Summary
I microRNA hanno un ruolo significativo nella struttura del cervello e la funzione. Qui si descrive un metodo per far rispettare miRNA ippocampale iper-espressione utilizzando l'iniezione stereotassica di lentivirus ingegnerizzati miRNA che esprimono. Questo approccio può servire come un modo relativamente rapido per valutare l'
Abstract
I microRNA (miRNA) sono piccoli regolatori a singolo filamento molecole di RNA lunghi circa 22 nucleotidi che possono ogni bersaglio numerosi trascritti di mRNA e dim un'intera espressione genica percorso di distruzione che induce e / o traduzione inibizione di questi obiettivi. Molti miRNA giocano un ruolo chiave nel mantenimento struttura e la funzione neuronale e nelle funzioni cerebrali di livello superiore, e si cercano metodi per manipolare i loro livelli per esplorare queste funzioni. Qui vi presentiamo un diretto metodo in vivo per esaminare le conseguenze cognitive di miRNA vigenti in eccesso nei topi tramite iniezione stereotassica di particelle virali miRNA-codifica. In particolare, l'attuale protocollo prevede l'iniezione nella regione CA1 dell'ippocampo, che contribuisce al consolidamento dei mammiferi memoria, l'apprendimento, e le risposte allo stress, e offre un comodo sito di iniezione. Le coordinate sono misurate in base al bregma mouse e perfusione virus viene digitalmente controllata e mantenuta molto lento.Dopo l'iniezione, la ferita chirurgia è sigillato e gli animali recuperare. Lentivirus codificante silenziatori dei corrispondenti obiettivi di mRNA servono a coinvolgere l'interazione miRNA / target specifico responsabile per l'effetto osservato, con topi naive, topi iniettati con soluzione salina e topi iniettati con vettori lentivirus "vuoti" come controlli. Un mese dopo l'iniezione, gli animali sono esaminati nel labirinto ad acqua di Morris (MWM) per valutare il loro apprendimento di navigazione e capacità di memoria. Il MWM è un serbatoio rotondo riempito con acqua colorata con una piccola piattaforma sommersa 1 cm sotto la superficie dell'acqua. Costanti segnali visivi di tutto il serbatoio consentono la navigazione spaziale (il suono e il campo magnetico terrestre può anche aiutare gli animali in navigazione). Monitoraggio videocamera consente la misurazione del percorso della nuotata e il tempo per trovare e ammonterà la piattaforma. Il mouse viene prima insegnato che il montaggio della piattaforma nascosta offre una via di fuga dal nuoto forzato; viene poi testato per l'utilizzo di questa fuga e fzialmente, la piattaforma viene rimosso e test sonda esaminare se il mouse si ricorda la sua posizione precedente. Prove ripetute su più giorni consecutivi evidenziano migliori prestazioni di topi testati a latenze più brevi per trovare e montare la piattaforma, e percorsi come più diretta per raggiungere la piattaforma o la sua posizione. La mancata presentazione di tale miglioramento rappresenta apprendimento e di memoria e / o ansia, che possono poi essere testati specificamente (ad esempio nel elevated plus maze). Questo approccio consente la convalida dei miRNA specifici e le trascrizioni di destinazione nel cognitivo studiato e / o dei processi legati allo stress.
Introduction
Il ruolo di particolari microRNA nel funzionamento del sistema nervoso è stata recentemente contestata da iniezione lentiviral in diversi studi. MiRNAs sono stati trovati ad essere cruciale per il mantenimento e ri-modellare la struttura delle sinapsi 1, 2 sinaptogenesi e rimodellamento delle sinapsi e manutenzione 3. Questi studi suggeriscono fortemente che miRNAs sono impegnate, tramite effetti regolatori pluristratificato sia nella sagomatura e nel mantenere l'uscita principale del sistema nervoso, funzione cognitiva. Iniezione stereotassica di lentivirus particelle in regioni specifiche del cervello dei roditori permette la ricerca di alterazioni nella morfologia delle sinapsi e l'attività neuronale, ed è stato utilizzato per stabilire il significato funzionale di trascrizioni over-espressa 4,5. Infezione diretta dei neuroni di aree cerebrali ben definite con i miRNA che esprimono lentivirus può essere implicato in studi di invecchiamento, disturbi cerebrali e neurodegenerazione; Studi di miRNAs nel regno del regolamento comportamentale 6-8 sono in uno stato molto meno avanzato, e l'iniezione stereotassica di miRNA che esprimono particelle lentivirus seguiti da test comportamentali può essere utile a tale scopo. Un metodo molto più laborioso per indurre sovra-o sotto-espressione comporta geneticamente knock-in o topi knockout. Sistemi genetici possono permettere ulteriormente per controllo condizionale e temporale sulla espressione (ad es Cre-Lox, sistemi Tet), ma questi difficilmente offrono la specificità spaziale della procedura di iniezione e non vi è quasi sempre una certa quantità di leakiness. Inoltre, le procedure di ingegneria non richiedono intervento chirurgico e può essere impiegato in laboratori con relativamente buona riproducibilità, tuttavia, essi sono più lenti e richiedono molto più manodopera e risorse finanziarie. Inoltre, il controllo temporale del sotto-espressione in topi iniettati sovra o è molto più preciso rispetto ai topi geneticamente ingegnerizzati.
