Summary
Il tasso di crescita delle cellule è un processo regolato e un determinante fondamentale della fisiologia cellulare. Coltura continua utilizzando chemostati consente il controllo estrinseco di crescita cellulare mediante limitazione nutritiva facilitare lo studio delle reti molecolari che controllano la crescita cellulare e come tali reti evolvono per ottimizzare la crescita cellulare.
Abstract
Le cellule regolano il loro tasso di crescita in risposta a segnali dal mondo esterno. Con la crescita della cellula, diversi processi cellulari devono essere coordinati tra cui la sintesi macromolecolare, metabolismo e infine, l'impegno per il ciclo di divisione cellulare. Il chemostato, un metodo per controllare sperimentalmente tasso di crescita cellulare, fornisce un potente mezzo di sistematicamente studiare come impatti tasso di crescita processi cellulari - tra l'espressione genica e del metabolismo - e le reti di regolazione che controllano il tasso di crescita delle cellule. Quando mantenuta per centinaia di generazioni chemostati può essere usato per studiare l'evoluzione adattativa di microbi in condizioni ambientali che limitano la crescita cellulare. Descriviamo il principio di culture chemostato, dimostriamo loro funzionamento e fornire esempi delle loro varie applicazioni. Dopo un periodo di inattività dopo la loro introduzione a metà del XX secolo, la convergenza delle metodologie genoma scala con una rinnovata nelteresse nella regolazione della crescita cellulare e la base molecolare della evoluzione adattativa è stimolare una rinascita nell'uso di chemostati nella ricerca biologica.
Introduction
La crescita delle cellule è regolata da complesse reti di interazione dei fattori genetici e ambientali 1,2. La regolazione multifattoriale della crescita cellulare richiede un approccio a livello di sistema allo studio. Tuttavia, lo studio rigoroso della crescita cellulare regolamentato è contestata dalla difficoltà di controllare sperimentalmente la velocità con cui le cellule crescono. Inoltre, anche nelle condizioni più semplici esperimenti extracellulari sono frequentemente dinamico e complesso come cellule alterano continuamente il loro ambiente mentre proliferano. Una soluzione a questi problemi è fornita dal chemostat: un metodo di coltura di cellule che consente il controllo sperimentale dei tassi di crescita delle cellule in ambienti definiti, invarianti e controllati.
Il metodo di coltura continuo utilizzando un chemostat è stato descritto in modo indipendente da Monod 3 e Novick & Szilard 4 nel 1950. Come originariamente concepito, le cellule sono coltivate in un volume fisso di supporto che è constantemente diluita con l'aggiunta di nuovi media e la rimozione simultanea di vecchi media e cellule (Figura 1). Accoppiate equazioni differenziali ordinarie (Figura 2) descrivono il tasso di variazione della densità delle cellule (x) e la concentrazione di una sostanza nutritiva (s) crescita limitativo nel recipiente chemostat. È importante sottolineare che questo sistema di equazioni prevede un unico (diverso da zero) stabile allo stato stazionario (Figura 3) con l'implicazione notevole che allo stato stazionario, il tasso di crescita specifico delle cellule (cioè il costante tasso di crescita esponenziale), è pari al tasso alla quale la coltura è diluito (D). Variando la velocità di diluizione è possibile stabilire popolazioni steady-state di cellule a tassi di crescita diversi e in diverse condizioni di scarsità di nutrienti.
Il controllo sperimentale del tasso di crescita utilizzando chemostati è stato fondamentale per lo sviluppo di una comprensione di come i cambiamenti fisiologia cellularecon tassi di crescita 5,6. Tuttavia, questo ex pilastro dei metodi microbiologici divenne sempre più oscuro durante l'esplosione nella ricerca di biologia molecolare nel corso del tardo ventesimo secolo. Oggi, rinnovato interesse nel controllo della crescita in entrambi i microbi e organismi multicellulari e l'avvento di metodi genoma scala per analisi a livello di sistema ha rinnovato motivazione per l'uso di chemostati. Qui, descriviamo tre applicazioni che capitalizzano il controllo preciso dei tassi di crescita delle cellule e l'ambiente esterno che sono unicamente possibile con chemostati. In primo luogo, si descrive l'uso di chemostati per studiare come l'abbondanza di migliaia di biomolecole - come trascrizioni e metaboliti - sono coordinatamente regolato con il tasso di crescita. In secondo luogo, si descrive come chemostati possono essere utilizzati per ottenere stime precise delle differenze di tasso di crescita tra i diversi genotipi in ambienti nutrienti limitata con esperimenti di competizione. In terzo luogo, si descrive come chemostati puòessere usato per studiare l'evoluzione adattativa di cellule che crescono in ambienti poveri di nutrienti costanti. Questi esempi esemplificano i modi in cui i chemostati stanno consentendo indagini sistemi a livello di regolazione della crescita delle cellule, geni da interazioni ambientali e l'evoluzione adattativa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Il principio di coltura continuo utilizzando un chemostat può essere realizzato in una varietà di implementazioni. In tutti chemostati è essenziale per avere 1) metodi per mantenere la sterilità di tutti i componenti, 2) una cultura ben miscelato, 3) aerazione adeguata del recipiente di coltura e 4) in modo affidabile Inoltre media e rimozione cultura. Qui, descriviamo l'uso di un bioreattore Sixfors (Infors Inc) come chemostat utilizzando metodi che possono essere facilmente adattato alle configurazioni alternative.
