Summary
مجمعات البروتين تحفيز الوظائف الخلوية الرئيسية. مفصلة توصيف وظيفي وهيكلي للعديد من المجمعات الأساسية يتطلب إنتاج المؤتلف. MultiBac هو نظام خلية الفيروسة العصوية / الحشرات مصممة بشكل خاص للتعبير عن البروتينات حقيقية النواة والمجمعات الخاصة بهم. تم تنفيذ MultiBac بمثابة منصة مفتوحة الوصول، وإجراءات التشغيل القياسية وضعت لتعظيم فائدتها.
Abstract
أظهرت أبحاث البروتينات تعقيد رائعة من proteomes حقيقية النواة بالتفصيل لم يسبق لها مثيل. وهو الآن فكرة مقبولة عموما أن البروتينات في خلايا موجودة في الغالب لا ككيانات منعزلة، بل ممارسة النشاط البيولوجي في الجمعية مع العديد من البروتينات الأخرى، في البشر عشرة أو أكثر، وتشكيل خطوط التجميع في الخلية لمعظم إن لم يكن جميع الوظائف الحيوية. 1 ، يتطلب 2 معارف وظيفة والهندسة المعمارية لهذه الجمعيات multiprotein تقديمها في الجودة والكمية كافية لتحليل مفصل. قلة من العديد من مجمعات البروتين في الخلايا، ولا سيما في حقيقيات النوى، ويحظر استخراجها من مصادر الأم، ويتطلب إنتاج المؤتلف. وقد ثبت التعبير نظام ناقلات الفيروسة العصوية (BEVS) أن يكون مفيدا بشكل خاص لإنتاج بروتينات حقيقية النواة، النشاط الذي عادة ما يعتمد على معالجة ما بعد متعدية التي غالبا ما يمكن لنظم التعبير الأخرى المستخدمة بشكل شائعلا يدعم. 3 BEVS استخدام باكولوفيروس المؤتلف في التي تم إدراج الجينات في المصالح لتصيب مزارع الخلايا الحشرات التي بدورها تنتج البروتين في الاختيار. MultiBac هو BEVS التي تم مصممة بشكل خاص لإنتاج مجمعات البروتين حقيقية النواة التي تحتوي على العديد من الوحدات الصغرى. 4 شرط أساسي وحيوي لكفاءة الإنتاج من البروتينات والمجمعات هم بروتوكولات قوية لجميع الخطوات المتبعة في تجربة تعبير مثالي يمكن تنفيذها في إجراءات التشغيل القياسية (إجراءات العمل الموحدة) ويليه أيضا من قبل المستخدمين غير المتخصصين مع سهولة نسبية. منصة MultiBac في مختبر علم الأحياء الجزيئي الأوروبي (EMBL) يستخدم إجراءات العمل الموحدة لجميع الخطوات المتبعة في تجربة التعبير معقدة multiprotein، بدءا من الإدراج من الجينات إلى الجينوم baculoviral هندسيا الأمثل لخصائص إنتاج البروتين مغايرة للتحليل على نطاق صغير من البروتين العينات المنتجة. 5-8 المنصةيتم تثبيت في وضع الوصول مفتوحة في EMBL غرونوبل، ودعمت العديد من العلماء من الأوساط الأكاديمية والصناعة لتسريع المشاريع البحثية المعقدة البروتين.
Introduction
يتم التحكم النشاط البيولوجي من قبل جمعيات البروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى التي تعمل في تناسق لتحفيز الوظائف الخلوية. ومن بين الأمثلة البارزة للآلية التي المحاضر المعلومات الوراثية الموجودة في الحمض النووي RNA إلى رسول. في البشر، وأكثر من 100 البروتينات معا في عملية تحديد وتنظيم لنسخ الجينات، وتشكيل المجمعات multiprotein كبيرة مع 10 وأكثر الوحدات الصغرى بما في ذلك الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني وعوامل النسخ العامة مثل TFIID، TFIIH وغيرها. 9 أمثلة أخرى هي الريبوسوم، تتكون من العديد من البروتينات وجزيئات الحمض النووي الريبي، وهذا يحفز تخليق البروتين، أو مجمع المسام النووية التي هي المسؤولة عن رحلات مكوكية الجزيئات الحيوية من خلال الغلاف النووي في حقيقيات النوى. A تشريح المعمارية والكيميائية الحيوية مفصل أساسا كافة الأجهزة المتعددة المكونات في الخلية هو أمر حيوي لفهم وظيفتها. استجلاء بنية بدائية النواة وeukarريبوسوم yotic، على سبيل المثال، شكلت الأحداث السمة المميزة الرضوخ البصيرة لم يسبق لها مثيل في كيفية هذه الآلات الجزيئات الاضطلاع بوظائفها المحددة لها في الخلية. 10،11
ويمكن الحصول على ريبوسوم في نوعية وكمية كافية لدراسة مفصلة من قبل تنقية المواد الذاتية من الخلايا المستزرعة، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن ما يصل إلى 30٪ من كتلة الخلوية تتكون من الريبوسومات. الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني هو بالفعل أقل وفرة من حيث الحجم، والعديد من ألف لتر من الخميرة الثقافة كان لا بد من معالجتها للحصول على عرض مفصل الذرية من هذا المجمع الأساسية المركزية لنسخ 12 والغالبية العظمى من المجمعات الأساسية الأخرى هي إلا موجودة في كميات أقل من ذلك بكثير في الخلايا الأم، وبالتالي لا يمكن تنقيته بشكل كاف من مصدر المواد الأصلية. لتقديم مثل هذه المجمعات في متناول التحليل البنيوي والوظيفي مفصلة يتطلب إنتاج مغاير باستخدام المؤتلف الشركة المصرية للاتصالاتchniques.
