Summary
Eiwitcomplexen katalyseren belangrijke cellulaire functies. Gedetailleerde functionele en structurele karakterisering van vele essentiële complexen vereist recombinante productie. MultiBac is een baculovirus / insectencelsysteem vooral afgestemd voor het uitdrukken van eukaryote eiwitten en hun complexen. MultiBac werd geïmplementeerd als een open-access platform en standaard operationele procedures ontwikkeld om het nut te maximaliseren.
Abstract
Proteomics onderzoek bleek de indrukwekkende complexiteit van eukaryote proteomen in ongekend detail. Het is nu een algemeen bekend begrip dat eiwitten in cellen bestaan meestal niet als geïsoleerde gegeven maar oefenen hun biologische activiteit in combinatie met vele andere eiwitten, in mensen tien of meer, die assemblagelijnen in het vak voor de meeste, zo niet alle vitale functies 1. , 2 Kennis van de functie en de architectuur van deze multiprotein assemblages vereist hun bepaling in superieure kwaliteit en voldoende hoeveelheid voor een gedetailleerde analyse. Het gebrek aan vele eiwitcomplexen in cellen, met name in eukaryoten, verbiedt de winning van natieve bronnen en noodzakelijk recombinante productie. De baculovirusexpressievectorsysteem (BEV) is bijzonder nuttig gebleken voor het produceren van eukaryote eiwitten zijn, waarvan de activiteit berust vaak post-translationele processing die andere gebruikelijke expressiesystemen kunnen vaakgeen ondersteuning. 3 BEV gebruik een recombinant baculovirus waarin het gen van interesse is ingevoegd insecten celkweken die op hun beurt het gekozen eiwit infecteren. MultiBac is een BEV die in het bijzonder is ontworpen voor de productie van eukaryotische eiwitcomplexen die veel subeenheden bevatten. 4 Een essentiële voorwaarde voor efficiënte productie van eiwitten en hun complexen stabielere protocollen voor alle bij een expressie experiment die ideaal kan worden geïmplementeerd als stappen standard operating procedures (SOP's) en volgde ook door niet-gespecialiseerde gebruikers betrekkelijk gemakkelijk. De MultiBac platform op het European Molecular Biology Laboratory (EMBL) maakt gebruik van SOP's voor alle betrokkenen in een multi-eiwitcomplex uitdrukking experiment stappen, te beginnen met het inbrengen van de genen in een aangelegde baculovirale genoom geoptimaliseerd voor heterologe eiwitproductie eigenschappen aan kleinschalige analyse van het eiwit exemplaren geproduceerd. 5-8 Het platformwordt geïnstalleerd in een open access-modus bij EMBL Grenoble en heeft vele wetenschappers uit de academische wereld en de industrie om eiwitcomplex onderzoeksprojecten versnellen ondersteund.
Introduction
Biologische activiteit wordt gecontroleerd door vergaderingen van eiwitten en andere biomoleculen die in onderling overleg handelen om cellulaire functies katalyseren. Sprekende voorbeelden zijn de machines die de erfelijke informatie in DNA in messenger RNA transcribeert. In mensen, meer dan 100 eiwitten samenkomen in een gedefinieerd en gereguleerd proces om genen transcriberen, die grote multiprotein complexen met 10 en meer subeenheden waaronder RNA polymerase II en algemene transcriptiefactoren zoals TFIID, TFIIH en anderen. 9 Andere voorbeelden zijn de ribosoom, bestaande uit vele eiwitten en RNA moleculen, die eiwitsynthese of de nucleaire porie complex is verantwoordelijk voor shuttling biomoleculen door de nucleaire envelop in eukaryoten katalyseert. Een gedetailleerde architectuur en biochemische dissectie van nagenoeg alle multicomponent machines in de cel is essentieel om de functie te begrijpen. De structuur opheldering van prokaryote en eukaryotic ribosomen, bijvoorbeeld, vormde keurmerk gebeurtenissen waardoor ongekend inzicht in hoe deze macromoleculaire machines uitvoeren van hun aangewezen functies in de cel. 10,11
Ribosomen kan voldoende kwaliteit en kwantiteit voor gedetailleerde studie worden verkregen door zuiveren van het endogene materiaal uit gekweekte cellen, vanwege het feit dat tot 30% van de cellulaire massa uit ribosomen. RNA polymerase II reeds minder overvloedig met orden van grootte, en vele duizenden liters gistcultuur verwerkt te worden tot een gedetailleerde atomaire weergave van deze essentiële complex centraal transcriptie verkrijgen. 12 De overgrote meerderheid van de andere essentiële complexen zijn echter aanwezig veel lagere hoeveelheden in oorspronkelijke cellen, en derhalve niet voldoende worden gezuiverd uit natuurlijke bron materiaal. Om dergelijke complexen toegankelijk te gedetailleerde structurele en functionele analyse maken vereist heterologe productie met behulp van recombinant techniques.