1. Montaggio delle navi chemostato
- Accendere i Sixfors utilizzando l'interruttore principale.
- Sciacquare accuratamente la nave chemostato, assemblaggio agitatore, e il tubo attaccato con acqua deionizzata (DI). Controllare tutti i tubi e anelli di tenuta e sostituire eventuali pezzi usurati cercando.
- Assicurarsi che la base di supporto albero motore è rivolto verso l'alto nel recipiente di vetro e che la parte superiore dell'albero motore viene agganciato nella sua sede sul gruppo agitatore. Impostare il stirreassembly r nel recipiente di vetro garantendo fondo dell'albero motore è seduto nel supporto dell'albero motore. Utilizzare il morsetto per fissare il gruppo agitatore nel recipiente di vetro.
- Riempire il serbatoio con circa 300 ml di acqua deionizzata.
- Rimuovere i tappi da un ossigeno disciolto (DO 2) sonda e controllare il livello di elettroliti svitando il carter inferiore e fare in modo che il corpo inferiore è riempita a metà con soluzione elettrolitica. Riavvitare il carter inferiore e inserire nella porta sulla nave chemostato. Avvitare fino a stringerla.
- Prendete una sonda pH e rimuoverlo dal suo buffer di memoria (3 M KCl). Rimuovere il tappo sonda pH e allegare al fermentatore 1. Utilizzando la schermata di controllo Sixfors, accedere al menu dei parametri fermentatore e selezionare "calibrare pH". Posizionare la sonda pH in un buffer standard di pH 7 e la lettura record come Alta Read. Ripetere con pH 4 e la lettura record come Low lettura. Staccare la sonda pH dal fermentatore, lavare con acqua deionizzata e inserire la sonda into la porta sulla nave chemostato. Avvitare fino a stringerla.
- Posizionare il vaso chemostato nel rack. Nota sulla nave che fermentatore (1-6) la sonda pH è stato collegato e calibrato. Mettere il tappo sonda pH sulla sonda pH. Utilizzando un foglio di coprire ermeticamente la parte superiore della sonda DO 2.
- Piegare un foglio sopra le estremità del tubo attaccato alla nave chemostato.
- Ripetere i passaggi 1,2-1,8 per tutte le navi.
- Sterilizzare i vasi da essi autoclave per 15 minuti su un ciclo liquido.
2. Preparazione del supporto
- Stabilire la gamma di limitazione delle concentrazioni di una sostanza nutritiva crescendo culture lotti in diverse concentrazioni di nutrienti. Il nutriente è limitante nell'intervallo in cui la densità cellulare finale è una funzione lineare della concentrazione iniziale di nutrienti (Figura 4). Seleziona una concentrazione di nutrienti ben all'interno della gamma di limitazione. Esempi di composizione supporti standard per studi con Saccharomyces cerevisiae sono disponibili in 7-11.
- Autoclave una damigiana vuota che viene ricoperto con un tappo di gomma contenente un ingresso e l'uscita dei media dopo la prima garantire che l'estremità del tubo supporto è coperto in un foglio.
- In un recipiente separato preparare 10 L di media.
- Attaccare una tazza di filtro da 500 ml per una bottiglia da 100 ml media. Rimuovere il filtro in cotone con una pinza sterilizzati in etanolo e collegare immediatamente alla porta filtrazione su damigiana media.
- Fissare la damigiana media per una sorgente di vuoto e filtro sterilizzare i media aggiungendo alla coppa del filtro.
- Quando la filtrazione dei media è completa, chiudere la porta di filtrazione con una fascetta di metallo.
3. Calibrazione DO 2 sonde e configurazione chemostato
- Dopo i vasi chemostato sono stati sterilizzati in autoclave e lasciato raffreddare luogo della nave nel suo corrispondente giacca calore. Collegare la sonda di temperatura, sonda pH, e DO sonda 2. Lasciate che ilnave sedersi con l'alimentazione per almeno 6 ore per consentire DO 2 sonde per polarizzare.
- Posizionare l'estremità di ogni tubo effluenti in un recipiente di raccolta separata. Collegare l'aria attraverso un filtro di autoclave e accendere il flusso d'aria. L'acqua in ogni nave deve fuoriuscire dei tubi effluenti, che indica che tutte le guarnizioni siano adeguatamente formate.