كان إنتاج البروتين المؤتلف لها تأثير كبير على بحوث علوم الحياة. تم إنتاج العديد من البروتينات recombinantly، وهيكلها وظيفة تشريح بدقة عالية. وقد اتخذت برامج الجينوميات الهيكلية الاستفادة من توضيح من الجينوم للعديد من الكائنات الحية لمعالجة ذخيرة منتج الجين من الكائنات بأكملها في وضع الإنتاجية العالية (HT). وهكذا فقد تم تحديد الآلاف من هياكل البروتين. حتى الآن، كان النظام الأكثر استخداما بغزارة لإنتاج البروتين المؤتلف E. وقد وضعت القولونية، وكثير من النظم التعبير وصقلها على مر السنين لإنتاج مغاير في هذا المضيف. البلازميدات بإيواء عدد كبير من الوظائف لتمكين إنتاج البروتين في E. القولونية ملء كتالوجات كامل من مقدمي الخدمات التجارية.
ومع ذلك، E. القولونية ديه بعض القيود التي تجعل من غير مناسبة لإنتاج العديد من البروتينات وحقيقية النواة في عمجمعات البروتين مفصلي مع العديد من الوحدات الصغرى. ولذلك، أصبح إنتاج البروتين في المضيفين حقيقية النواة على نحو متزايد الأسلوب المفضل في السنوات الأخيرة. A مناسبة بصفة خاصة نظام لإنتاج بروتينات حقيقية النواة هو تعبير نظام ناقلات الفيروسة العصوية (BEVS) التي تعتمد على باكولوفيروس المؤتلف تحمل الجينات مغاير لتصيب مزارع الخلايا الحشرات المزروعة في المختبر. نظام MultiBac هو BEVS وضعت في الآونة الأخيرة والتي يتم تفصيلها بشكل خاص لإنتاج مجمعات البروتين حقيقية النواة مع العديد من الوحدات الصغرى (الشكل 1). وقدم MultiBac الأولى في عام 2004. 13 منذ إطلاقها، وقد MultiBac تم صقلها باستمرار، ومبطنة تيار لتبسيط التعامل مع، وتحسين نوعية الهدف البروتين، وجعل النظام عموما الوصول إلى المستخدمين غير المتخصصين من خلال تصميم إجراءات التشغيل القياسية كفاءة (إجراءات العمل الموحدة). وقد تم تنفيذ 4 MultiBac في العديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم، في ميلانademia والصناعة. في EMBL في غرونوبل، وضعت برامج الوصول عبر الوطنية في المكان من قبل المفوضية الأوروبية لتوفير التدريب الخبير في منصة MultiBac للعلماء الذين يرغبون في استخدام هذا النظام لدفع عجلة الإنتاج أبحاثهم. تم توضيح بنية ووظيفة عدة مجمعات البروتين التي كانت حتى الآن لا يمكن الوصول إليها باستخدام عينات المنتجة مع MultiBac. 4 في ما يلي، وتتلخص الخطوات الأساسية لإنتاج MultiBac في البروتوكولات كما هي الحال في عملية في منشأة MultiBac في EMBL غرونوبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. جنبا إلى جنب Recombineering (TR) لإنشاء بنيات التعبير متعددة الجينات
- التخطيط لاستراتيجية شاركت في التعبير. أسلوب التصميم لإدخال الجينات الخاصة بك من الاهتمام إلى الجهات المانحة والموافقون. ينبغي تجميع الوحدات الفرعية الفسيولوجية المحتملة للمجمع الخاص معا على الموافقون وجهات مانحة محددة. استخدام وحدة الضرب تتكون من نوكلياز داخلية الزاجل (HE) - أزواج BstXI على الجمع بين أشرطة الكاسيت التعبير على المانحة الفردية والبلازميدات القابل 7،8 إنشاء كافة البنى ذات الصلة في سيليكون والتحقق من صحة استراتيجية جيدا قبل الشروع في العمل التجريبي. على سبيل المثال، يجب فحص الجينات في المصالح لا يحتوي