Productie van recombinant eiwit had een grote impact op life science onderzoek. Vele eiwitten zijn recombinant geproduceerd en hun structuur en functie ontleed bij hoge resolutie. Structurele genomica programma's hebben gebruik gemaakt van de opheldering van de genomen van vele organismen aan het genproduct repertoire van gehele organismen in high-throughput mode (HT) te pakken. Duizenden eiwitstructuren zijn aldus bepaald. Tot op heden is de meest overvloedig gebruikt voor recombinant eiwitproductie geweest E. coli en vele expressiesystemen ontwikkeld en verfijnd door de jaren heterologe in deze gastheer. De plasmiden een overvloed aan functionaliteiten om eiwitproductie mogelijk in E. coli vullen hele catalogi van commerciële aanbieders.
Echter, E. coli heeft bepaalde beperkingen waardoor het ongeschikt voor veel eukaryote proteïnen te produceren en in particulaire eiwitcomplexen met vele subeenheden. Daarom heeft eiwitproductie in eukaryotische gastheren steeds meer de werkwijze van keuze in de afgelopen jaren. Een bijzonder geschikt systeem eukaryote eiwitten is het baculovirus expressie-vectorsysteem (BEV) dat steunt op een recombinant baculovirus die de heterologe genen insecten celkweken gekweekt in het laboratorium infecteren. Het MultiBac systeem is een recent ontwikkelde BEV die vooral is aangepast voor de productie van eukaryotische eiwitcomplexen met vele subeenheden (Figuur 1). MultiBac werd voor het eerst geïntroduceerd in 2004. 13 Sinds de introductie, heeft MultiBac voortdurend verfijnd en gestroomlijnd om behandeling te vereenvoudigen, te verbeteren doelproteïne kwaliteit en in het algemeen maken van het systeem toegankelijk is voor niet-gespecialiseerde gebruikers door het ontwerpen van efficiënte standard operating procedures (SOP's). 4 MultiBac is geïmplementeerd in veel laboratoria in de wereld, in academia en industrie. Aan het EMBL in Grenoble, werden transnationale toegang programma's opgezet door de Europese Commissie om deskundig opleiding op het MultiBac platform voor wetenschappers die wilden deze productie systeem te gebruiken voor het bevorderen van hun onderzoek. De structuur en functie van vele eiwit-complexen die tot dusverre niet toegankelijk waren opgehelderd door monsters geproduceerd MultiBac. 4 Hierna worden de essentiële stappen van MultiBac productie samengevat in protocollen als in werking op MultiBac faciliteit in EMBL Grenoble.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tandem recombineering (TR) voor het maken van Multigene expressie constructen
- Planning van de co-expressie strategie. Ontwerp aanpak voor het invoegen van uw genen van belang in en acceptoren. Potentiële fysiologische submodules van uw complexe bijeen te worden gebracht van specifieke Handelaren en Donors. Gebruik Vermenigvuldiging Module bestaande uit Homing endonuclease (HE) - BstXI paren tot expressie cassettes combineren op individuele donor en acceptor plasmiden 7,8 Maak alle relevante constructies in silico en valideren strategie grondig alvorens tot experimenteel werk.. Zo dient genen plaats gecontroleerd niet bevatten HE of andere restrictieplaatsen en de aanwezigheid van juiste open leesramen (ORFs) worden gevalideerd. Overwegen het bestellen van synthetische genen geoptimaliseerd voor insectencelsystemen codongebruik en mRNA secundaire structuur van eiwitten productieniveaus alsmede opheffing van een exi verbeterensting HE sites uit de genen van belang. Overweeg het plaatsen van zuivering tags die zijn gebaseerd op gegevens uit de literatuur over flexibele of blootgesteld N-of C-uiteinden van uw eiwitten van keuze. Overwegen om polyproteïne strategieën die gericht zijn op het produceren van verschillende eiwitsubeenheden in uw complex als de relatieve hoeveelheden van de afzonderlijke eiwitten moeten worden gecontroleerd wegens stoichiometric problemen in het complex. 4 Bereid gedetailleerd "How-To" document (elektronisch lab boek wordt aanbevolen) met daarin alle geplande experimentele stappen van het project in de aanloop naar de volledige multigene construct (s). Maak elektronische bestanden van het Cre-LoxP gesmolten plasmiden bijvoorbeeld door het gebruik van het Cre-ACEMBLER software die kan worden gedownload van de Berger groep homepage ( www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies / cre-acembler ).