- Regolare l'altezza del tubo effluente secondo il volume di lavoro desiderata (ad esempio 300 ml). Usiamo un righello contrassegnato con posizionamenti tubo calibrato ai diversi volumi di lavoro.
- Collegare la damigiana supporto alla nave chemostato. Utilizzare etanolo al fine di mantenere le estremità del tubo sterile come possibile. Infilare il tubo della pompa attraverso la pompa e pinza aperta. Premere manualmente la pompa fin quando si inizia a fluire nel recipiente chemostat. Rilasciare il tubo dalla pompa, media dovrebbero fluire liberamente nel vaso chemostato. Quando i media raggiunge il tubo effluenti, riattaccare il tubo alla pompa e pinza.
- Inizia running il programma di base con girante impostato a 400 rpm e la temperatura impostata a 30 ° C.
- Per calibrare fare 2 sonde, spegnere alimentazione dell'aria e passare a gas azoto. Attendere almeno un'ora e registrare il valore di misura come "basso read". Tornare alla alimentazione dell'aria (ossia con concentrazione di ossigeno ambiente), attendere almeno un'ora supplementare e misura record come "high lettura".
- Avviare la registrazione dei dati utilizzando il software Iris.
4. Inoculazione
- Utilizzare etanolo al 70% per sterilizzare la parte superiore del recipiente di coltura.
- Rimuovere la vite sulla parte superiore della nave e pipetta 1 ml di una cultura durante la notte nel vaso chemostato. Stringere nuovamente la vite.
- Indicare il tempo di inoculazione in Iris.
- Attendere circa 24 ore per le culture di raggiungere presto fase stazionaria. Come la cultura cresce, ossigeno disciolto e pH diminuisce. Nel caso di mezzi di glucosio-limitante, ossigeno disciolto tornerà ~ 100% in PHA stazionariaSE. Per altre limitazioni nutrienti ossigeno disciolto rimarrà <100% in fase stazionaria.
5. Avvio Pompe e raggiungimento dello stato stazionario
- Il tasso di diluizione viene calcolata dividendo la portata (quante con fluido nel recipiente per ora) dal volume di coltura. Ad esempio, utilizzando un volume di 300 ml, un tasso di diluizione di 0,1 significa che 30 ml di supporto vengono aggiunti alla coltura ogni ora. Poiché il sistema è sotto pressione positiva lo stesso volume viene rimossa dal recipiente garantire che la cultura è continuamente diluito. Una gamma di tassi di diluizione (D) può essere usata che non superano il tasso massimo di crescita (μ max) delle cellule, oltre il quale le cellule verranno lavate fuori della chemostato.
- Scegliere le impostazioni della pompa, che specificano il numero di secondi la pompa è accesa e spenta, per stabilire la portata desiderata. La pompa fornisce supporto ad una velocità di circa 0,11 ml / sec.
- Definire un programma con l'int Sixforserface che specifica la fasatura della pompa, la temperatura e la velocità girante. Avviare il programma.
- Svuotare i recipienti di raccolta di liquido e registrare il tempo.
- Dopo almeno due ore, utilizzare un cilindro graduato per misurare quanto i media è stato rimosso dal vaso. Questo sarà uguale al volume che è stato aggiunto al recipiente chemostat. Calcolare il tasso di diluizione (D = V effluenti / V cultura / tempo). Regolare le impostazioni della pompa se il tasso di diluizione calcolato non corrisponde alla percentuale di diluizione desiderata.
- Allo stato stazionario, densità cellulare nel chemostato non cambia nel tempo. Questo può essere misurata senza perturbare la cultura campionando il deflusso. Noi definiamo operativamente il raggiungimento dello stato stazionario come misurazioni della densità delle cellule identiche che sono separati da almeno un raddoppio della popolazione. Raggiungere stato stazionario richiederà circa otto generazioni la cultura dopo l'inizio della diluizione cultura. Allo stato stazionario, le cellule crescono in modo esponenziale (i.e. tasso di crescita costante nel tempo) in condizioni di nutrienti limitato. Il tempo di raddoppio della popolazione (tempo di generazione) è ln (2) / D.
- Continua misurare periodicamente volumi di effluenti per la durata dell'esperimento per garantire che un tasso di diluizione è mantenuta costante.
6. Applicazione 1: Studiare Cells crescendo a diversi tassi in condizioni di stato stazionario
- Allo stato stazionario nel chemostato, il tasso di crescita della popolazione di cellule è pari al tasso di diluizione. Alterando sistematicamente il tasso di diluizione è possibile coltivare cellule a velocità diverse. Ciò consente lo studio sistematico di parametri fisiologici che variano con il tasso di crescita compreso il volume delle cellule, stadio del ciclo cellulare e la resistenza allo stress. Inoltre, i profili steady-state di mRNA globale, proteine e livelli dei metaboliti possono essere analizzati in cellule in crescita a ritmi diversi. Ci sono due modi per acquisire campioni:
- I piccoli campioni possono essere passivamente obmantenuta inserendo l'estremità del tubo effluente in una provetta da 1,5 ml o 15 ml. Un campione di 1-5 ml può essere ottenuta in pochi minuti (a seconda della portata). Molti parametri fisiologici possono essere misurati da questi campioni.