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Protocol
1. Lentivirus Preparazione
- Crescere le cellule HEK-293FT al 90% di confluenza.
- Il giorno del cambiamento transfezione cellulare per mezzo privo di siero DMEM supplementato con 1 mM di glutammina e 50 mg / ml di penicillina-streptomicina.
- Co-trasfezione delle cellule con un vettore pLKO.1-Puro e con plasmidi codificanti per il delta R8.2 e VSV-G porzioni e il miRNA di interesse, utilizzando 10 ml di 1 mg / ml polyethylenimine come un vettore 9.
- Raccogliere lentivirus confezionati in 24 ore e 48 ore dopo la trasfezione, filtro attraverso il filtro di 0,45 micron.
- Concentrare i lentivirus con ultracentrifugazione a 70.000 xg, per 2 ore e 15 ° C, aliquota e conservare a -70 ° C.
- Virus Misura titolo di infettare le cellule HEK-293T con preparazioni di virus diluito in serie (da 1 a 10 -6 ml di vettore per pozzetto). Il titolo risultante (un minimo di ~ 1 × 10 9 particelle infettive per ml è raccomandato) viene valutata per l'espressione del gene di interesse, utilizzando la selezione puromicina e quantificando GFP che esprimono i virus attraverso il conteggio delle cellule fluorescenti.
Per il protocollo più dettagliata di preparazione lentivirus vedi 10.
2. Preparazione Animali di Chirurgia
- Chirurghi abito dovrebbe includere camice chirurgico, guanti sterili, cappuccio e maschera.
- Pesare l'animale, poi anestetizzare con un IP-iniezione di una miscela di ketamina, con il volume proporzionale al peso animale come specificato per ogni farmaco. Per una miscela di ketamina / Xilazina, una dose di 80-200 mg / kg di ketamina e 7-20 mg / kg xylazina è di solito utilizzato per i topi.
- Attendere fino a quando l'animale è completamente anestetizzato, quindi controllare per mancanza di ritiro riflesso nel dell'arto posteriore dell'animale, estendendo l'arto e poi premendo con il dito.
- Iniettare l'animale per via sottocutanea con Rimadyl, come specificato sulla confezione, per alleviare il dolore. Range tipico dosaggio per Rymadil è 5-10 mg.
- Posto l'animale su una piastra elettrica per mantenere una temperatura corporea costante e inumidire gli occhi con unguento.
- Radere l'area tra le due orecchie con una macchina di rifilatura.
- Disinfettare la cute con Betadine.
3. L'esposizione del teschio e Perforazioni
- Posto l'animale all'interno del stereotact regolando le aste in fessure appena anteriormente al orecchio dell'animale.
- Utilizzare un bisturi per fare un'incisione anteriore-posteriore di circa 1,5 cm tra le orecchie e tenerla aperta con fascette di chirurgia (serfines).
- Pulire la superficie del cranio con un tampone di cotone fino all'incrocio tra la sutura coronale e suture sagittali; cioè il bregma e l'intersezione tra le suture coronale e lambdoidea; cioè lambda, sono visibili.
- Puntare la punta della siringa, tenuto dal stereotact, al punto bregma, in tutti e tre gli assi. Annotare le coordinate. Questo punto sarebbe considerato quale zero Point in tutti e tre gli assi.
- Sollevare la siringa in verticale in modo che un movimento planare non graffiare il cranio e muovere la testa siringa nella posizione corretta. Iniezioni CA1 ippocampali richiedono le seguenti coordinate rispetto al bregma in mm: -2 sull'asse anteriore / posteriore, ± 1,8 a all'asse laterale / mediale e -1.5 sull'asse dorsale / ventrale.
- Abbassare la punta della siringa fino a toccare il cranio e segnare il punto con un pennarello. Rimuovere la siringa indietro per evitare accoltellamento.
- Praticare un foro poco profondo, solo nelle ossa cranio con un bel trapano. Tenere il trapano costante in modo che non avrebbe continuato a forare la parte inferiore dei tessuti molli. È possibile evitare questo stabilizzando una mano con l'altra e con la perforazione in brevi impulsi.
4. Iniezione della Lentivirus
- Prelevare 0,5 ml della soluzione concentrata lentivirus.