- Plaats uw genen van belang in geselecteerde Donors enAcceptanten met behulp van restrictie-enzymen en ligase, of, als alternatief, door het gebruik van ligatie onafhankelijke methoden volgens gepubliceerde protocollen. 5,6,14 Als u toegang tot een liquid handling werk-station hebt en als u van plan een groot aantal constructen te genereren ( bijvoorbeeld voor combinatorische benaderingen) overwegen robotica scripts ontwikkeld en geïmplementeerd door de Berger-groep (figuur 2). 14,15 Wanneer een liquid handling werk-station niet beschikbaar is, handmatig bij gebruik van microtiterplaten laat gen inbrengen in een HT-achtige manier.
- Beperkingen opgelegd door de noodzaak om de stoichiometrie van de uitdrukking subeenheden controle kunnen materialiseren. Bij stoechiometrisch onevenwichtige expressieniveaus van individuele subeenheden van een eiwitcomplex, overwegen om polyproteïne strategieën toe verschillende subeenheden van het complex en een specifiek protease (bijvoorbeeld tabak etch virus NIA protease) verbinden in enkele grote ORF gescheiden door sijzondere proteolytische sites. 4,8 Overweeg co-expressie van een of meerdere polyproteïnen met enkele uitdrukking cassettes als u een zeer groot complex met veel subeenheden en op grote schaal, variërend moleculaire gewichten van de individuele colli. Overweeg co-expressie meerdere genen die coderen voor hetzelfde eiwit in een polyproteïne of meerdere identieke expressiecassettes als dat eiwit wordt gekenmerkt door lage productieopbrengst. 4,13
- Valideren alle donor en acceptor constructies gekloond door restrictie mapping (naar keuze in high-throughput) en sequencing. Overgaan tot Donor-Acceptant combinaties zekering door Cre-LoxP recombinatie aan de multigene expressie constructen van keuze te genereren. Valideer gezuiverde Acceptor-Donor fusie plasmiden door restrictie mapping, gebruik van elektronische sequenties door Cre-ACEMBLER en dergelijke meer als referentie.
- Slaan gezuiverd en gevalideerd Donoren, Acceptanten en donor-acceptor fusies bij -20 ° C of -80 ° C. Archief plasmids en hun sequenties (Microsoft Excel, Filemaker, anderen) zorgvuldig voor later gebruik.