- Espressione genica, o metabolita analisi richiedono grandi campioni che devono essere ottenuti più rapidamente possibile. Posizionare l'estremità del tubo effluente in un tubo da 15 ml. Allentare la vite che fissa la fine del metallo del tubo effluenti e spingere delicatamente verso il basso. Un campione di 10 ~ ml sarà rapidamente riempire il vostro tubo. Tenete a mente che il volume nel recipiente chemostato è cambiato. Se vengono prese molti campioni consecutivi può essere necessario per ridurre il flusso di mantenere un tasso di diluizione costante.
7. Applicazione 2: Misura precisa delle differenze nei tassi di crescita tra i genotipi in ambienti controllati mediante saggi Concorso basati Citometria a Flusso
- Chemostati possono essere utilizzati per quantificare con precisione l'effetto della concentrazione di nutrientisulle differenze nei tassi di crescita (cioè fitness) tra i diversi background genetico. Da ceppi co-coltura marcati con proteine fluorescenti differenti il tasso di variazione relativa abbondanza durante la crescita esponenziale è determinata. L'esecuzione di questo test a diverse velocità di diluizione (D) permette lo studio degli effetti della concentrazione di nutrienti (s) sulle differenze di fitness.
- Stabilire culture stato stazionario dei due ceppi di navi chemostato separate con tassi di diluizione identici e un volume di 300 ml.
- Passivamente campione 1 ml di ciascuna nave. Spin le cellule, risospendere in tampone fosfato (PBS), e posto a 4 ° C. Questi campioni contengono campioni di cellule omogenee, che sono controlli per la successiva analisi di citometria a flusso.
- Posizionare il tubo effluenti da una nave in un cilindro graduato autoclave. Allentare la vite che fissa la fine del metallo del tubo effluenti e spingere delicatamente verso il basso per espellere le cellule dal chemostato. Quandoil volume raggiunge 150 ml, di ritorno alla fine metallo del tubo effluenti nella sua posizione originale (300 ml). Ripetere con il secondo recipiente, utilizzando un cilindro graduato differente.
- Utilizzare etanolo al 70% per mantenere la sterilità durante la rimozione vite sulla parte superiore del recipiente chemostat. Mettere imbuto in apertura e versare 150 ml dalla altra cultura nel vaso chemostato. Stringere nuovamente la vite. Ripetere con la seconda sezione, utilizzando il secondo imbuto. Ogni nave chemostato ora contiene una miscela dei due ceppi.
- Ottenere un campione di 1 ml da ogni nave con campionamento passivo ogni 2-6 ore. Spin le cellule, risospendere in PBS e conservare a 4 ° C. Continua il prelievo di campioni per 2-3 giorni con attenzione registrando il tempo di ogni campione è stato preso.
- Alla fine dell'esperimento, ultrasuoni e diluire campioni a ~ 2 x 10 6 cellule / ml. Citometria a flusso, misurare la proporzione dei due ceppi in ciascun campione. Poiché entrambi i ceppi sono in crescita esponenziale, la differenza di tasso di crescita relativa èdeterminata mediante regressione lineare di ln (strain1/strain2) contro il tempo (misurato in generazioni). La pendenza della regressione è proporzionale alla differenza nel tasso di crescita (cioè il vantaggio fitness) di un ceppo rispetto all'altro.
- Come la coltura mista può richiedere un certo tempo per raggiungere un nuovo stato stazionario, punti di tempo iniziale possono adattarsi male alla regressione. Questo problema viene risolto meglio, consentendo 2-3 generazioni che deve trascorrere prima di iniziare il campionamento o rimuovere i primi punti che sono valori anomali chiare. Invece, una volta un ceppo ha outcompeted dall'altro i dati non sono più utili e questi punti devono essere esclusi.
8. Applicazione 3: Evolution Sperimentale
- Evoluzione sperimentale eseguita in chemostati seleziona per mutanti che sono aumentati in palestra nell'ambiente di nutrienti limitato. La selezione viene generalmente eseguita su centinaia di generazioni.
- Stabilire una cultura chemostato steady-state utilizzando un ceppogenotipo di nota (e di sequenza del genoma, preferibilmente noto) e un nutriente-limite definito.
- Per mantenere un "fossile" della popolazione che adegua passivamente Campione chemostato ogni 2-3 giorni e memorizzare il campione in 15% glicerolo a -80 ° C.