- Posizionare la siringa sopra il foro e lentamente abbassare verticalmente fino Reaches la superficie del cranio. Continuare ad abbassare la siringa nel cervello molto lentamente. A questo punto qualche sanguinamento può verificarsi che non indica necessariamente una penetrazione fallito. Se si verifica sanguinamento asciugare il tutto con un tampone di cotone.
- Impostare la pompa digitale a 0,02 ml / min (0,5 microlitri verrebbe iniettato in 25 min) e iniziare l'infusione. Lenta infusione permette efficace la diffusione del virus nei tessuti e previene il riflusso. In alcuni tipi di siringa prendere in considerazione l'inserimento della siringa per una maggiore profondità di 0,5 mm prima di ritirarsi alle coordinate originali e infondere.
- Dopo completato l'infusione attesa delle ulteriori 5 minuti per consentire al materiale di diffondere nel cervello anziché ritirandosi nel canale formato dalla siringa.
- Rimuovere la siringa molto lentamente e guardare per i flussi di ritorno. Se si osserva un flusso indietro a questo punto, una frazione del materiale iniettato era probabilmente persa.
5. Ferita di tenuta e di recupero
- Seal The avvolto con Histoacryl. Essere sicuri di evitare perdite di Histoacryl negli occhi.
- Iniettare la via intraperitoneale animale (IP) con 1 ml di soluzione fisiologica pre-riscaldato, per evitare la disidratazione.
- Posizionare l'animale in una gabbia di recupero che è posizionato su un pad riscaldato. Guarda l'animale mentre recupera per un'altra ora.
In caso di perdita di peso, inappetenza, dovrebbe essere eseguita debolezza / incapacità di ottenere mangimi o acqua, stato moribondo o infezione, eutanasia dell'animale. Metodi accettabili per l'eutanasia di roditori sono barbiturici, anestetici inalatori, CO 2, CO, o il cloruro di potassio in combinazione con l'anestesia generale.
Dopo 4 a 6 settimane, valutare la memoria di navigazione dell'animale è valutata nel labirinto ad acqua di Morris. Il lentivirus di solito infettare maggior parte delle cellule all'interno della sfera di iniezione.
6. La valutazione del comportamento nel labirinto ad acqua di Morris
- Addestrare gli animali in Mgiaggiolo Water Maze. Per la formazione esatta e protocollo di collaudo vedere 11. Dopo ogni prova, asciugare l'animale con un panno asciutto, sostituirla nella sua gabbia e rinfrescare l'acqua nel serbatoio.
- Testare gli animali nel labirinto ad acqua di Morris per 3 giorni consecutivi, 4 prove ogni giorno. Inserire ogni giorno l'animale nel labirinto in ciascuna delle 4 direzioni del labirinto (nord, sud, est e ovest) in un ordine che cambia, per esempio un giorno: est-ovest-nord-sud, giorno due: ovest-sud -nord-est. Pulire gli animali dopo ogni prova.
- Durante la prova prove in pista l'animale con un sistema di tracciamento come il sistema di inseguimento Noldus.
- Dopo il processo di test 12 °, inserire l'animale nel serbatoio dell'acqua senza la piattaforma per un minuto. Questo potrebbe essere utilizzato per analizzare la strategia di ricerca che l'animale sta prendendo.
- Analizzare i dati come suggerito in 12.
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Representative Results
Iniezione di 0,5 microlitri lentivirus nella regione CA1 nell'ippocampo topo, con il tasso di flusso indicato nella sezione del protocollo produce una sfera infetto di circa 1 mm nell'asse rostrale-caudale, e circa 0,5 mm in mediale-laterale e anteriore -posteriore assi (Figura 3).
Figura 1. Punto bregma e apparato di iniezione. (A) indicata è una mappa schematica del bregma (coronale e sagittale suture intersezione) e Lambda (lambdoid e suture sagittale intersezione), come si è visto dopo aver eseguito l'incisione. (B) Immagine raffigurante i principali componenti meccanici dell'apparato stereotassico.
Figura 2. Lentivirus pComponenti RINCIPALI. L'lentivirus include componenti che consentono resistenza agli antibiotici (Ampiciline, Amp R), un gene reporter (GFP), 5 'e 3' ripetizioni terminali lunghe (LTR) per l'effettiva integrazione e l'espressione del virus e il gene di interesse (miRNA).