2. Composiet Multigene Baculovirus Generation, Amplification en opslag
- Integreren multigene transfervectoren de MultiBac baculovirale genoom door transformeren in DH10 cellen die het virale genoom en de functionaliteiten die nodig zijn voor Tn7 omzetting. Merk op dat de Multibac baculovirus genoom worden voorgeladen met bijzondere genen (YFP marker, chaperones, etc.) in zijn eigen LoxP plaats (gemanipuleerd in het genoom distaal van de Tn7 bevestigingsplaats) een in vivo Cre reactiemengsel voorafgaand Tn7 integratie. 13 Na Tn7 omzetting, worden cellen met composiet baculovirus met de genen van belang geselecteerd door blauw / wit screening (succesvolle Tn7 omzetting resulteert in het verlies van α-complementering van de β-galactosidase, daarom kolonies met de juiste Tn7 omzetting wit blijven selectief eengar platen die X-gal) en het genoom bereid door alkalische lysis en ethanol / isopropanol precipitatie. 5,6
- Transfectie en initiële virusproductie. Plaats 6-well weefselkweek plaat in steriele kap. Van log-fase Sf21 insectencellen celkweek, zaad uit monsters van cellen in de putjes en transfecteren door toevoeging van het gezuiverde baculovirale genoom en een transfectie reagens gemengd in kweekmedia zoals beschreven. 6 Harvest oorspronkelijke virus na 48-60 uur door het verwijderen van de media ( hoge kwaliteit, lage titer virus V 0, typisch 3 ml per putje). Supplement vers medium en test voor eiwit (en, indien een YFP marker aanwezig is, voor fluorescentie) na nog eens 2-3 dagen. 6,7
- Versterking van het virus, lage MOI regime. Gebruik V 0 virus tot 25-50 ml van cellen in log-fase (celdichtheid <1x10 6 cellen per ml) infecteren in kleine (100-250 ml) Erlenmeyer schudflessen geagiteerdeop orbitale platform shakers (Figuur 3). Tellen cellen en splitsen elke 24 uur tot cellen stoppen verdubbeling (proliferatie arrestatie). Volg een lage MOI (multipliciteit van infectie wil zeggen het aantal virusdeeltjes per cel) schema: De cellen moeten verdubbelen (ten minste) eenmaal (MOI <1), anders herhaalt experimenteren met een kleiner volume V 0 toegevoegd. Normaliter worden 3 ml van 0 V wordt gebruikt om 25 ml van Sf21 insectencellen te infecteren bij een dichtheid van 0.5x10 6 cellen / ml. Dit is essentieel om nadelige voorkomen dat over-amplificatie en automatische verwijdering van virus dat kan leiden tot verlies van de heterologe genen van belang. Harvest V 1 virus (25-50 ml) na 48-60 uur door pelleteren cellen en het verwijderen van het medium met het virus. Vullen met verse media en test voor YFP en eiwitproductie door het verwijderen van 1x10 6 cellen om de 12 of 24 uur, omhulsels en valideren van eiwitproductie en marker-eiwit (YFP) signaal. 6, Amplify virus (naarV 2) verder als grotere volumes uitdrukking zijn gericht op het door het infecteren van maximaal 400 ml cellen in 2 L schudflessen met V 1 virus dat aan de bovenvermelde lage MOI regime (cellen moeten na infectie verdubbelen ten minste een keer met V 1). Streng testen eiwitproductie en marker-eiwit signaal gedurende amplificatie om ophoping van defecte virussen niet langer met uw genen van belang te voorkomen. 5-7 Gebruik celpellets accumuleren bij elke aanvullingen stap al voor het vaststellen van de zuivering protocollen voor het tot expressie gebrachte eiwit complex van belang.
- BIIC opslag van productie virus. We raden aan V2 virus als de productie virus slaan met de BIIC (B aculovirus-i i nfected nsect c ellen) methode, wijzigingen (bv. verlies van het gen van belang) van het recombinante virus te voorkomen en hoge expressie behouden niveaus 16 Pellet geïnfecteerde cellen 24 uur na proliferatie arrestatie wordt waargenomen -. in dit stadium cellen bevatten volledige virale deeltjes net voordat ze zouden worden vrijgelaten (door knopvorming) in de media. Verwijder media en vries porties van de celpellet in vloeibare stikstof en opgeslagen onbeperkt. 7,16
3. Eiwit Productie en downstream processing
- Infecteren grote (re) culturen en monitoring YFP. Gebruik V 1, V 2 of bevroren BIIC hoeveelheden aan grotere celculturen voor productieruns (meestal 400 ml in 2 L flessen) infecteren. Houd u aan lage MOI regime (passen virus volume gebruikt voor infectie, die besmet cultuur verdubbelt ten minste een keer). Vergroten geïnfecteerde kweekvolumes indien nodig door het aantal kolven vermenigvuldigen. Als YFP marker-eiwit aanwezig is, trekken op bepaalde tijdstippen 1x10 6 cellen, pellet-en lyseren cellen en bewaken evolutie van de YFP signaal totdat een plateau is bereikt indicating maximum recombinant eiwitproductie. YFP niveaus kunnen worden gemeten in een standaard 96 wells plaat lezer kan opnemen fluorescentiesignalen (bijv. Tecan SPECTRAFluor). Oogst cellen in dit stadium. Store cel pellets bij -20 ° C (korte termijn) of -80 ° C (op lange termijn).
