Summary
四肢肌肉收缩和被动的机械性能的变化是重要的肌肉疾病的生物标志物。这手稿描述生理检测，以测量这些特性在小鼠趾长伸肌和胫骨前的肌肉。
Abstract
身体运动主要是由骨骼肌的机械功能。骨骼肌是由众多的护套肌肉结缔组织的肌纤维束。每个肌纤维包含许多的肌原纤维，沿其长度的肌纤维纵向运行。肌原纤维，是肌肉的收缩装置的，它们是由被称为肌节的反复收缩单位。一个肌节单元包含的Z盘和肌联蛋白的蛋白质的肌动蛋白和肌球蛋白丝间隔。骨骼肌的机械功能是由肌肉的收缩和被动特性定义。收缩性能进行了表征肌肉收缩，肌肉松弛产生的力量和时间的过程中产生的力的大小。影响肌肉收缩（如肌动蛋白和肌球蛋白丝，钙稳态的，ATP / ADP比值等之间的相互作用）的任何因素，影响收缩properties。被动的属性是指弹性和粘性性能（刚度和粘度）的肌肉在收缩的情况下。确定这些属性是由细胞外和细胞内的结构部件（如titin的）和结缔组织（主要由胶原）1-2。收缩和被动性的肌肉功能是不可分割的两个方面。例如，是通过屈肘的肌肉收缩的前室的上臂和在后室的上臂的肌肉被动伸展。为了真正地了解肌肉功能，收缩和被动性质进行研究。
肌肉的收缩和/或被动的力学性能，经常会损害在肌肉疾病。一个很好的例子是杜氏肌营养不良症（DMD），严重的肌肉萎缩疾病引起的抗肌萎缩蛋白的不足3。抗肌萎缩蛋白是一种细胞骨架蛋白A在稳定肌细胞膜（肌膜），肌肉收缩时的4。在的情况下，肌营养不良蛋白，肌膜损坏力的传递过程中产生的剪切力。此的膜撕裂启动连锁反应，导致肌肉细胞的死亡和损失的收缩机械。作为结果，减少肌肉力量和死肌纤维所取代的纤维化组织5。这以后的变化会增加肌肉僵硬6。这些变化的精确测量提供了重要的指导作用，以评估疾病进展，并确定新基因/细胞/药物干预的治疗效果。在这里，我们提出了两种方法来评估趾长伸肌（EDL）的肌肉和胫骨前肌（TA）肌肉的收缩性能的收缩和被动的机械性能。
Protocol
1。评价的收缩和被动的EDL肌体外的属性
EDL肌肉的收缩和被动性质的测量前体内体外肌肉测试系统中使用的极光科学。请参考表1的材料和设备。
1.1设备准备
- 组装组织器官浴通过的oxytube固定到水套的组织浴中。将组装的浴到肌肉的安装装置。连接气体管线到oxytube。水循环线固定到水套的组织浴中，并放置在针入熔池排水阀。
- 开启循环水浴中，并调整温度至30℃7。允许5 PSI（磅每平方英寸）的95％O 2 -5％CO 2通过oxytube流动。填写浴林格氏缓冲。至少平衡缓冲10分钟以稳定的气体流量的通过调整oxytube阀。
- 开启工具（刺激，双模式控制杆系统，和信号接口）。根据制造商的指示，加载动态的肌肉控制（DMC）软件。
1.2 EDL肌肉解剖
所有的动物研究机构动物管理和使用委员会的批准。
- 麻醉的小鼠腹腔注射2.5微升/ g体重的麻醉剂的鸡尾酒（参考材料部分）。在整个手术过程中，被检查的深度镇静进行掐脚趾。 10％的初始麻醉剂量给药时，需要保持动物在麻醉状态下的补充。刮后肢。身体核心温度保持在37°C之前，解剖过程通过将鼠标上的一个加热垫。通过不断测量直肠TEMPERAT的监测体温尤尔使用热探测器。
- 将鼠标置于仰卧在夹层板（ 图1）。剥离腿部皮肤暴露的后肢肌肉。 Sylgard的块中使用了两个裁缝销，股薄肌的脚和其他固定的腿。鼠标本体上方放置一个热灯保持核心体温在37℃。不断superfuse所有外露的肌肉林格氏缓冲。通过真空线，沥干多余的缓冲。
- 暴露在立体显微镜下解剖脚的皮肤对远端的TA肌腱和韧带伸。轻轻地取出筋膜覆盖的TA肌肉。切伸韧带，到释放远端TA的肌腱。
- 把远端的TA的肌腱和使用它的TA肌肉剥离。小心地取出TA在其近侧附着的肌肉。将一块薄薄的林格氏缓冲液浸湿的棉EDL肌肉吸收的TA肌肉血管破裂出血引起的。使用真空线，以除去多余的缓冲液和血液。
- 配合双方结然后使用面包丝线缝合在肌腱结（MTJ）（ 图2）的前端的EDL肌由一个环结。在远侧部的近端EDL肌暴露股二头肌做一个切口。重复结（ 图2）相同的一组在近端的EDL肌腱的MTJ。将杠杆臂钩的近侧或远侧结使用相同的缝合线与双平结。切断剩余的缝合线。
- 切优越的的近端缝合打结的近端EDL肌腱。抬起EDL肌肉的钩子和切下的血管的肌肉。把EDL肌肉的后肢远端缝合打结删除远端EDL肌腱逊色。与林格氏缓冲液浸湿的棉片覆盖外露的后肢。
- 将钩杆臂。垂直对齐的肌肉在两个电极之间。固定的的远端缝合线固定后。抬起组织浴淹没的肌肉，林格氏缓冲。使用双粗/细翻译阶段调整至1.0g的静息张力，并允许肌肉平衡至少10分钟。
1.3测量的EDL肌肉的收缩和被动性
使用表2中的参数设置的DMC的每个下面的测量软件。使用肌肉的动态分析仪（DMA）软件分析数据。