على سعادة أو تقييد مواقع أخرى ووجود الصحيح إطارات القراءة المفتوحة (ORFS) ينبغي التحقق من صحتها. تنظر في طلب الجينات الاصطناعية الأمثل لمكافحة الحشرات استخدام كودون الخلايا وهيكلها الثانوي مرنا لتحسين مستويات إنتاج البروتين وكذلك إزالة أي EXIاللدغة سعادة المواقع من الجينات في المصالح. النظر في وضع الكلمات تنقية استنادا إلى بيانات من الأدبيات حول N-أو مرنة أو يتعرض C-مصطلحات من البروتينات التي تختارها. النظر في تطبيق استراتيجيات polyprotein التي تهدف إلى إنتاج عدة مفارز البروتين في مجمع الخاص بك إذا المبالغ النسبية للبروتينات الفردية تحتاج إلى رقابة بسبب قضايا رياضيات الكيمياء في المجمع. 4 إعداد مفصلة "كيف ل" وثيقة (ينصح الكتاب مختبر الإلكترونية) التي تحتوي على جميع الخطوات التجريبية المتوقعة من المشروع المؤدية إلى بناء متعددة الجينات كاملة (ق). إنشاء ملفات إلكترونية من البلازميدات جنة المساواة العرقية، LoxP تنصهر على سبيل المثال باستخدام برنامج جنة المساواة العرقية، ACEMBLER والتي يمكن تحميلها من الصفحة الرئيسية لمجموعة بيرجر ( multiexpression_technologies www.embl.fr/multibac/ / لجنة المساواة العرقية-acembler ).
- إدراج الجينات الخاصة بك من الاهتمام إلى الجهات المانحة مختارة ويقبلون باستخدام إنزيمات التقييد ويغاز، أو، بدلا من ذلك، باستخدام أساليب مستقلة ربط البروتوكولات نشرت بعد. 5،6،14 إذا كان لديك الوصول إلى مناولة السائل محطة العمل، وإذا كنت تخطط لعدد كبير من بنيات إلى أن تتولد ( على سبيل المثال لنهج اندماجي) النظر في استخدام الروبوتات البرامج النصية وضعها وتنفيذها من قبل مجموعة بيرجر (الشكل 2). 14،15 إذا كان التعامل مع السائل محطة العمل غير متوفرة، التشغيل اليدوي باستخدام أطباق التلازن يسمح الإدراج الجينات في HT مثل الموضة.
- القيود التي تفرضها الحاجة إلى السيطرة على حساب العناصر المتفاعلة من مفارز أعربت قد تتحقق. في حالة stoichiometrically مستويات التعبير متوازن من مفارز الفردية للبروتين معقد، والنظر في تطبيق استراتيجيات polyprotein إلى فستؤدي عدة مفارز من مجمع الخاص والبروتيني محددة (على سبيل المثال التبغ حفر فيروس زين البروتيني) في ORFS واحدة كبيرة متباعدة من قبل قمواقع بروتين pecific. 4،8 النظر المشترك، معربا عن polyproteins واحد أو عدة أشرطة مع تعبير واحد إذا كان لديك مجمع كبير جدا مع العديد من مفارز وتتراوح الأوزان الجزيئية على نطاق واسع من مفارز الفردية. تنظر شارك في التعبير عن العديد من الجينات التي تكود لنفس البروتين في polyprotein أو عن العديد من أشرطة الكاسيت التعبير متطابقة إذا كان متميزا بطابع أن البروتين منخفض العائد الإنتاج. 4،13
- التحقق من صحة كافة بنيات المانحة ومتقبل المستنسخة عن طريق تعيين قيود (اختياريا في الإنتاجية العالية) والتسلسل. انتقل إلى دمج مجموعات المانحين ومتقبل من قبل لجنة المساواة العرقية-LoxP إعادة التركيب لتوليد بنيات التعبير متعددة الجينات من خيار. التحقق من صحة تنقية البلازميدات الانصهار القابل الجهات المانحة عن طريق تعيين تقييد، استخدام تسلسل الإلكترونية التي أنشأتها لجنة المساواة العرقية-ACEMBLER أو برامج مماثلة كمرجع.