Figura 3. Sito di iniezione ed in vivo Lentivirus trasfezione. (A) sito di iniezione in base al mouse atlante. Iniezione è diretto alla regione CA1 dell'ippocampo. (B) GFP quantificazione in unità arbitrarie (misura normalizzata della quantità di 'verde' visto in ogni campo) lungo 11 fette, ognuno di 40 micron di spessore, in asse rostrale-caudale. (C, d, e ed f). Campi specifici per le posizioni indicate sulgrafico in b. DAPI colorazione in rosso e in verde GFP. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 4. Valutazione del comportamento di topi nel MWM. (A) latenza media per trovare la piattaforma nascosta per topi iniettati con lentivirus che esprimono un miRNA specifico (designato miR-X in figura, cerchi rossi, n = 10) e topi iniettati con la corsa che esprime lentivirus (triangoli verdi, n = 10). Barre di errore rappresentano SEM. ANOVA P-value <0.05. (B) traiettorie rappresentativi dell'ultimo processo per i due gruppi. (C) Media distanza in 30 minuti in campo aperto per topi iniettati con i miR esprimendo lentivirus testato (verde), rimescolare lentivirus che esprimono (rosso) e gli animali non-iniettati (blu). Nessuna differenza nell'attività locomozione globale è stato identificato (ANOVA P> 0,1). (D) traiettorie rappresentativi di topi di ogni gruppo a (c).
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Discussion
Iniezione stereotassica di lentivirus è un metodo relativamente rapido per la valutazione in vivo sia per il down-regolazione dei geni e miRNA diversi up-o. L'alternativa principale è un topo geneticamente modificato che è una tecnica consuma molto più laboriosa e poi iniezione diretta lentivirus. Inoltre, il regolamento su, a iniezione lentivirus, si verifica in un momento specifico nel topo adulto e non prevede alcuna possibilità di leakiness durante lo sviluppo, come è il caso più frequente nei topi geneticamente ingegnerizzati che includono il controllo temporale. Controllo temporale completo è essenziale per valutare la pertinenza di diversi geni in malattie neurodegenerative in cui l'alterata regolazione avviene in ritardo nella vita dell'animale. Inoltre, l'iniezione lentivirus offre controllo spaziale preciso che, di nuovo, è soggetto ad una certa quantità di leakiness nei sistemi geneticamente. I sistemi di ingegneria del mouse utilizzano il endogeneNous specificità di diversi fattori di trascrizione con l'aggiunta di un inserto di un promotore specifico che sarebbe attivato solo in una certa regione o tipo cellulare. In confronto, le iniezioni lentivirus possono essere limitate nello spazio senza cambiare il vettore. Gli svantaggi di iniezione lentivirus sono il requisito per una procedura chirurgica laborioso e discutibile riproducibilità tra laboratori. Dopo l'intervento chirurgico di iniezione, un periodo di tempo, tra una settimana e tre settimane deve passare per il virus di indurre il suo effetto e per l'animale di recuperare, prima protocolli possono essere ottimizzati quali valutazioni comportamentali e biochimici. Per gli studi in cui il tempo di induzione deve essere in stretta vicinanza alle diverse valutazioni del lentivirus iniettata può includere un sistema di controllo temporale, come il sistema Cre-Lox, e antibiotici possono essere utilizzati in un caso come l'induttore lungo dopo l' animale completamente recuperato. Questa tecnica è stata presentata in 13. Per quanto riguarda reproducibility tra le iniezioni, i gruppi che eseguono questo metodo di routine hanno mostrato una Targeting abbastanza riproducibile e la consegna del materiale iniettato tra gli animali 13. La riproducibilità tra laboratori è una questione che richiede grande attenzione, dal momento che diversi laboratori usano siringhe diverse, diversi tipi di siringa (bordo smussato o taglienti), e le diverse portate, che colpiscono la sfera iniezione risultante. In entrambi i metodi possa verificare un effetto posizionale dovuto al sito di integrazione genomica. Nella linea transgenica la conseguenza sarebbe silenziamento genico in tutta la linea. Nella popolazione iniettato lentivirus, d'altro canto, l'effetto sarebbe limitato a un piccolo sottoinsieme della popolazione. La combinazione di esperimenti miR insieme con shRNA esperimenti in vivo in grado di mettere in luce la specificità degli effetti di una certa miR sul suo target 6,8. Infine, l'iniezione lentivirus può essere utilizzato in un topo transgenico knockdown per testare un effetto knock-in in una specificaregione del cervello ic e servire per una perdita di funzione / salvataggio di esperimenti di funzione.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal Edmond e Lily Safra Center for Brain Sciences (SB fellowship), The Heritage Biomedical Science Partnership Program Legacy of the Israel Science Foundation (Grant No. 378/11, per HS) e la Fondazione israeliana tedesca per Scientifica Ricerca e sviluppo (GIF) (Grant No. 1093-32.2/2010, a HS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Rodent weigh scale | Burtons (UK) | 115-455 | |
| heating pad | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| trimming machine | Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Scalpel and blades | Kent scientific | INS500348 | |
| Harland syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| driller | Stoelting | 51449 | |
| digital pump | Harvard apparatus | 704507 | |
| Water tank and platform | Stoelting | 60135 | |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | 3055503 | |
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer animal health | 24751 | |
| moisture ointment - Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| saline | Sigma Aldrich | D8662 | |
References
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