1.3.1测量的EDL肌肉的收缩性能
- 刺激的EDL肌肉三次在150Hz与相距60秒，以稳定的肌肉8。
- 在不同的休息紧张刺激的EDL肌肉，以确定最佳的长度（LO）。的最佳长度是在该肌肉的最大收缩张力的长度。允许的肌肉，2分钟，放松身心。
- 调整至芦静息张力。在单一的刺激，测量肌肉力量。确定的绝对抽搐力（PT），峰值张力（TPT），半舒张时间（½RT）的Pt。 2分钟使肌肉放松。
- 调整至芦静息张力。测量强直肌肉力量，产生不同的刺激频率（50，80，100，120，150和200赫兹）。确定的绝对最大强直肌肉力量（PO）肌肉力量达到最大。测量TPT和半RT宝9。
- 让肌肉放松5分钟。调整至芦静息张力。应用10个周期的离心收缩周期之间休息2分钟。每个周期的离心收缩后，计算出相对的宝力损失。
- 分离设备和EDL肌肉，减少肌腱的缝合部位。确定肌湿重，计算肌肉剖面积（CSA）6,10。
1.3.2测量的无源特性的EDL肌
- 对侧EDL肌肉解剖，并将其附加的装置，如第1.2节中描述的步骤2至7。
- 主题EDL肌肉一个六步的拉伸协议，其中的肌肉紧张到160％罗与罗10％的增量。分析的应力-应变曲线6。
- 通过测量在以下时间帧的应力松弛率（SRR）的拉伸后，保持在10％罗肌肉评估粘性特性的EDL肌：从峰值到0.1秒后的峰（峰峰值），从0.1到0.2秒从0.2到0.5秒的页，页，从0.5至1秒pp和从1到1.5秒的页。
- 在研究结束时，安乐死颈椎脱位和/或斩首的鼠标时，鼠标仍然在麻醉状态下。分离设备和EDL肌肉，减少肌腱的缝合部位。确定肌湿重，计算交叉本身的肌肉ctional面积（CSA）6，10。
2。 原位的TA肌肉的收缩性能的评价
肌肉原位测试系统采用极光科学的TA肌肉的收缩性能。请参考表1的材料和设备。
2.1设备准备
- 升温至37°C的热控制的动物阶段使用的循环水浴中。
- 开启工具（刺激，双模式控制杆系统，和信号接口）。根据制造商的指示，装入DMC软件。
2.2的TA肌肉原位测力
- 麻醉鼠标，刮胡子的后肢和第1.2节中所描述的步骤1至3的TA肌肉暴露。
- 打一个双平结髌骨周围的韧带USI毫微克的面包丝线缝合。配合的前端TA肌肉的MTJ（ 图2）由一个环结双平结，然后，配合使用相同的缝合线从远侧TA肌腱结留下〜10 mm的环路的另一双平结。将所述第二侧循环的双平结。
- 删除的管脚的后肢和定位的动物容易。公开的股二头肌。做一个切口，在中线透露坐骨神经。打一个双平结的坐骨神经周围的近端。修剪缝合线的一侧，并切断神经优于结。轻轻地，拉坐骨神经向膝盖缝合线，并清除周围的结缔组织免费〜5毫米的长度。不要在此过程中，舒展神经，Ringer缓冲，不断superfuse神经。
- 准备对侧TA的肌肉中所描述的步骤1至3。量的一个暴露的后肢的Ri用一块NGER的缓冲液中浸泡的棉花。预温（37°C）林格氏缓冲液，同时不断superfuse后肢。在真空中去除多余的缓冲线。
- 定位的动物平台上的动物容易。将膝盖夹紧支架的动物平台，并确保两个膝盖髌骨韧带缝合线与双平方海里的金属针。 Sylgard的块中使用的裁缝针引脚双脚。固定在的动物平台上的热控制的阶段。热灯定位保持动物芯体温度在37℃下
- 固定电极支架的动物平台，奠定了坐骨神经上的电极使用的缝合线。保持电极远离后肢肌肉。把裸露的后肢远端的TA肌腱的在MTJ缝合网站。附加的前端TA肌腱的缝合线套环，以该杆臂钩。一个温暖的林格氏缓冲液浸湿的棉，覆盖外露的后肢肌肉。
- 使用表2中的参数设置DMC软件。按照第1.3.1节中描述的相同的协议来确定的TA肌肉的收缩性能。使用的DMA软件分析数据。
- 收缩特性测量后，分离的远端TA，肌腱缝合环矫平机臂钩。删除的TA肌肉。确定肌湿重，计算CSA 10。
- 测量对侧TA肌肉的收缩性能，根据上述的步骤1至3。在研究结束时根据机构的指导方针，实施安乐死的鼠标。
Representative Results
下面的结果是从我们以前的报告6,9表示。数据表示为平均值±标准误差的平均值， 表3示出了在正常的BL10和肌营养不良蛋白缺失的小鼠（MDX）在4至6个月的年龄的EDL肌肉的形态性质的图4示出了代表性的收缩和被动特性的EDL BL10 和 mdx小鼠的肌肉。以下条款，包括具体的（绝对力量除以通过的CSA）的抽动力（ 图4A），具体的最大强直收缩力（ 图4B），TPT和半RT的绝对最大强直收缩力的EDL肌的收缩性能（ 图4C和 D）。 TPT和½，RT也可以被计算出绝对的抽搐力。的应力-应变曲线（ 图4E）和SRR（ 图4F）重新用于描述的EDL肌肉的被动特性。