- تخزين المانحون تنقيته والتحقق من صحتها، يقبلون اندماج المانحين ومتقبل في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية. الأرشيف ررasmids وتسلسلها (مايكروسوفت إكسل، فايل ميكر، وغيرهم) بعناية للاستخدام في وقت لاحق.
2. مركب الجيل الفيروسة العصوية متعددة الجينات، والتضخيم، والتخزين
- دمج نواقل نقل متعددة الجينات في الجينوم baculoviral MultiBac بواسطة تحويل الى DH10 الخلايا إيواء الجينوم الفيروسي وظائف مطلوبة من أجل Tn7 تبديل. لاحظ أن الجينوم baculoviral Multibac يمكن تحميلها مسبقا مع جينات معينة من الفائدة (YFP علامة، المحرمين، الخ) في موقعها LoxP الخاصة (هندسيا في جينوم البعيدة إلى موقع المرفق Tn7) من قبل لجنة المساواة العرقية في الجسم الحي رد الفعل الذي يسبق Tn7 التكامل. 13 بعد Tn7 والتحول، ويتم اختيار الخلايا مع الفيروسة العصوية مركب يحتوي على جينات من الاهتمام من خلال فحص أزرق / أبيض (الناجحة Tn7 النتائج تبديل في فقدان α-تكامل من β-غالاكتوزيداز، وبالتالي، مع المستعمرات الصحيح Tn7 تبديل تبقى بيضاء على انتقائية علىلوحات غار تحتوي على X-غال) والجينوم هو أعدته تحلل القلوية والايثانول / هطول الأيزوبروبانول. 5،6
- ترنسفكأيشن وإنتاج فيروس الأولي. مكان 6 جيدا لوحة زراعة الأنسجة في غطاء العقيمة. من مراحل سجل Sf21 الحشرات خلية ثقافة، والبذور من aliquots من الخلايا في الآبار وبالنقل عن طريق إضافة الجينوم baculoviral تنقيته وكاشف ترنسفكأيشن مختلطة في وسائل الإعلام والثقافة كما هو موضح. 6 الحصاد فيروس الأولي بعد 48-60 ساعة عن طريق إزالة وسائل الإعلام ( جودة عالية، وانخفاض عيار الفيروس V 0، عادة 3 مل لكل بئر). تكملة وسائل الإعلام الجديدة، واختبار لإنتاج البروتين (وإذا كان موجود علامة YFP، لمضان) بعد 2-3 أيام إضافية. 6،7
- التضخيم من الفيروس، وانخفاض وزارة الداخلية نظام. استخدام V 0 الفيروس لنقل العدوى 25-50 مل من الخلايا في مرحلة السجل (كثافة الخلية <1X10 6 خلايا لكل مل) في الصغيرة (100-250 مل) مخروطي شاكر قوارير المهتاجعلى الهزازات منصة مدارية (الشكل 3). عد الخلايا وتقسيم كل ساعة 24 حتى تتوقف الخلايا عن مضاعفة (اعتقال الانتشار). وأضاف خلايا يجب مضاعفة (على الأقل) مرة واحدة (وزارة الداخلية <1)، وإلا تكرار التجربة مع حجم أصغر من V 0: اتباع نظام منخفضة وزارة الداخلية (تعدد عدوى أي عدد جزيئات الفيروس في الخلية). عادة، يتم استخدام 3 مل من V 0 لتصيب 25 مل من Sf21 خلايا الحشرات في مناطق ذات كثافة من 0.5x10 6 خلية / مل. وهذا أمر ضروري لمنع ضار على التضخيم والسيارات حذف الفيروس الذي يمكن أن يؤدي إلى فقدان الجينات مغاير من الفائدة. الحصاد V 1 فيروس (25-50 مل) بعد 48-60 ساعة من قبل التكوير الخلايا وإزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على الفيروس. تكملة مع وسائل الإعلام الجديدة واختبار لYFP وإنتاج البروتين عن طريق إزالة الخلايا 6 1X10 كل 12 أو 24 ساعة، التكوير والتحقق من صحة إنتاج البروتين والبروتين علامة (YFP) إشارة. 6، أسهب فيروس (إلىV 2) مرة أخرى إذا وتهدف كميات أكبر في التعبير عن طريق إصابة ما يصل الى 400 مل الخلايا في 2 L شاكر قوارير مع V 1 فيروس احترام فوق أدنى مستوى وزارة الداخلية نظام (خلايا يجب مضاعفة مرة واحدة على الأقل بعد الإصابة مع V 1). اختبار صارم إنتاج البروتين والبروتين إشارة علامة خلال التضخيم لتجنب تراكم الفيروسات معيبة لم تعد تحتوي على الجينات الخاصة بك من الفائدة. 5-7 استخدام الكريات الخلية تتراكم في كل خطوة التكبير بالفعل لإقامة بروتوكولات تنقية للمجمع البروتين المعبر عنه من الفائدة.