- Cellysis en fractionering. Lyse cellen door uw favoriete preferentiële techniek aangepast aan de behoeften van het eiwit (bevriezen-ontdooien, sonicatie, Franse pers, anderen). 5-7 fractioneren cytosol en kernen en test voor de aanwezigheid van de eiwitten van belang. Ontwikkel zuiveringsprotocollen basis van de resultaten eiwitzuivering vereenvoudigen. Overwegen om het weken procedures om uw proteïne halen uit de nucleaire fractie onder hoge KCl voorwaarden als je eiwitten bevinden zich in de celkern. 7,18
- Eiwitzuivering (micro-schaal, op grote schaal). Merk op dat de vaak kleine hoeveelheden (10 of 25 ml) van celkweek zijn sufficient voor het verkrijgen van cel pellets voor het zuiveren van aanzienlijke hoeveelheden van uw eiwitten van belang vanwege de doorgaans hoge of zeer hoge productieniveaus van heterologe eiwitten in het baculovirus / insectencel systemen (vaak 10-100 mg eiwit per L cultuur en meer). In combinatie met micro-zuivering (multiwellplaten, microtip methoden, GE Healthcare ÄKTAmicro systeem, anderen) is het mogelijk om biochemische en activiteitsgegevens en vaak ook voldoende hoeveelheid van de gewenste eiwitten en complexen voor nanoliter-schaal high-throughput kristallisatie (HTX verkrijgen ). Overweeg het gebruik van metalen affiniteit zuivering (Clonetech Takara TALON, Qiagen NiNTA metaalchelator harsen) en een oligo-histidine (6-10 residuen) tag op blootgestelde subeenheden van uw eiwitcomplex om zuivering te vergemakkelijken, in samenwerking met ionenwisseling en size exclusion chromatografie in kleine volumes met bijvoorbeeld de ÄKTAmicro of soortgelijk klein volume zuivering machine (figuur 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sterke co-expressie van heterologe eiwitten bereikt door MultiBac systeem wordt getoond in figuur 1d (probes die 48 uur na infectie een suspensie celkweek). De overexpressie eiwit bands zijn duidelijk waarneembaar in de gehele cel extract (SNP) en de geklaarde lysaat (SN). De kwaliteit en kwantiteit van het eiwit geproduceerd materiaal is vaak voldoende om structuurbepaling van eiwitcomplexen, zoals mitose checkpoint complex MCC figuur 1e mogelijk. 17
Figuur 2 toont de workflow van een gen assemblage experiment van robot-geassisteerde tandem recombineering (TR). Robuuste DNA assemblage protocollen waren scripted in robotica routines voor parallelized montage van multigene expressie constructen. Individuele robot stappen zijn weergegeven in snap-shots (figuur 2c, I - IV). De DNA onderdelen te assembleren met PCR gegenereerd en op kwaliteit gecontroleerde-gels (figuur 2d, links) en de gemonteerde multigene constructen eveneens goedgekeurd door PCR met specifiek ontworpen sets primers (figuur 2d, rechts) 14,15.
Recombinant baculovirus generatie en versterking volgt standard operating procedures (schematisch weergegeven in figuur 3a). Snapshots van cellen gekweekt in een monolaag worden getoond (Figuur 3b, I. & II.) Volgende infectie met een MultiBac virus.
Downstream processing van het recombinante eiwit complexen kan worden verkleind door het gebruik van multi-well plaat of micropunt gebaseerde chromatografie voor affiniteit zuivering, gevolgd door grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) van de complexen door integratie in de workflow kleinschalige systemen zoals het ÄKTAmicro (Figuur 4a). Een vertegenwoordiger SEC profiel van een factor ~ 700 kDa complex menselijke transcriptie weergegeven. Monster gezuiverd met behulpde ÄKTAmicro in kleinschalige is meestal voldoende voor de karakterisering van biochemische en biofysische middelen, waaronder elektronenmicroscopie (figuur 4b).