缺乏抗肌萎缩蛋白的收缩和被动的EDL肌6,9的性能有显着的影响。具体的抽搐和MDX EDL肌强直收缩力显着减少。 TPT是显着更快，而½RT是显着慢于对 mdx EDL肌肉。的应力-应变曲线表明，刚度显着增加的 mdx EDL肌。 MDX EDL肌肉也产生了显著高得多的抵抗力量（被动压力）达到峰值应力前，后的应力峰值下降得更快。另外，在SRR显着较高的 mdx EDL肌相比的BL10 EDL肌肉。
统计分析
由学生t检验分析两组之间的统计意义。对于s在多个组中，单向或双向ANOVA分析，Bonferroni法事后分析tatistical意义，建议使用SAS软件（SAS公司，卡里，NC）。差异被认为是显着的， 当 p <0.05。
表1。材料和设备。
| 实验 | 静息张力（克） | 脉冲频率（Hz） | 脉冲宽度（ms） | 刺激持续时间（ms） | 拉伸长度 | 拉伸持续时间（ms） | 伸长率 | 评论 |
| 1。收缩和被动的EDL肌体外的性能评价 | ||||||||
| 1.3.1测量的EDL肌肉的收缩性能 | ||||||||
| 1。热身 | 1.0 | 150 | 0.2 | 300 | 休息的肌肉，刺激的60秒之间。这些初步的强直收缩的肌肉后面进行的测量稳定。 | |||
| 2。最佳肌肉长度（LO） | 0.5，1.0，1.5和2.0 | 1 | 0.2 | 300 | 让肌肉放松每一个刺激的30秒之间。使用数字卡尺测量肌肉的最佳长度。 | |||
| 3。单TWITCH力（PT） | 罗静息张力调整 | 1 | 0.2 | 300 | ||||
| 4。强直肌肉力量 | 罗静息张力调整 | 50，80，100，120，150和200的 | 0.2 | 300 | 1分钟之间刺激使肌肉放松。确定的频率产生的最大绝对强直收缩力（PO）。 | |||
| 5。离心收缩 | 罗静息张力调整 | 使用的频率产生的最大强直收缩力（宝） | 0.2 | 700 | 10％劳 | 最后的刺激持续时间为200 ms | 0.5桢/秒 | 10个周期与周期之间休息2分钟，重复离心收缩。 |
| 6。 CSA的EDL肌 | CSA =（肌肉质量（g）/ [1.06克/厘米3×（罗×0.44）]，1.06克/厘米3，是肌肉的密度和0.44是EDL肌纤维长度至Lo比。 | |||||||
| 1.3.2测量的无源特性的EDL肌 | ||||||||
| 1。六步拉伸协议 | 罗静息张力调整 | 10％劳 | 2厘米/秒 | 重复拉伸协议，增量罗的10％至160％，罗达到。帆都鼓满1.5秒之间舒展周期。 | ||||
| 2。 SRR | 罗静息张力调整 | 10％劳 | 2厘米/秒 | SSR的计算方法是将不同的应力与TIME经过两个时间点之间的时间框架。 | ||||
| 2.3测量的TA肌肉的收缩性能 | ||||||||
| 1。热身 | 4.0 | 150 | 0.2 | 300 | 休息的肌肉，刺激的60秒之间。 | |||
| 2。最佳肌肉长度（LO） | 3.0，4.0，5.0，6.0和7.0 | 1 | 0.2 | 300 | 让肌肉放松每一个刺激的30秒之间。使用数字卡尺测量肌肉的最佳长度。 | |||
| 3。 CSA的TA肌肉 | CSA =（肌肉质量（g）/ [1.06克/厘米3×（LO×0.6）]。0.6的TA肌肉纤维长度罗岭蒂奥。 | |||||||
表2中。参数的EDL和TA的肌肉的机械性能的评价。
| 应变 | 年龄（月） | 车身重量（g） | EDL的重量（mg） | EDL罗（毫米） | ：EDL CSA（毫米2） |
| BL10 | 6 | 32.03±0.57 | 13.90±0.77 | 14.09±0.04 | 2.12±0.12 |
| MDX | 6 | 35.44±0.42 * | 16.73±0.42 * | 13.93±0.05 * | 2.57±0.07 * |
表3中。的EDL肌肉的形态性质的*，该值在的mdx小鼠年龄匹配的BL10小鼠显着不同。
图1。示意图的定制鼠标夹层板的夹层板是由一个半英寸厚的有机玻璃制作的机构店。 点击此处查看大图 。
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图2。一系列的数字图像显示的步骤追平了双平结，然后在MTJ由一个环结。星号，EDL肌肉，箭，远端肌腱EDL肌肉。
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图3。定制的平台， 在原位 TA肌肉功能分析示意图的。有机玻璃动物，平台和的不锈钢膝盖持有人被设计为安装在原位鼠标装置的809B，不锈钢棒（MPR-2.0猫锡斯基尤，Grants Pass，俄勒冈），通用电极支架（猫＃MXB，锡斯基尤，Grants Pass，俄勒冈）;§，电极附件棒（猫MPR-3.0，锡斯基尤，Grants Pass，俄勒冈）; Sylgard的块。 点击这里查看大图 。
