Summary
细胞生长速度是一个稳定的过程和细胞生理学的主要决定因素。利用恒化连续培养使细胞生长速度外在控制由营养限制有利于分子网络，控制细胞生长，以及这些网络的发展，优化细胞生长的研究。
Abstract
调节细胞响应信号来自外部世界的增长速度。随着细胞生长，不同的细胞过程必须协调包括高分子合成，代谢，最终，承担细胞分裂周期。恒化器，实验控制细胞生长速率的方法，提供了强大的系统研究手段增长率影响细胞过程如何 - 包括基因表达和新陈代谢 - 和监管网络，控制细胞生长的速度。当维持数百代恒化器可用于研究环境条件的微生物，限制细胞生长的适应性进化。我们描述了恒化培养的原则，展示他们的操作，并提供他们的各种应用的例子。经过一段时间的废用他们在二十世纪中叶引进后，基因组规模方法的收敛重新票面细胞生长和适应性进化的分子基础的监管是刺激的复兴在生物学研究中使用恒化器中。
Introduction
细胞的生长是通过复杂的相互作用的遗传和环境因素1,2的网络监管。细胞生长的多因素调控需要一个系统级的方法来研究它。然而，调节细胞生长的严格的研究是通过实验控制在哪些细胞生长率的困难挑战。此外，即使是最简单的实验条件外经常是动态的，复杂的细胞不断地改变自己的环境，因为它们繁殖。培养细胞的方法，使实验对照的细胞生长率的定义，不变的和受控制的环境：如能解决这些问题，通过恒化器提供。
连续培养中使用恒化的方法是通过独立莫诺3和诺维克和西拉德4于1950年描述。按照最初的设想，细胞生长在媒体的一个固定体积是con通过添加新的媒体和同时去除旧的媒体和细胞（ 图1）tinually稀释。耦合的常微分方程（ 图2）描述了细胞密度（x）和限制生长的营养物质在恒化器（S）的浓度变化率。重要的是，方程系统预测单（非零）稳定稳态（ 图3）具有显着的含义，在稳定状态中，细胞（ 即指数增长速率常数）的特定生长率等于速率在该培养物稀释（D）。通过改变稀释率，可以在不同的生长速度和营养限制不同条件下建立的细胞稳态的人群。
实验对照采用恒化增长率为的细胞生理变化如何理解发展的关键随着增长5,6率。然而，微生物学方法这个前主体在二十世纪后期在分子生物学研究的爆炸过程中变得越来越模糊。今天，在生长控制在这两个微生物和多细胞生物和基因组规模的方法，系统级分析的出现新的兴趣一直延续的动力为使用恒化器中。在这里，我们描述了利用精确控制细胞生长速率和外部环境，是唯一可以使用恒化器三个应用程序。首先，我们描述了使用恒化器的研究如何以十万计的生物分子的丰度 - 如成绩单和代谢物 - 是协同调控与增长速度。第二，我们将描述如何恒化器可用于取得在使用竞争实验养分有限的环境不同基因型之间生长速率的差异的精确估计。第三，我们描述了如何能恒化器可用于研究细胞在不断的营养贫乏的环境中成长的适应性进化。这些例子体现在恒化正在使细胞生长调控，基因与环境的相互作用和适应性进化系统级的调查方式。
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Protocol
可实现多种实现方式采用恒化连续培养的原则。在所有的恒化器就必须有1）方法用于保持所有组件的不育性，2）充分混合的培养，在培养容器的3）适当的通气和4）一个可靠的媒体除了和培养去除装置。在这里，我们描述了使用生物反应器SIXFORS（Infors公司）作为使用可以很容易适应替代设置方法恒化。
1。组装恒化船舶
- 打开使用主开关的SIXFORS。
- 彻底冲洗恒化器，搅拌器组件，并用去离子（DI）水连接管上。检查所有的管路和O形圈，并更换磨损件看。
- 确保驱动轴支撑基座朝上的玻璃容器中，该驱动轴的顶端卡合到其上的搅拌器组件壳体。设置stirre[R装配到玻璃容器确保驱动轴的底部被固定在驱动轴支撑。使用该夹具的搅拌器组件固定到玻璃容器中。
- 用约300毫升去离子水填满容器。
- 从溶解氧取下镜头盖（DO 2）探针和拧下底部的外壳，并确保底部的外壳充满中途与电解质溶液检查电解液液位。重新拧紧底部外壳和插入的恒化器的端口。直到拧紧的手指。
- 以一个pH探头，并从它的存储缓冲器（3米氯化钾）将其删除。移开电极帽和附加到发酵罐1。使用控制SIXFORS屏幕，导航到发酵罐参数菜单，然后选择“校准pH值”。将pH探头插入一个标准的pH值为7的缓冲并记录读数为高读。重复用pH4的缓冲并记录读数为低阅读。从发酵罐取下pH探头，洗净去离子水，将探头插入整型o在恒化器的端口。直到拧紧的手指。
- 将恒化器在机架中。注意其中发酵罐（1-6）的pH探头连接至和校准的容器上。广场上的pH探头pH探头帽。使用铝箔紧紧地盖住做2探头的顶部。
- 折叠箔过度附着在恒化器中的管的端部。
- 重复步骤1.2-1.8的所有船只。
- 通过高压灭菌他们在液体循环15分钟消毒的器皿。
2。准备媒体