- تخزين BIIC من فيروس الإنتاج. ونحن نوصي بشدة لتخزين V 2 فيروس مثل فيروس الإنتاج باستخدام BIIC (B-I aculovirus nfected أنا nsect ج ells) طريقة، لمنع تعديلات (على سبيل المثال فقدان الجينات في المصالح) من الفيروس المؤتلف والحفاظ على التعبير عالية مستوىق 16 بيليه الخلايا المصابة لوحظ 24 ساعة بعد إلقاء القبض الانتشار - في هذه المرحلة خلايا تحتوي على جزيئات فيروسية كاملة قبل أن يتم الإفراج عنهم (عن طريق الناشئين) في وسائل الإعلام. إزالة وسائل الاعلام ومأخوذة تجميد الخلية بيليه في النيتروجين السائل وتخزينه إلى أجل غير مسمى. 7،16
3. إنتاج البروتين والتجهيز النهائي
- اصابة (ص) الثقافات كبيرة والرصد YFP. استخدام V 1، V 2 أو مأخوذة BIIC المجمدة لتصيب مزارع الخلايا أكبر للأشواط الإنتاج (عادة 400 مل في 2 L قوارير). الانضمام إلى الأقل زارة الداخلية نظام (ضبط حجم الفيروس المستخدمة للعدوى مثل تلك الثقافة المصابة الزوجي مرة واحدة على الأقل). تكبير حجم ثقافة المصابة إذا لزم الأمر عن طريق ضرب عدد من قوارير. إذا البروتين علامة YFP هو الحاضر، سحب على فترات 1X10 6 خلايا محددة، بيليه وليز الخلايا ورصد تطور إشارة YFP حتى يتم التوصل إلى هضبة دائرة الهجرة والجنسيةicating أقصى إنتاج البروتين المؤتلف. ويمكن قياس مستويات YFP في مستوى جيد 96 قارئ لوحة قادرة على تسجيل إشارات مضان (على سبيل المثال TECAN SPECTRAFluor). حصاد الخلايا في هذه المرحلة. الكريات خلية تخزينها في -20 درجة مئوية (قصيرة الأجل) أو -80 ° C (طويل الأجل).
- تحلل الخلايا وتجزئة. ليز الخلايا عن طريق الأسلوب المفضل لديك من خيار، مصممة خصيصا لمتطلبات البروتين الخاص (تجميد ذوبان الجليد، صوتنة، الصحافة الفرنسية، وغيرهم). 5-7 العصارة الخلوية يجزئ ونوى واختبار لوجود البروتينات اهتمامك. وضع بروتوكولات تنقية استنادا إلى نتائج لتبسيط تنقية البروتين. النظر في تطبيق إجراءات تمرغ لاستخراج البروتين الخاص بك من الكسر النووية في ظل ظروف بوكل عالية إذا البروتينات الخاصة بك الموجودة في النواة. 7،18
- تنقية البروتين (الصغيرة الحجم، وعلى نطاق واسع). لاحظ أن كميات صغيرة في كثير من الأحيان (10 أو 25 مل) من زراعة الخلايا هي سوfficient للحصول على الكريات خلية لتنقية كميات كبيرة من البروتينات اهتمامك نظرا لارتفاع مستويات الإنتاج عادة أو عالية جدا من البروتينات مغايرة في نظم خلايا الفيروسة العصوية / حشرة (غالبا 10-100 ملغ من البروتين لكل L ثقافة وأكثر من ذلك). بالتزامن مع الدقيقة تنقية (لوحات multiwell، طرق microtip، GE للرعاية الصحية نظام ÄKTAmicro، وغيرهم) فمن الممكن الحصول على بيانات البيوكيميائية والنشاط وغالبا أيضا كمية كافية من البروتينات والمجمعات المطلوب على نطاق ونانولتر تبلور عالية الإنتاجية (HTX ). النظر في استخدام المعادن تنقية تقارب (Clonetech تاكارا تالون، QIAGEN NiNTA معدنية راتنجات خالب) وبنسبة ضئيلة من الحامض الاميني (6-10 بقايا) علامة على مفارز المكشوفة من البروتين الخاص المعقدة لتسهيل تنقية، بالتزامن مع التبادل الأيوني وحجم الاستبعاد اللوني في الصغيرة وحدات التخزين باستخدام على سبيل المثال ÄKTAmicro أو صغيرة الحجم آلة مماثلة تنقية (الشكل 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم عرض قوي شارك في التعبير عن البروتينات مغاير من قبل النظام MultiBac المحرز في 1D الشكل (تحقيقات أخذ 48 ساعة بعد اصابة ثقافة الخلية تعليق). نطاقات البروتين بإفراط (overexpressed) بشكل واضح ملحوظ في استخراج خلية كاملة (SNP) والمحللة تطهيرها (SN). نوعية وكمية من المواد إنتاج البروتين غالبا ما تكون كافية لتمكين تحديد هيكل مجمعات البروتين، مثل الإنقسامية نقطة تفتيش معقدة MCC هو مبين في الشكل 1E 17