- Monitorare il serbatoio media e ricostituire con mezzi freschi se necessario.
- Mantenere la coltura in crescita esponenziale per diverse centinaia di generazioni.
- Dopo il completamento della piastra di selezione di un campione di cellule su piastre di agar solido. Dopo che le cellule sono cresciute in colonie, raccogliere un campione imparziale delle colonie con stuzzicadenti e inoculare cloni in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti contenente 100 ml di media. Permettere ai campioni clonali di crescere durante la notte, aggiungere 100 ml di 30% di glicerolo e conservare in -80 ° C.
- Caratterizzare cloni per intero sequenziamento del genoma e l'esecuzione di analisi fenotipiche tra cui la valutazione di idoneità, utilizzando un ceppo di riferimento comune fluorescente, come descritto nella domanda 2. </ Li>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uno dei principali vantaggi di chemostati è la capacità di controllare la velocità di crescita delle cellule sperimentalmente variando il grado di diluizione. Nel lievito erba, Saccharomyces cerevisiae, la morfologia di una cellula è informativo della fase del ciclo di divisione cellulare. Popolazioni con tassi di crescita contengono una percentuale maggiore di divisione attivamente cellule come determinato misurando la frazione di cellule unbudded (Figura 5A). Analisi di espressione mRNA globale di culture chemostato ha mostrato che l'espressione di molti geni differenzialmente espressi in funzione del tasso di crescita (Figure 5B e Figura 5C).
L'idoneità relativo dei diversi genotipi può essere determinata eseguendo saggi di competizione in chemostati utilizzando cellule fluorescente e citofluorimetria analisi (Figura 6A). Figura 6B mostra un risultato rappresentativo in cui un ceppo mutante era com peted contro un ceppo fluorescente con tag di tipo selvatico. In questo esempio, il ceppo mutante ha un vantaggio tasso di crescita del 40% per generazione. In confronto, un ceppo di tipo selvatico senza tag gareggiato contro il fluorescente con tag ceppo di tipo selvatico non differisce nel suo tasso di crescita.
Chemostati forniscono un mezzo per esercitare una pressione selettiva definita e continua su cellule. Tutta l'analisi della sequenza del genoma può essere utilizzato per identificare mutazioni acquisite nelle cellule con aumento della fitness. Esperimenti di evoluzione adattativa in cellule di lievito in diversi nutrienti chemostati limitati hanno identificato le varianti di numero di copia come un meccanismo frequente e ripetuto da cui vengono generati mutazioni adattive. Ad esempio, in esperimenti evoluzione adattativa indipendenti eseguiti in chemostati azoto limitata utilizzando diverse fonti di azoto, numero di copie multiple varianti (CNV) che include il gene GAP1 stati identificati 11 (Figura 7).
t "> chemostati pongono alcune sfide uniche che non sono altrimenti incontrano nei metodi microbiologici standard. potenziali problemi e soluzioni specifiche per chemostato esperimenti possono essere trovati nella tabella 1.
Figura 1. Schema di un chemostat. L'chemostat comprende un serbatoio media, pompa, un vaso chemostat, un tubo effluente, e un recipiente di raccolta.
Figura 2. Modello matematico della chemostat. Equazione differenziale 1 descrive la variazione di densità cellulare (x) nel chemostat nel tempo, che è il risultato della crescita cellulare e la rimozione delle cellule mediante diluizione (morte cellulare è considerato trascurabile). Monod ha proposto 3 che la crescita cellulare (μ) dipendes sulla concentrazione dei nutrienti esterno secondo una relazione di tipo Michaelis-Menten che include le variabili di velocità massima di crescita (μ max) e una costante di velocità di crescita metà-massimale (K s). Il tasso di diluizione (D) è determinata dalla velocità di aggiunta e rimozione supporti cultura. Equazione differenziale 2 descrive il tasso di variazione della concentrazione nutriente limitante (s) nel recipiente chemostat. La variazione nella concentrazione del nutriente limitante nel recipiente chemostat dipende dalla sua concentrazione nei media affluisce (R), la sua diluizione da deflusso (D) e il consumo da parte delle cellule, che dipende dai parametri di cella μ max, K s e una resa costante, Y. Per semplificazione, Y è ipotizzata costante a tassi di crescita diversi. Le variabili, e le loro unità tipiche, nelle equazioni differenziali ordinarie accoppiate sono x - tane cellularilità (cellule / ml), s - limitare la concentrazione di nutrienti (micron), μ max - tasso di crescita massima (hr -1), K s - la concentrazione di nutrienti in cui il tasso di crescita è pari a max μ / 2 (micron), Y - resa (cellule / ml / micron), D - grado di diluizione (hr -1), R - la concentrazione di nutrienti nel serbatoio dei media (micron).
Figura 3. Approccio alla stato stazionario, come predetto dal modello matematico. Concentrazione di nutrienti (rosso) e densità delle cellule (blu) raggiungono diversi da zero stati stazionari.