- 建立浓度的营养通过种植分批培养在不同养分含量的限制范围内。养分被限制的范围内，其中的最终细胞密度为初始养分浓度（ 图4）的线性函数。以及在限制范围内选择营养浓度。与Saccharomyce研究标准介质组成物的例子酿酒酵母可在7-11。
- 高压釜是后第一确保介质管路的一端覆盖在箔封端含一个空气入口和介质出口的橡胶塞的空瓶子。
- 在一个单独的容器中制备10升介质。
- 附加的500毫升过滤杯100毫升的媒体瓶子。用无菌镊子在乙醇中取出滤棉，并立即连接到端口的过滤介质上的瓶子。
- 附加媒体大玻璃瓶到真空源和过滤器通过将其添加到过滤器杯杀菌媒体。
- 当介质过滤完成后，关闭掉端口过滤用金属钳。
3。校准做2个探头，并设立恒化
- 之后的恒化器船只已灭菌并冷却下来代替容器在其相应的热护套。连接温度探头，pH探头，和做2个探头。让与电力船坐至少6小时，让做2个探头极化。
- 将每个污水管的端部插入一个单独的收集容器。通过高压灭菌过滤器连接气源，并打开通风。在每个容器中的水应该流出的流出管，这表明所有密封件被适当地形成。
- 根据所需的工作体积（ 例如 300ml）中调整的流出管的高度。我们使用的是标有校准到不同的工作卷管安置一把尺子。
- 媒体的瓶子连接到恒化器。使用乙醇，以保持管端无菌越好。通过泵和开放钳螺纹泵管。手动按下泵，直到介质开始流入的恒化器中。从泵松开油管，媒体应该自由地流入恒化器。当媒体到达污水管，重新连接油管泵和钳。
- 启动茹与叶轮设置为400转，并设置在30℃的温度nning的基本程序
- 为了校准做2个探头，关闭气源并切换到氮气。等待至少一个小时，记录测量值作为“低读”。切换回气源（ 即含环境氧浓度），等待至少一个小时并记录测量为“高读”。
- 使用光圈软件启动数据记录。
4。接种
- 用70％乙醇消毒培养容器的顶部。
- 在容器顶部和吸管1毫升过夜培养卸下螺钉拧入恒化器。重新拧紧螺丝。
- 表明接种在虹膜的时间。
- 等待大约24小时的培养，以达到早期固定相。作为培养生长，溶解氧和pH会下降。在葡萄糖限制媒体的情况下，溶解的氧气会返回到静止帕〜100％本身。对于其他营养物质限制溶解氧仍将<100％的固定相。
5。启动泵并实现稳态
- 稀释率是通过将流量计算（多少介质流入每小时容器）由培养物体积。例如，使用300毫升的0.1的稀释率的体积意味着，加入30ml介质每隔一小时加入到培养。因为该系统是在正压力下的相同体积的容器确保培养物连续地稀释除去。稀释率（D）的范围可以使用不超过电池的最大生长速率（μ 最大 ），上面的哪些单元格将被淘汰的恒化的。
- 选择泵的设置，其中指定的秒数泵是开启和关闭的数目，以建立所需的流速。该泵以〜0.11毫升/秒的速率传送媒体。
- 定义使用整型SIXFORS程序erface指定该泵定时，温度和叶轮速度。启动该程序。
- 倒空液体的收集容器，并记录时间。
- 至少两小时后，用量筒测量多少媒体已经从容器中取出。这将等于已被添加到该恒化器容器的体积。计算稀释率（D = V 废水 / V 文化 /时间 ）。调整泵的设置，如果计算的稀释率不符合预期的稀释率。
- 在稳定状态下，在恒化器的细胞密度随时间不发生变化。这可以在不通过采样流出扰动培养来测定。我们操作性定义达到稳态的是由至少一种群体倍增分离相同细胞密度的测量。文化稀释开始后达到稳定状态大约需要8文化几代人。在稳定状态下，细胞成倍增长（ 即在营养限制条件E。固定增长 率在一段时间）。人口（生成时间）的倍增时间为LN（2）/ D。
- 继续周期性地测量流出物体积为实验的持续时间，以确保恒定的稀释率得以维持。
6。应用1：研究细胞生长以不同的速率在稳态条件
- 在恒化器的稳态，细胞群体的生长速率等于稀释率。通过系统地改变稀释率，可以以不同的速率生长的细胞。这可让随生长速率，包括细胞体积，细胞周期阶段和抗逆性生理参数的系统研究。此外，全球的mRNA，蛋白质和代谢物水平的稳定状态的访问，可以测定细胞中以不同的速度生长。有两种方法获得的样本：
- 小样本可以是被动地观测通过将污水管的端部插入一个1.5毫升或15ml试管tained。可以在几分钟内获得的1-5毫升的样品（取决于流量）。许多生理参数，可以从这些样品进行测定。
- 基因的表达，或代谢物的分析要求，必须尽可能快地获得较大的样本。将污水管的端入15ml锥形管中。松开螺丝固定的污水管的金属端推轻轻放下。一个约10毫升的样品会迅速填满你管。请记住，在恒化容器的体积发生了变化。如果许多连续抽取样本，可能有必要减少流量以维持恒定的稀释率。
7。应用二：差异增长率基因型之间受控环境中使用流式细胞仪为基础的竞争性试验的精密测量
- 恒化器可以被用来准确地量化养分浓度的影响在不同遗传背景的差异在增长率（ 即健身）。通过标记有不同的荧光蛋白共同培养的菌株的变化相对丰度在指数生长的速率是确定的。在进行这个实验在不同的稀释率（D）允许的养分浓度（S）对健身的差异影响的研究。