图4。代表性结果的EDL肌的收缩特性的EDL肌的收缩和被动特性。 其特征在于具体抽搐力（A），具体强直动力（B），峰值张力（C）和半弛豫时间（D）的时间。由应力 - 应变档案中（E）和SSR的被评估的EDL肌肉的被动特性。 *，，mdx小鼠有显着不同的年龄相匹配的BL10小鼠。
Discussion
在这个协议中，我们已经说明了生理实验测量EDL肌肉的收缩性能的TA肌肉的收缩和被动属性。肌肉生理学研究的一个主要问题是目标肌肉的氧合。对于大的肌肉（如的TA肌肉）， 在原位方法是优选的，因为氧的扩散从林格氏缓冲液可能不会达到在一个中心的肌肉在体外测定。 在原位的方法并没有扰乱正常血液供给和缺氧-相关的人工的效果是可以避免的。的EDL肌肉的生理学研究中最常用的肌肉之一。可以实现在体外系统足够的氧的整个肌肉，因为小规模的肌肉。另外， 在体外系统中，提供了一个封闭的环境，来操纵的离子的浓度（的Ca 2 +，Na +和K +）和化学CALS（ATP和葡萄糖）是必要的以获得最佳的肌肉力产生。这提供了一个很好的机会来研究这些变量的影响力生产。
四肢肌肉的收缩和被动性质的准确测量是研究骨骼肌功能的关键。这些属性的变化特点通常被认为是各种肌肉疾病的标志。这些参数的变化也很重要的指标，以确定是否一个实验性的治疗是有效的或不。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持国家机构的健康（AR-49419，DD），肌肉萎缩症协会（DD），美国国立卫生研究院，培训津贴T90DK70105（CH）的补助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue-organ bath | Radnoti LLC, CA, USA | Water-jacket tissue bath (Cat #158351-LL), Oxygen disperser tube (Cat #160192), Luer valve (Cat#120722) | |
| Circulating water bath | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
| Gas mix | Airgas National, Charlotte, NC, USA | 95% O2 and 5% CO2 | |
| In vitro muscle function assay apparatus |  Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada |
The system consists of a stimulator (Model# 701A), a dual-mode lever system (Model#300C or 305C), a signal interface (Model # 604B) and a test apparatus (Model# 800A) to vertically mount tissue organ bath | |
| In vitro muscle function assay software | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada |
Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | |
| Mouse anesthesia cocktail mixed in 0.9% NaCl | Refer to the institutional guidelines | Ketamine (25 mg/ml), xylazine (2.5 mg/ml) and acepromazine (0.5 mg/ml). Throughout the surgical procedure, a supplement of 10 % of the initial dose may be needed to keep animal under anesthesia. | |
| Sylgard | World Precision Instrument | Cat#SYLG184 | |
| A custom-made Plexiglas dissection board | In house designed | Refer to Figure 1 | |