Figura 4. Stabilire l'intervallo di limitazione di una sostanza nutritiva. Saccharomyces cerevisiae è stato coltivato a differenti concentrazioni di glucosio e la densità finale definito. Una relazione lineare indica che la concentrazione di nutrienti è nell'intervallo limitante.
Tabella 1. Tabella dei potenziali problemi e le soluzioni. 
Figura 5. Fisiologia cellulare varia con tasso di crescita. L'chemostat consente studi controllati del rapporto tra tasso di crescita e A) divisione cellulare come saggiata sulla base della morfologia delle cellule (cioè la frazione di cellule germogliate). L'abbondanza di ~ 25% di mRNA di lievito dipende tasso di crescita: aumenta ad esempio il gene B) UTR2 di espressione come gli aumenti dei tassi di crescita sia in glucosio (o) e (Δ) chemostati azoto limitata e il gene C) ASM1 diminuisce a livello di espressione con l'aumento dei tassi di crescita in glucosio (O) e azoto limitati (Δ) chemostati 10. 
Figura 6. Saggi di competizione Strain a chemostati. A) Due ceppi che sono differenzialmente etichettati da proteine fluorescenti costitutivamente espresse sono co-coltivate in un singolo chemostat e il tasso di variazione della abbondanza relativa dei due ceppi è determinata ogni 2-4 generazioni in citometria a flusso. B) L'idoneità relativa di un ceppo è determinato mediante regressione lineare del logaritmo naturale (ln) del ratio dei due ceppi contro il tempo misurato in generazioni. Clicca qui per ingrandire la figura . 
Figura 7. Selezione lungo termine in chemostati seleziona in modo efficiente per mutanti con maggiore fitness. Analisi del genoma scala di mutanti ha individuato riarrangiamenti cromosomici frequenti e numero di esemplari variazione (CNV) in mutanti con aumentata fitness. Independent esperimenti evoluzione adattativa in diversi azoto limitativo condizioni risultati nella selezione per i diversi alleli CNV al locus GAP1 (demarked da linee grigie tratteggiate), che codifica per la permeasi aminoacido generale. Ciascun punto di dati è il rapporto del numero di copie di DNA nel ceppo evoluto rispetto unceppo ancestrale misurata utilizzando un microarray di DNA che analizza simultaneamente ogni gene (nero). Problema Soluzione Low pH nella cultura vaso. pH può essere monitorato in tempo reale e controllata mediante aggiunta automatica di acido / base. In alternativa, possono essere utilizzati mezzi tamponati. Cellule flocculante e biofilm nella cultura nave. Tenere cultura ben mescolato eseguendo girante a> 400 rpm. La crescita in linee di alimentazione dei media. L'uso di filtri sulla bocca riduce il potenziale di colonizzazione di linee di alimentazione del supporto. Sincronizzazione cellulare e stabili DO 2 oscillazioni in carbonio chemostati limitate. Questi possono essere evitati utilizzando tassi di diluizione più elevati e di evitare lunghi periodi di digiuno prima di iniziare la diluizione cultura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chemostati permettono la coltivazione di microbi in condizioni di steady-state di crescita controllata. Le cellule crescono continuamente ad una velocità costante risultante in un ambiente esterno invariante. Questo è in contrasto con i metodi di coltura batch in cui l'ambiente esterno è in continua evoluzione e il tasso di crescita delle cellule è determinata dalla complessa interazione di ambiente e genotipo. Pertanto, un vantaggio importante di coltura microbi in chemostati oltre colture in lotti è la capacità di controllare sperimentalmente il tasso di crescita delle cellule.
Il tasso al quale una cellula cresce è il risultato delle interazioni tra processi cellulari miriade compresi sensing nutrienti, trasduzione del segnale, sintesi macromolecolare e metabolismo. Utilizzo chemostati in combinazione con metodi analitici globali permette di indagine di come il tasso di crescita impatti processi fondamentali nella cellula e viceversa come regola e coordina processo cellulare con la cellail suo tasso di crescita. Studi in cellule di tipo selvatico hanno dimostrato che le concentrazioni cellulari di RNA e proteine sono profondamente influenzati da tassi di crescita a 6 celle e più recentemente è stato dimostrato che trascrittoma 10,12,13 e metabolome 8 sono drammaticamente influenzati da tassi di crescita delle cellule.
Lo studio del comportamento mutante in chemostati fornisce una potenzialmente potente mezzo di studiare i percorsi che sono importanti per la regolazione tasso di crescita 14. Utilizzo elevato throughput sequencing delle collezioni codici a barre molecolari di migliaia di mutanti 15 è ora fattibile multiplex questi saggi consentendo studi sistematici dei requisiti genetici per la crescita in ambienti di nutrienti limitato. Va notato, tuttavia, che una delle limitazioni di chemostati è che non affrontano la sottostante eterogeneità dei tassi di crescita delle cellule individuali che possono essere valutati utilizzando i singoli metodi di microscopia cella 16.