- 建立两个菌株在不同的恒化容器具有相同的稀释率和300毫升的容积稳态文化。
- 被动采样1毫升从每个容器。降速细胞，重新悬浮于磷酸盐缓冲盐水（PBS），并置于4℃这些样品含有同质的细胞样品，这对于随后的流式细胞分析的控制。
- 将污水管从一个容器到高压灭菌量筒。松开螺丝固定的污水管的金属端，轻轻地向下推，从恒化器排出细胞。何时量达到150毫升，污水管的金属端返回到其原始位置（300毫升）中。重复与所述第二容器中，使用不同的量筒。
- 用70％的乙醇以保持无菌，而在恒化器容器的顶部除去螺钉。将漏斗的开口，倒150毫升从其他文化融入恒化器。重新拧紧螺丝。重复与所述第二容器中，使用所述第二漏斗。每一恒化器现在包含两种菌株的混合物。
- 使用被动采样每隔2-6小时，每艘船获得1毫升样品。降速细胞，重悬于PBS中，并储存于4°C。继续服用样品2-3天仔细记录每个样品所用的时间。
- 在该实验中，声处理的结束和稀释样品至〜2×10 6个细胞/ ml。用流式细胞仪，测量两个菌株在每个样品中的比例。由于两个菌株呈几何级数增长，相对生长速率的区别是由LN的线性回归（strain1/strain2）与时间（以代测）来确定。回归的斜率为1株相对于其它的生长速率成比例的差值（ 即在健身优势）。
- 由于混合培养可能需要一些时间来达到一个新的稳定状态，早期的时间点可能会很差适合的回归。这个问题最好通过允许2-3代，以开始采样或删除早期的点是明确的离群经过前解决。相反，一旦1菌株排挤其他的数据不再有用，这些点应该被排除。
8。应用3：实验进化
- 恒化器中进行实验进化选择的突变体在营养受限的环境中提高健身。一般进行过数百代的选择。
- 建立使用应变稳态恒化培养的已知基因型（优选已知的基因组序列）和一个定义的营养限制。
- 维持适配人口的“化石记录”被动采样恒化器每2-3天，并在样品中15％的甘油储存于-80℃。
- 监测媒体水库和补充与必要的新鲜培养基中。
- 保持成倍增长的文化数百代。
- 选择板的细胞在固体琼脂平板上的一个样品完成后。经过细胞已成长为菌落，挑用牙签殖民地的一个无偏样本，克隆接种到96孔板中含有100微升的媒体的各个孔。允许克隆样生长过夜，在-80加入100μl30％甘油和存储°C。
- 通过全基因组测序，并进行表型检测包括体能评估，采用通用荧光标记的参考菌株，如申请2所描述的特征的克隆。</ LI>
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Representative Results
恒化器的主要优点是通过改变稀释率实验控制细胞的生长速度的能力。在芽殖酵母，酿酒酵母，细胞的形态是其信息在细胞分裂周期阶段。人群具有更高的生长速率包含的活跃分裂的细胞通过测量unbudded细胞的级分（ 图5A）所确定的比例较高。在恒化器培养物的全球mRNA表达的分析已经表明，许多基因的表达差异表达的生长速率（ 图5B和图5C）的函数。
不同基因型的相对适合度可通过使用荧光标记的细胞进行竞争试验在恒化器来确定和流式细胞术分析（ 图6A）。图6B示出了具有代表性的结果，其中的突变菌株是COM peted对荧光标记的野生型菌株。在这个例子中，所述突变体菌株具有每一代一个40％的速度增长的优势。相比之下，无标记的野生型菌株竞争对荧光标记的野生型菌株的生长速度并不相同。
恒化器提供发挥对细胞有明确和持续的选择压力的一种手段。全基因组序列的分析可以用于鉴定在细胞中具有增加的健身后天突变。在酵母细胞中的不同营养物有限的恒化器适应进化实验已经确定拷贝数变异作为由其中产生适应性突变频繁和重复机制。例如，在使用不同氮源中氮限制恒化器进行独立的自适应进化实验，多个拷贝数变异（CNVs中），其中包括GAP1基因进行鉴定11（ 图7）。
T“>恒化器造成一些未在其他方面的标准微生物学方法所遇到的独特挑战。潜在的问题，并具体到恒化实验解决方案可以在表1中可以找到。
图1。恒化器的示意图。的恒化器包括媒体库，泵，恒化器中，流出管，和一个收集容器。
图2。恒化器的数学模型。差分方程1描述了在细胞密度的变化（ 倍 ）在恒化器随着时间的推移，这是细胞生长和细胞去除稀释液（细胞死亡被认为是忽略不计的）的结果。莫诺提出3细胞生长（μ）依赖根据包含的最大生长速率（μmax）和一个半最大生长速率常数（K 次）的变量a米氏类型关系的外部养分浓度秒。稀释率（D）是由媒体的加法和文化的移除速率来确定。差分方程2描述变化的限制性营养物浓度（S）在恒化器的速度。在恒化器中的限制性营养物浓度的变化取决于其在流入的介质浓度（R），其稀释液通过流出（D）和消费的细胞，这是依赖于细胞参数μ 最大值 ，K s和产量不变，Y。为简化起见，Y假设为恒定在不同的生长速率。的变量，其典型单位，在加上常微分方程为x -细胞窝点性（细胞/ ml），S -限制性营养物浓度（μM），μ 最大 -最大生长速率（HR-1），K 秒 -营养浓度的增长率等于μ 最大 / 2（微米），Y -产量（细胞/毫升/微米），D -稀释率（HR-1），R -媒体水库营养浓度（μM）。