يعرض الشكل 2 تدفق العمل من تجربة الجمعية الجين بواسطة recombineering جنبا إلى جنب الروبوت بمساعدة (TR). كانت قوية بروتوكولات الجمعية DNA كتابتها في الأعمال الروتينية الروبوتات لتجميع متوازية من بنيات التعبير متعددة الجينات. وتظهر الخطوات الروبوتية الفردية في الأداة الإضافية طلقات (الشكل 2C، I - IV). يتم إنشاء مكونات الحمض النووي ليتم تجميعها بواسطة PCR والجودة التي تسيطر عليهاE-المواد الهلامية (الشكل 2D، اليسار)، ويتم التحقق من صحة بنيات متعددة الجينات تجميعها وبالمثل من قبل PCR مع مجموعات مصممة خصيصا من الاشعال (الشكل 2D، يمين) 14،15.
جيل الفيروسة العصوية المؤتلف والتضخيم يلي إجراءات التشغيل القياسية (عرض تخطيطي في الشكل 3A). وتظهر لقطات من الخلايا المستزرعة في أحادي الطبقة (الشكل 3B، I. & II). بعد الإصابة بفيروس MultiBac.
التجهيز النهائي للمجمعات البروتين المؤتلف يمكن المنمنمة باستخدام متعددة جيدا لوحة أو المستندة إلى microtip اللوني لتنقية تقارب يليه حجم الاستبعاد اللوني (SEC) من المجمعات من قبل الاندماج في نظم تدفق العمل على نطاق صغير مثل ÄKTAmicro (الشكل 4A). ويرد SEC الشخصي ممثل ل~ 700 كيلو دالتون الإنسان عامل النسخ المعقدة. عينة تنقيته باستخداموÄKTAmicro في الصغيرة كافية عادة لتوصيف بالوسائل البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية بما في ذلك المجهر الإلكتروني (الشكل 4B).
الشكل 1. MultiBac منصة تكنولوجيا لإنتاج multiprotein المعقدة. (أ) يتم دمج جينات الفائدة في جينوم baculoviral Multibac باستخدام Tn7 تبديل بالتزامن مع فحص أزرق / أبيض. موقع LoxP على العمود الفقري فيروس يسمح بإضافة المزيد من الوظائف مثل البروتين علامة فلوري لمراقبة أداء الفيروس وإنتاج البروتين مغاير. (ب) يعتمد الفيروسة العصوية شكل عصا ممدود ويتميز مغلف المرنة التي يمكن أن تزيد لاستيعاب كبيرة (> 130 KB) دائري جينوم الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل. يتم التسامح مع كبير الإدراج جين مغاير في الجينوم بY التمطيط المغلف. (ج) معيار قوارير مخروطي على منصات المداري شاكر يمكن استخدامها لزراعة الحشرات على نطاق واسع الثقافات الخلية لإنتاج البروتين heterologues. (د) نظام MultiBac تنتج بكفاءة البروتينات المؤتلف التي غالبا ما تكون واضحة للعيان بالفعل في كامل استخراج الخلايا (SNP). (ه) تم توضيح هيكل معقد تفتيش الإنقسامية بواسطة حيود الأشعة السينية من بلورات نمت من عينة المنتجة مع نظام MultiBac 17 اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 2. (الآلي) جنبا الى جنب Recombineering (TR). (أ) يستخدم جنبا إلى جنب recombineering صفائف صغيرة من جزيئات الحمض النووي البلازميد الاصطناعية ودعا الجهات المانحة والموافقون لتجميع MULTبنيات التعبير igene، اختياريا في وضع الروبوت بمساعدة باستخدام مناولة السائل محطة العمل (يمين). (ب) ويبين سير العمل TR. SLIC تقف على تسلسل وربط استنساخ المستقلة، لجنة المساواة العرقية تقف على الانصهار جنة المساواة العرقية، LoxP وصل إلى الجهات المانحة والموافقون