11,17-20 mantiene la promessa di comprendere la base funzionale di evoluzione adattativa.
Chemostati sono sempre più utilizzati in nuovi settori di ricerca, tra cui lo studio delle dinamiche trascrizionali 21,22 e le oscillazioni metaboliche 23-26. La loro applicazione in ecologia si è dimostrato utile nello studio delle dinamiche preda-predatore 27. Un rinnovato interesse per la regolazione della crescita delle cellule di mammifero, e la sua compromissione nella malattia umana, può motivare un ritorno alla study di cellule di mammifero in chemostati utilizzando cellule che possono essere coltivate in sospensione 28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da start up fondi dalla New York University. Ringraziamo Maitreya Dunham e Matt Brauer che ha inizialmente sviluppato l'uso di bioreattori Sixfors come chemostati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Infors-HT Sixfors Chemostat | Appropriate Technical Resources, Inc. | ||
| Glass Bottle 9.5 L | Fisher Scientific | 02-887-1 | For Media Vessel and Hosing |
| Pinchcock | Fisher Scientific | 05-867 | For Media Vessel and Hosing |
| Stopper, Size 12, Green Neoprene | Cole-Palmer | EW-62991-42 | For Media Vessel and Hosing |
| Straight Connector | Cole-Palmer | EW-30703-02 | For Media Vessel and Hosing |
| General purpose ties 4 in | Fisher Scientific | NC9557052 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone Rubber | Small Parts | B000FMWTDE | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 3/8 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1Q | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Silicone, 7/32 in OD | Fisher Scientific | 02-587-1E | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD | McMaster-Carr | 6100K164 | For Media Vessel and Hosing |
| Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD | McMaster-Carr | 6100K161 | For Media Vessel and Hosing |
| Hook Connectors | Fisher Scientific | 14-66-18Q | For Media Vessel and Hosing |
| Ratchet Clamp | Cole-Palmer | EW-06403-11 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Female | Cole-Palmer | EW-45512-34 | For Media Vessel and Hosing |
| Luer, Male | Cole-Palmer | EW-45513-04 | For Media Vessel and Hosing |
| Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm | Fisher Scientific | MTGR05010 | For Media Vessel and Hosing |
| PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm | Fisher Scientific | NC9131037 | For Media Vessel and Hosing |
| Direct-Reading Flowtube for Air | Cole-Palmer | EW-32047-77 | For Nitrogen Gas Setup |
| Direct-Reading Flowtube for Nitrogen | Cole-Palmer | EW-32048-63 | For Nitrogen Gas Setup |
| Gas Proportioner Multitube Frames | Cole-Palmer | EW-03218-50 | For Nitrogen Gas Setup |
| Regulator, Two-Stage Analytical | Airgas | Y12-N145D580 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Adaptor, Stainless Steel | Airgas | Y99-26450 | For Nitrogen Gas Setup |
| Hose Male Adaptor | Airgas | WES544 | For Nitrogen Gas Setup |
| Norprene Tubing | US Plastics | 57280 | For Nitrogen Gas Setup |
| Tripod Base | Cole-Palmer | EW-03218-58 | For Nitrogen Gas Setup |
| Valve Cartridges | Cole-Palmer | EW-03217-92 | For Nitrogen Gas Setup |
| Carboy 10 L | Fisher Scientific | 02-963-2A | For Media Preperation |
| Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size | Fisher Scientific | SCGP-T10-RE | For Media Preperation |
| Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size | Fisher Scientific | FB-800-100 | For Media Preperation |
| calcium chloride·2H2O | Fisher Scientific | C79-500 | Media Reagents |
| sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | Media Reagents |
| magnesium sulfate·7H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | AC424205000 | Media Reagents |
| ammonium sulfate | Fisher Scientific | AC423400010 | Media Reagents |
| potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541 | Media Reagents |
| boric acid | Sigma Aldrich | B6768 | Media Reagents |
| copper sulfate·5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Media Reagents |
| potassium iodide | Sigma Aldrich | 60400 | Media Reagents |
| ferric chloride·6H2O | Fisher Scientific | I88-100 | Media Reagents |
| manganese sulfate·H2O | Sigma Aldrich | 230391 | Media Reagents |
| sodium molybdate·2H2O | Sigma Aldrich | M7634 | Media Reagents |
| zinc sulfate·7H2O | Fisher Scientific | Z68-500 | Media Reagents |
| biotin | Fisher Scientific | BP232-1 | Media Reagents |
| calcium pantothenate | Fisher Scientific | AC24330-1000 | Media Reagents |
| folic acid | Sigma Aldrich | F7876 | Media Reagents |
| inositol (aka myo-inositol) | Fisher Scientific | AC12226-1000 | Media Reagents |
| niacin (aka nicotinic acid) | Sigma Aldrich | N4126 | Media Reagents |
| p-aminobenzoic acid | Fisher Scientific | AC14621-2500 | Media Reagents |
| pyridoxine HCl | Sigma Aldrich | P9755 | Media Reagents |
| riboflavin | Sigma Aldrich | R4500-25G | Media Reagents |
| thiamine HCl | Fisher Scientific | BP892-100 | Media Reagents |
| Leucine | Sigma Aldrich | L8000-100G | Media Reagents |
| Uracil | Sigma Aldrich | U0750 | Media Reagents |
| Dextrose | Fisher Scientific | DF0155-08-5 | Media Reagents |
References
- Ingraham, J. L., Maaloe, O., Neidhardt, F. C. Growth of the Bacterial Cell. , Sinauer Associates, Inc. (1983).