图3。方法稳定状态作为预测的数学模型。营养浓度（红色）和细胞密度（蓝色）达到非零稳定状态。
图4。建立一个营养物的限制范围。 酿酒酵母的单倍体菌株生长在不同浓度的葡萄糖，并确定最终的密度。线性关系表明，营养浓度在限制范围内。
表1中。表潜在的问题和解决方案。 
图5。细胞生理学随生长速率的恒化使生长速率和A）作为测定的细胞形态（ 即芽细胞的级分）的基础上，细胞分裂之间的关系的对照研究。的〜酵母mRNAs的25％丰度取决于增长率：例如基因B）UTR2增加表达的增长率增加两个葡萄糖（O），氮限制（Δ）恒化器和C基因）ASM1下降在表达水平的增长速度增加葡萄糖（o）和氮限定（Δ），恒化器10。 
图6。应变竞争试验中恒化器。 A）两株是由组成型表达的荧光蛋白标记的差异是共同培养在一个单一的恒化和变化的两个品系的相对丰度的比率确定采用流式细胞术：B每2-4代）的相对适合度的菌株是由拉提的自然对数（LN）的线性回归来确定Ø两菌株对时间的几代测量。 点击这里查看大图 。 
图7。在恒化器长期有效选择选择与提高健身的突变体。突变体的基因组规模的分析，确定了频繁的染色体重排和复制与增加健身的突变体数目变异（CNV）。独立的适应性进化实验中选用不同氮限制条件的结果不同的CNV等位基因在GAP1位点（灰色虚线划出），编码一般氨基酸通透。每个数据点是DNA拷贝数在演进型应变的比值与一个较使用DNA微阵列，能同时分析了每个基因（黑色）测量cestral应变。 问题 解 低pH值在培养容器中。 pH值可以被实时监测和自动加酸/碱来控制。可替换地，可以使用缓冲介质。 絮凝剂细胞和培养容器生物膜。 保持文化通过在> 400 rpm的叶轮充分混合。 生长在进纸线。 在进气口过滤器的使用降低了的介质馈送线殖的可能性。 细胞同步和稳定做2次振荡我n个碳有限恒化器。 这可避免使用较高的稀释率，避免饥饿长时间培养稀释开始之前。
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Discussion
恒化使微生物的生长控制的稳态条件下的培养。细胞在产生一个不变的外部环境的恒定速率连续地生长。这是相对于分批培养方法，其中外部环境是不断变化和细胞生长的速率由环境和基因型的复杂的相互作用决定。因此，在恒化器超过分批培养物中培养的微生物的一个主要优点是可以通过实验控制细胞的生长速率的能力。
在其中一个细胞生长的速率是包括养分传感，信号转导，大分子合成和代谢无数的细胞过程之间的相互作用的结果。与全球分析方法组合使用恒化器允许调查如何在细胞生长的影响的速率基本过程，反之细胞如何调节和协调细胞的过程与它的增长率。已经研究在野生型细胞中显示细胞浓度的RNA和蛋白质都深受细胞生长6率的影响，最近它已被证明，转录组10,12,13和代谢8顷急剧通过细胞生长速率的影响。
的突变行为在恒化器的研究提供了一个潜在的强大学习，这对于增长速度第14条重要的途径手段。使用成千上万的突变体15分子条形码的集合高通量测序现在是可行的复用这些分析能够对增长的养分有限的环境的基因要求系统的研究。应当指出，然而，的恒化器的局限性之一是，它们不解决，可以使用单细胞显微镜方法16来评估单独的细胞生长速率相关的异质性。
11,17〜20持有理解适应性进化的功能基础上的承诺。
恒化器越来越多地被用于新的研究领域包括转录动力学21,22和代谢振荡23-26的研究。他们在生态学中的应用已被证明在捕食与被捕食动力27的研究很有用。在哺乳动物细胞生长调控，及其在人类疾病损害了新的兴趣，可能会促使一回STUDY哺乳动物细胞中使用的细胞可以在停牌28被恒化器培养的。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这项工作得到了启动资金形成纽约大学的支持。我们感谢弥勒邓纳姆和马特·布劳尔谁最初开发出了利用生物反应器SIXFORS作为恒化器。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infors-HT Sixfors Chemostat | Appropriate Technical Resources, Inc. | ||
| Glass Bottle 9.5 L | Fisher Scientific | 02-887-1 | For Media Vessel and Hosing |
| Pinchcock | Fisher Scientific | 05-867 | For Media Vessel and Hosing |
| Stopper, Size 12, Green Neoprene | Cole-Palmer | EW-62991-42 | For Media Vessel and Hosing |