| Heating lamp | Tensor Lighting Company, Boston, MA, USA | 15 Watt lamp to keep the mouse warm during dissection | |
| Ringer's Buffer | Chemicals are purchased from Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Composition in mM: 1.2 NaH2PO4 (Cat#S369) , 1 MgSO4 (Cat# M63), 4.83 KCl (Cat# P217), 137 NaCl (Cat# 217), 24 NaHCO3 (Cat# S233), 2 CaCl2 (Cat #C79) and 10 glucose (Cat# D16). Dissolve chemicals individually and mix in the order listed above. Store at 4 °C. | |
| Stereo dissecting microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Dissection tools | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | Coarse forceps, coarse scissors, fine forceps (Straight and 45 ° angle) | |
| Braided silk suture #4-0 | SofSilk USSC Sutures, Norwalk, CT, USA | Cat # SP116 | |
| A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | 2'' long S/S 304V (0.18'' diameter) for force transducer 305C or 2.5'' long S/S 304V (0.012'' diameter) for transducer 300C (Cat# ASTM A313) | |
| In situ muscle function assay system | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada |
The system (809B, in situ mouse apparatus) consist of a stimulator (Model# 701B), a dual-mode lever system (Model# 305C), a signal interface (Model# 604A) and a thermo controlled footplate apparatus (Model# 809A) | |
| In vitro muscle function assay software | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada |
Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | |
| A custom-made TA assay animal platform | In house designed | Refer to Figure 2 | |
| A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | Cat# ASTM A313 | 0.5'' long S/S 304V (0.18'' diameter) |
| Custom-made 25G platinum electrodes | Chalgren Enterprises, Gilroy,CA | Solder two 0.016'' thick platinum wires to two 24G electric wires | |
Table 1. Materials and equipment. |
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References
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