Figuur 1. MultiBac platform technologie voor multi-eiwitcomplex productie. (A) Genen van belang zijn in het Multibac baculovirale genoom geïntegreerd door gebruik Tn7 omzetting in combinatie met blauw / wit screening. Een loxP plaats op het virus ruggengraat maakt toevoeging van andere functies, zoals een fluorescente merker eiwit van virus prestaties en heterologe eiwitproductie volgen. (B) De baculovirus neemt een langwerpige stok vorm en wordt gekenmerkt door een flexibele enveloppe die plaatsvindt teneinde tegemoet de grote (> 130 kb) circulair dubbelstrengs DNA genoom. Grote heterologe gen inserties in het genoom worden getolereerd by verlengen van de envelop. (c) Standaard Erlenmeyer kolven op rondschudapparaat platforms kan worden gebruikt voor het kweken op grote schaal insecten celkweken voor heterologe eiwitproductie. (d) Het MultiBac systeem efficiënt produceert recombinante eiwitten die vaak zichtbaar al de hele cel extract (SNP). (e) De structuur van de mitotische checkpoint complex werd opgehelderd door röntgendiffractie van kristallen gegroeid van monster geproduceerd met de MultiBac systeem. 17 Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. (Automated) Tandem recombineering (TR). (A) Tandem recombineering maakt gebruik van kleine arrays van synthetische plasmide-DNA-moleculen genaamd en acceptoren voor het samenstellen multigene expressie constructen, eventueel in robot-ondersteunde modus met behulp van een liquid handling werk-station (rechts). (b) De TR workflow wordt getoond. SLIC staat voor volgorde en ligatie onafhankelijke klonen, Cre staat voor het Cre-LoxP fusie aaneenschakelen en acceptoren in die genen van belang zijn door het SLIC geplaatst. Multigene expressie constructen gegenereerd door deze recombineering procedure met SLIC en Cre in tandem worden vervolgens geïntegreerd in de MultiBac baculovirusgenoom en gebruikt voor kleine en grote schaal expressie in insectencellen celculturen besmet met het recombinant virus. (C) Snapshots van de robot-geassisteerde TR proces zijn vertegenwoordigd Daartoe verstrekken matrijs DNA en primers (I), de bereiding van PCR reacties in multiwellplaten (II), PCR amplificatie van DNA (III) en de bereiding van multigene constructen gekweekt in bacteriële kweek door alkalische lysis in multi-well platen ( IV). (d) PCR-producten die voor TR gevisualiseerd door onsING het e-gel systeem (links). Voltooide multigene constructen worden gevalideerd door analytische PCR-reacties geladen op een e-gel (rechts). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. MultiBac virus,-versterking, opslag. (A) De standaard procedure (SOP) van de MultiBac platform op het EMBL Grenoble wordt weergegeven in een schematische weergave. Recombinant MultiBac virus wordt geïdentificeerd door blauw-wit screening en bereid uit bacterieculturen. Initiële transfectie vindt plaats op 6-well platen geënt met monolagen van insectencellen (Sf21, Sf9, Hi5, anderen). Virus wordt versterkt en doelwit eiwit geproduceerd in Erlenmeyer shakers. Virus wordt opgeslagen door bevriezing hoeveelheden van geïnfecteerde insectencellen (BIIC). Florescence wordt opgenomen als een analytisch instrument alsYFP (of een ander fluorescerend eiwit) is opgenomen als een marker-eiwit bijvoorbeeld in de loxP plaats aanwezig is op de MultiBac baculovirale genoom. (B) Snapshots van insectencellen geïnfecteerd met MultiBac baculovirus worden getoond. De cellen stoppen prolifererende, in omvang toenemen (I.). Celfusies worden waargenomen (II). Virus ontloken uit de geïnfecteerde cellen in de media wordt opgevangen en gebruikt om grotere celculturen voor eiwitcomplex productie (III, IV) besmetten. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. Eiwitcomplex productie en down-stream processing. Proteïne complex monster kan nu al gemakkelijk worden gezuiverd van kleinschalige initiële celculturen door gebruik te maken van geminiaturiseerde zuiveringsmethoden zoals kanaalplaat of microtip-based zuivering, eventueel in combinatie met kleine hoeveelheden chromatografiesystemen (links). Vaak is de opbrengst van al deze "analytische" zuivering runs (midden) is voldoende voor het analyseren van de structuur en functie van het gezuiverde complex door een verscheidenheid van middelen, waaronder elektronenmicroscopie (rechts). hier grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Video snap-shots in figuren 2 en 3 tonen het volledige proces van robot-assisted genereren van cDNA van multigene expressieconstructen tot aan infectie van insecten celkweken voor eiwitproductie. Nieuwe reagentia (plasmiden en virussen) en robuuste protocollen zijn ontwikkeld om een pijpleiding vertrouwen op SOP inschakelen. De gehele pipeline is geïmplementeerd als een platform technologie op het EMBL in Grenoble. De MultiBac platform is toegankelijk door veel wetenschappers van universiteiten en bedrijven die betrokken zijn bij multiprotein onderzoek. De training toegang wordt ondersteund door zijn specifieke instap programma gefinancierd door de Europese Commissie (P-CUBE, BioSTRUCT-X).