| Straight Connector | Cole-Palmer | EW-30703-02 | For Media Vessel and Hosing |
| General purpose ties 4 in | Fisher Scientific | NC9557052 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone Rubber | Small Parts | B000FMWTDE | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 3/8 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1Q | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 7/32 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1E | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD | McMaster-Carr | 6100K164 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD | McMaster-Carr | 6100K161 | For Media Vessel and Hosing |
| Hook Connectors | Fisher Scientific | 14-66-18Q | For Media Vessel and Hosing |
| Ratchet Clamp | Cole-Palmer | EW-06403-11 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Female | Cole-Palmer | EW-45512-34 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Male | Cole-Palmer | EW-45513-04 | For Media Vessel and Hosing |
| Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm | Fisher Scientific | MTGR05010 | For Media Vessel and Hosing |
| PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm | Fisher Scientific | NC9131037 | For Media Vessel and Hosing |
| Direct-Reading Flowtube for Air | Cole-Palmer | EW-32047-77 | For Nitrogen Gas Setup |
| Direct-Reading Flowtube for Nitrogen | Cole-Palmer | EW-32048-63 | For Nitrogen Gas Setup |
| Gas Proportioner Multitube Frames | Cole-Palmer | EW-03218-50 | For Nitrogen Gas Setup |
| Regulator, Two-Stage Analytical | Airgas | Y12-N145D580 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Adaptor, Stainless Steel | Airgas | Y99-26450 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Male Adaptor | Airgas | WES544 | For Nitrogen Gas Setup |
| Norprene Tubing | US Plastics | 57280 | For Nitrogen Gas Setup |
| Tripod Base | Cole-Palmer | EW-03218-58 | For Nitrogen Gas Setup |
| Valve Cartridges | Cole-Palmer | EW-03217-92 | For Nitrogen Gas Setup |
| Carboy 10 L | Fisher Scientific | 02-963-2A | For Media Preperation |
| Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size | Fisher Scientific | SCGP-T10-RE | For Media Preperation |
| Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size | Fisher Scientific | FB-800-100 | For Media Preperation |
| calcium chloride·2H2O | Fisher Scientific | C79-500 | Media Reagents |
| sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | Media Reagents |
| magnesium sulfate·7H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | AC424205000 | Media Reagents |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | AC423400010 | Media Reagents |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | Media Reagents |
| boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Media Reagents |
| copper sulfate·5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Media Reagents |
| potassium iodide | Sigma Aldrich | 60400 | Media Reagents |
| ferric chloride·6H2O | Fisher Scientific | I88-100 | Media Reagents |
| manganese sulfate·H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| sodium molybdate·2H2O | Sigma Aldrich | M7634 | Media Reagents |
| zinc sulfate·7H2O | Fisher Scientific | Z68-500 | Media Reagents |
| biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | Media Reagents |
| calcium pantothenate | Fisher Scientific | AC24330-1000 | Media Reagents |
| folic acid | Sigma Aldrich | F7876 | Media Reagents |
| inositol (aka myo-inositol) | Fisher Scientific | AC12226-1000 | Media Reagents |
| niacin (aka nicotinic acid) | Sigma Aldrich | N4126 | Media Reagents |
| p-aminobenzoic acid | Fisher Scientific | AC14621-2500 | Media Reagents |
| pyridoxine HCl | Sigma Aldrich | P9755 | Media Reagents |
| riboflavin | Sigma Aldrich | R4500-25G | Media Reagents |
| thiamine HCl | Fisher Scientific | BP892-100 | Media Reagents |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000-100G | Media Reagents |
| Uracil | Sigma Aldrich | U0750 | Media Reagents |
| Dextrose | Fisher Scientific | DF0155-08-5 | Media Reagents |
References
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