- Cell Growth: Control of Cell Size. Hall, M. N., Raff, M. C., Thomas, G. , CSHL Press. (2004).
- Monod, J. La technique de culture continue, theorie et applications. Ann. Inst. Pasteur. 79, 390-410 (1950).
- Novick, A., Szilard, L.
- Kjeldgaard, N. O., Maaloe, O., Schaechter, M. The transition between different physiological states during balanced growth of Salmonella typhimurium. J. Gen. Microbiol. 19, 607-616 (1958).
- Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Control of macromolecular synthesis. , W.A. Benjamin. (1966).
- Saldanha, A. J., Brauer, M. J., Botstein, D. Nutritional Homeostasis in Batch and Steady-State. Culture of Yeast. Mol. Biol. Cell. 15, 4089-4104 (2004).
- Boer, V. M., Crutchfield, C. A., Bradley, P. H., Botstein, D., Rabinowitz, J. D. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Mol. Biol. Cell. 21, 198-211 (2010).
- Boer, V. M., de Winde, J. H., Pronk, J. T., Piper, M. D. The genome-wide transcriptional responses of Saccharomyces cerevisiae grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. J. Biol. Chem. 278, 3265-3274 (2003).
- Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Mol. Biol. Cell. 19, 352-367 (2008).
- Gresham, D., et al. Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18551-18556 (2010).
- Regenberg, B., et al. Growth-rate regulated genes have profound impact on interpretation of transcriptome profiling in Saccharomyces cerevisiae. Genome Biol. 7, R107 (2006).
- Castrillo, J. I., et al. Growth control of the eukaryote cell: a systems biology study in yeast. J. Biol. 6, 4 (2007).
- Cipollina, C., et al. Revisiting the role of yeast Sfp1 in ribosome biogenesis and cell size control: a chemostat study. Microbiology. 154, 337-346 (2008).
- Gresham, D., et al. System-level analysis of genes and functions affecting survival during nutrient starvation in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 187, 299-317 (2011).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS Biol. 10, e1001325 (2012).
- Kao, K. C., Sherlock, G. Molecular characterization of clonal interference during adaptive evolution in asexual populations of Saccharomyces cerevisiae. Nat. Genet. 40, 1499-1504 (2008).
- Gresham, D., et al. The repertoire and dynamics of evolutionary adaptations to controlled nutrient-limited environments in yeast. PLoS Genet. 4, e1000303 (2008).
- Wenger, J. W., et al. Hunger Artists: Yeast Adapted to Carbon Limitation Show Trade-Offs under Carbon Sufficiency. PLoS Genet. 7, e1002202 (2011).
- Dunham, M. J., et al. Characteristic genome rearrangements in experimental evolution of Saccharomyces cerevisiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 16144-16149 (2002).
- Ronen, M., Botstein, D. Transcriptional response of steady-state yeast cultures to transient perturbations in carbon source. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 389-394 (2006).
- Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Mol. Sys. Biol. 2, 49 (2006).
- Tu, B. P., Kudlicki, A., Rowicka, M., McKnight, S. L. Logic of the yeast metabolic cycle: temporal compartmentalization of cellular processes. Science. 310, 1152-1158 (2005).
- Tzur, A., Kafri, R., LeBleu, V. S., Lahav, G., Kirschner, M. W. Cell Growth and Size Homeostasis in Proliferating Animal Cells. Science. 325, 167-171 (2009).
- Conlon, I., Raff, M.
- Conlon, I. J., Dunn, G. A., Mudge, A. W., Raff, M. C.
- Fussmann, G. F., Ellner, S. P., Shertzer, K. W., Hairston, N. G. Crossing the hopf bifurcation in a live predator-prey system. Science. 290, 1358-1360 (2000).
- Cohen, E. P., Eagle, H. A simplified chemostat for the growth of mammalian cells: characteristics of cell growth in continuous culture. J. Exp. Med. 113, 467-474 (1961).