التي تم إدراجها الجينات من الاهتمام من خلال SLIC. يبني ولدت التعبير متعددة الجينات بواسطة هذا الإجراء recombineering باستخدام SLIC وجنة المساواة العرقية جنبا إلى جنب ثم يتم دمجها في الجينوم الفيروسة العصوية MultiBac واستخدامها للمشاريع الصغيرة والكبيرة الحجم في التعبير الثقافات الخلية حشرة مصابة بالفيروس المؤتلف. (ج) لقطات من TR الروبوت بمساعدة وتظهر عملية بما في ذلك توفير الحمض النووي القالب والاشعال (I)، إعداد تفاعلات PCR في multiwell لوحات (II)، PCR التضخيم من السلطات الوطنية المعينة (III) وإعداد متعددة الجينات يبني نمت في الثقافة البكتيرية بواسطة تحلل القلوية في لوحات متعددة جيدا ( IV). (د) المنتجات PCR تستخدم لTR هي تصور من قبلناجي نظام هلام ه (من اليسار). يتم التحقق من صحة بنيات متعددة الجينات الانتهاء من التحليل PCR ردود الفعل تحميلها على جل ه (يمين). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل (3). جيل MultiBac الفيروس، والتضخيم، والتخزين. (أ) يتم عرض إجراءات التشغيل القياسية (SOP) من منصة MultiBac في EMBL غرونوبل في تخطيطيا. يتم تعريف المؤتلف فيروس MultiBac بواسطة فحص الأزرق والأبيض، وأعد من الثقافات البكتيرية. ترنسفكأيشن الأولية تجري على 6 لوحات جيدة مع المصنف الطبقات الوحيدة من خلايا الحشرات (Sf21، Sf9 و Hi5، وغيرهم). يتم تضخيمه الفيروسات والبروتين المستهدف إنتاجها في الهزازات مخروطي. يتم تخزين الفيروس عن طريق مأخوذة تجميد خلايا الحشرات المصابة (BIIC). يتم تسجيل الإزهار كأداة تحليلية إذاوقد تم دمج YFP (أو بروتين فلوري أخرى) باعتبارها البروتين علامة على سبيل المثال إلى الموقع الحالي loxP بشأن المجين baculoviral MultiBac. (ب) يتم عرض لقطات من خلايا الحشرات المصابة مع الفيروسة العصوية MultiBac. الخلايا المتكاثرة وقف، وزيادة في حجم (I.). ويلاحظ اندماج الخلية (II). يتم جمع الفيروس المبرعمة قبالة الخلايا المصابة في وسائل الإعلام واستخدامها لتصيب مزارع الخلايا لإنتاج أكبر مجمع بروتين (الثالث والرابع). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 4. إنتاج بروتين معقد وتجهيز أسفل تيار. بروتين عينة معقدة ويمكن بالفعل تنقية مريح من الصغيرة الثقافات الخلية الأولية من خلال الاستفادة من أساليب تنقية المنمنمة مثل متعدد الطبقات أو microtip-تنقية القائمة، اختياريا بالتزامن مع أنظمة اللوني صغيرة الحجم (من اليسار). غالبا ما يكون العائد من هذه بالفعل "التحليلية" أشواط تنقية (وسط) كافية لتحليل هيكل وظيفة من وظائف معقدة تنقيته من خلال مجموعة متنوعة من الوسائل بما في ذلك المجهر الإلكتروني (يمين). انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فيديو الأداة الإضافية طلقات في الشكلين 2 و 3 توضيح العملية برمتها من جيل الروبوت بمساعدة من [كدنا] التعبير متعددة الجينات يبني كل وسيلة لإصابة مزارع الخلايا الحشرات لإنتاج البروتين. وقد تم تطوير الكواشف الجديدة (البلازميدات والفيروسات) والبروتوكولات قوية لتمكين خط أنابيب الاعتماد على إجراءات العمل الموحدة. وقد تم تنفيذ خط الانابيب بالكامل بوصفها تكنولوجيا منصة في EMBL في غرونوبل. وقد تم الوصول إلى منصة MultiBac من قبل العديد من العلماء من الأوساط الأكاديمية والصناعة الذين يشاركون في البحوث multiprotein. ويدعم وصول التدريب بواسطة برامج مخصصة الوصول تموله المفوضية الأوروبية (P-CUBE، BioSTRUCT-X).
