software Version 5.3	Bio-Rad Laboratories	Catalog Num 760-0047, Config No: AU500571, Serial No: 484BR3705	Peptides binds to reverse phase HPLC columns in high aqueous mobile phase and are eluted from RP HPLC columns with high organic mobile phase. In RP HPLC peptides are separated based on their hydrophobic character. Peptides can be separated by running a linear gradient of the organic solvent.
Prep HT C3 ZORBAX 300SB-Analytical HPLC Column, 21.2 x 150 mm, 5 μm particle size	Agilent	Product No: 895150-909	Reversed-phase HPLC colum
NuPAGE 12% Bis-Tris Gels	Life Technologies	NP0341BOX	Pre cast gels for protein electrophoresis
Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes, 3.5K MWCO	Thermo Scientific	Product No: 87724	Sample dialysis