De beschikbaarheid van SOP's voor het uitvoeren van eiwitcomplex expressie door het gebruik van de MultiBac systeem heeft bewezen deze technologie gemakkelijk vatbaar ook voor niet-gespecialiseerde gebruikers. Robot-geassisteerde operatie versnelt multi-eiwitcomplex dat de productie in het bijzonderular wanneer een voldoende groot aantal complexen, bijvoorbeeld varianten en mutanten van een monster van belang moeten worden gegenereerd in parallel. Echter, handmatige bediening bij lage-tot medium throughput ook sterk profiteert van de beschikbaarheid van SOP's. In onze ervaring, processen die met succes scripted zou kunnen zijn in robotica routines moest eerst worden verfijnd met een aanzienlijke inspanning tot voldoende robuust protocollen werden verkregen die compatibel zijn met behulp van een robot zijn. Dergelijke protocollen vormen de basis van onze SOP's. 5,6,14,15 Inderdaad, de uitvoering van deze robuuste protocollen voor de robot leiden tot een zeer aanzienlijke efficiencywinst ook handmatige handelingen in ons laboratorium.
Veel eiwitten en eiwitcomplexen werden en worden geproduceerd met behulp van de MultiBac systeem dat we ontwikkeld, en bijna 500 laboratoria in de wereld hebben de reagentia verkregen. MultiBac heeft gekatalyseerd onderzoek niet alleen in structurele biologie, maar ook in veel othre gebieden van life sciences die onderzoeken of de interacties tussen eiwitten in grote samenstellingen te exploiteren. MultiBac is ook gebruikt om eiwitdoelstellingen van groot farmacologisch belang, zoals virus-achtige deeltjes, die bruikbaar vaccin gegadigden kunnen worden geproduceerd. 4 Recentelijk is MultiBac ook gebruikt om genen in zoogdiercellen en celkweken of zelfs hele organismen door gentherapie. 4 We verwachten dat de aanpak zoals die geïllustreerd in deze bijdrage zal blijken nuttig te zijn voor veel gebieden van onderzoek waarbij multiprotein assemblages en complex samenspel van biologische macromoleculen die de basis van cellulaire processen in gezondheid en ziekte vormen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
IB is uitvinder op octrooien en octrooiaanvragen waarin delen van de techniek hier beschreven.
Acknowledgments
Wij danken Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond en alle vroegere en huidige leden van de Berger laboratorium voor hulp en advies. De MultiBac platform en de ontwikkeling ervan zijn en worden mede mogelijk gemaakt door financiële instanties, waaronder de Zwitserse National Science Foundation (SNSF), de Agence Nationale de Recherche (ANR) en het Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) en de Europese Commissie (EC) in kaderprogramma's (KP) 6 en 7. Steun voor transnationale toegang wordt verschaft door de EC FP7 projecten P-CUBE ( www.p-cube.eu ) en BioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). Het Franse ministerie van Wetenschap is vooral erkend voor het ondersteunen van de MultiBac platform op het EMBL via de Investissement d'Avenir project Frisbi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
- Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
- Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W.
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes. Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).
- Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
- Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).
- Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production. J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).
- Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells. J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).
- Thomas, M. C., Chiang, C. M. The general transcription machinery and general cofactors. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).
- Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N.
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).
- Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science. 288 (5466), 640-649 (2000).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).
- Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering. Nat. Protocols. , (2009).
- Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).
- Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford,
- Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a. Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).