توافر إجراءات العمل الموحدة لتنفيذ البروتين التعبير معقدة باستخدام نظام MultiBac جعلت هذه التكنولوجيا بسهولة قابلة أيضا للمستخدمين غير المتخصصين. العملية بمساعدة الروبوت يسرع انتاج multiprotein المعقدة في particجزيئية عند عدد كبير بما فيه الكفاية من المجمعات، على سبيل المثال المتغيرات والمسوخ من عينة من الفائدة، وتحتاج إلى أن تتولد في نفس الوقت. ومع ذلك، التشغيل اليدوي على أن انخفاض الإنتاجية المتوسطة أيضا فوائد كبيرة من توافر إجراءات العمل الموحدة. في تجربتنا، وحاجة العمليات التي يمكن أن تكون كتابتها بنجاح في الأعمال الروتينية الروبوتات، ليتم تكريره الأولى مع بذل جهد كبير حتى تم الحصول على بروتوكولات قوية بما فيه الكفاية التي تتوافق مع باستخدام الروبوت. هذه البروتوكولات تشكل أساسا لإجراءات التشغيل القياسية لدينا. 5،6،14،15 والواقع أن تنفيذ هذه البروتوكولات قوية للروبوت يؤدي إلى زيادة كفاءة كبيرة جدا أيضا من العمليات اليدوية في مختبرنا.
وكانت العديد من البروتينات والمجمعات البروتين ويتم إنتاجها باستخدام نظام MultiBac التي قمنا بتطويرها، وعلى مقربة من 500 مختبرات في جميع أنحاء العالم حصلوا على الكواشف. وقد حفزت MultiBac البحث ليس فقط في علم الأحياء الهيكلي ولكن أيضا في العديد من الغيرالمناطق إيه علوم الحياة أن التحقيق أو استغلال التفاعلات بين البروتينات في التجمعات الكبيرة. وقد استخدم MultiBac أيضا لإنتاج أهداف البروتين من الفائدة الدوائية كبيرة بما في ذلك الفيروسات مثل الجزيئات، والتي قد تصبح اللقاحات المرشحة مفيدة. 4 وفي الآونة الأخيرة، كما تم استخدام MultiBac لتوصيل الجينات إلى خلايا الثدييات والثقافات الخلية، أو حتى الكائنات بأكملها العلاج الجيني. 4 ونحن نتوقع أن نهج مثل تلك المصورة في هذه المساهمة سوف يثبت أنه مفيد لكثير من مجالات البحوث التي تنطوي جمعيات multiprotein والتفاعل المعقد بين الجزيئات البيولوجية التي تشكل أساس العمليات الخلوية في الصحة والمرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
IB هو المخترع على براءة اختراع وطلبات براءات الاختراع بالتفصيل أجزاء من التكنولوجيا وصفها هنا.
Acknowledgments
نشكر كريستوف Bieniossek، سيمون Trowitzsch، دانيال فيتزجيرالد، يويشيرو تاكاجي، كريستيان Schaffitzel، تقول السيدة إيفون، تيموثي ريتشموند وجميع أعضاء سابقون وحاليون من المختبر بيرغر طلبا للمساعدة والمشورة. وكانت منصة MultiBac وتطوره والدعم السخي من قبل وكالات التمويل بما في ذلك المؤسسة السويسرية الوطنية للعلوم (SNSF)، ووكالة الوطني للبحوث (ANR) والمركز الوطني للبحوث العلمية (CNRS) والمفوضية الأوروبية (EC) في إطار برامج (FP) 6 و 7. يتم توفير الدعم من أجل الوصول عبر الوطنية من مشاريع FP7 EC-P CUBE ( www.p-cube.eu ) وBioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). واعترفت وزارة الفرنسية للعلوم وخاصة لدعم منصة MultiBac في EMBL من خلال INVESTISSEMENT D'أفينير مشروع FRISBI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
- Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
- Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W.
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes. Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).
- Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
- Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).
- Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production. J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).
- Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells. J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).
- Thomas, M. C., Chiang, C. M. The general transcription machinery and general cofactors. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).
- Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N.
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).
- Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science. 288 (5466), 640-649 (2000).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).
- Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering. Nat. Protocols. , (2009).
- Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).
- Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford,
- Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a. Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).
