Summary
Biz yenidoğan subventricular dilimi elektroporasyon olarak adlandırılan minimal invaziv tekniği göstermek. Tekniği yenidoğan yavruların lateral ventriküllerin içine plazmid DNA enjekte ve sunmak için elektrik akımı uygulayarak oluşur ve genetik nöral kök hücreleri manipüle
Abstract
Nöral kök hücreler (NSC'lerde) hattı postnatal lateral ventriküllerin ve nöronlar, astrositler ve ependimal hücreleri 1 dahil olduğu birden fazla hücre tipleri yol açmaktadır. Moleküler MGK kendini yenileme, bağlılık sorumlu yollar ve farklılaşma anlama sokmak beyin onarım ve iyi merkezi sinir sistemi bozuklukları anlamak için eşsiz potansiyeli açısından son derece önemlidir. Memeli sistemlerin manipülasyon için Önceki yöntemler tüm hayvan 2 düzeyinde genetik mühendisliğinin zaman alıcı ve pahalı bir çaba gereklidir. Böylece, çalışmaların büyük çoğunluğu in vitro ya da omurgasız NSC moleküllerin fonksiyonlarının inceledik.
Burada, neonatal subventrikuler alanin (SVZ) elektroporasyon olarak ifade edilir neonatal NPC işlemek için basit ve hızlı bir teknik göstermektedir. Benzer teknikler embriyonik NSC'lerde çalışmak için bir on yıl önce geliştirilen ve cortica çalışmalar yardım etmişl geliştirme 3,4. Daha yakın zamanda bu postnatal kemirgen ön beyin 5-7 incelemek için kullanılmıştır. Bu teknik SVZ NSC'lerde ve yavrularının sağlam etiketleme sonuçlar. Böylece, postnatal SVZ elektroporasyon memeli MGK genetik mühendisliği için bir maliyet ve zaman etkin bir alternatif sunuyor.
Protocol
Bu prosedür Yale IACUC gereklerine uygun olduğunu. Bilim adamları IACUC kuralları kendi kurumsal ihtiyaçlarına göre onaylanmış ve takip edildiğinden emin olun.
1. Bölüm 1. DNA, Çözümler ve Cam Pipetler hazırlanması
- Yüksek saflıkta (OD 260/280> 1.80) yüksek konsantrasyon (mg / ul> 2.5) endotoksin-serbest DNA oluşturun.
- Bir 22 mikron filtre ile% 0.9 salin solüsyonu ve steril filtre hazırlayın.
- Sıra 10 cm yangın parlatılmış borosilikat cam kapiller tüplerin (OD: 1.5 mm, ID: 1.10 mm) Model bir kanthal tel ile PP-830 Narishige PC-10 cam pipet çektirmenin içine. 70.5 de bir adım ağırlıklı çekme ° C'ye çektirme ayarlayın Dairesel forseps ile ipuçları kırın ve tırtıklı kenarları için bir diseksiyon mikroskop altında inceleyin. 15 dakika boyunca bir UV lamba altında Bevel ipuçları ve yer. Çekilir pipet uç kenarından 2 mm işaretlenmiş olması gerekmektedir.
- Ağırlık / hacim fast green soluti% 0,1 hazırlayınkuru fast green ile karıştırma filtrelenmiş steril% 0.9 salin solüsyonu ile ilgili.
2. Bölüm 2. Hayvan Hazırlama, Cam Pipet Yükleme ve Plazmid Enjeksiyon
- Bir cam Petri 4 önceden soğutulmuş üzerine, kafesleri 0-1 yavrular ayrı postnatal gün yer Kaldır ° C, ve sonra ıslak buz üzerinde bir yer.
- Yaklaşık 5 dakika sonra, ayak kıskı tepki kullanılarak anestezisi durumunu belirler. Intraventriküler enjeksiyonu hiçbir hareket meydana gelirse, konu yavrular.
- Hızlı yeşil, DNA ve salin solüsyonu kombinasyonu hızlı buharlaşma, kristalizasyon ve cam pipetler abluka neden olabilir dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle, bir stok solüsyonu ve enjeksiyon hemen önce parafilm üzerine kısım 1-2 ul oluşturur.
- Çekti cam pipet ile tüm aliquoted hacmi aspire.
- Başparmak ve az dominant elin işaret parmağı arasında yavru başkanı tutun.
- Lamba açmad sadece ışık huzmesinin dışında yavru kafa tutmak. Gerekirse, yavru yansıyan ışık miktarını azaltmak için baş salin koydu. Ventriküller şimdi yanmalıdır.
- Sizin baskın el ile (Şekil 1A ve 1B) en yakın lateral ventrikül içine iğne takın. Enjeksiyon sitesi sutura lambdoidea'nın göz ve sutur lateral 2 mm yaklaşık olarak eşit mesafede olmalıdır. Takın lateral ventrikül içine girmesi gereken, P0 yavru için 2 mm işaretine pipet çekti. Tesadüfen, kafa içi basınç sürümünden pipet içine BOS dolum geri görebilirsiniz. Plazmid enjeksiyon asistleri kafa içi basıncı azaltmak için, pup.Step 2.8 başınızın üzerine kavrama gevşetin. Bir hava basınçlı enjektör (Picospritzer, Parker) kullanarak lateral ventrikül içine plazmid yaklaşık 0,5 mikrolitre enjekte edilir.
3. Bölüm 3. Elektroporasyon ve Kurtarma
- Set 5 kare bakliyat, 950 msn aralıklarla 100 voltta 50 msn / darbe için elektroporasyon jeneratör voltajının. Plazmid elektroporasyon mekansal özgüllüğü yük transferinin yönü tarafından belirlenir. Yakın ilgi SVZ 8 boyunca kök hücre popülasyonlarının heterojenliği verilen yerleşim verilmelidir. Çoğalması ve hücre kaderinin oranıfarkları ventral-dorsal ve rostral-kaudal yerle 9,10 için tespit edilmiştir.
- Bir kez plazmid daldırma cımbız elektrotlar PBS içine enjekte edilir. Bu adım yük transferi maksimize etmek ve rezistivite kaynaklanan yanıklar önlemektir.
- Plazmid enjeksiyon sitesi (Şekil 1C ve 1D) ipsilateral kulağınıza yakın yavru dorsal lateral duvara pozitif elektrot yerleştirin. Yavrunun burnu ile kontralateral hemisferde ventral yanal üzerindeki negatif elektrot yerleştirin.
- Darbe ayaklar basarak cari transfer başlatıncadı dorsalden ~ 25 ° açı aralıkları kullanılarak lateral elektrotlar pedal ve süpürme.
- Sıra 5 dk için ısıtma pedi üzerine yavrular electroporated. Yavaşça hafif stimülasyon ile yavrular her 30 sn döndürün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cımbız elektrot "süpürme" hareketi (Şekil 1E) takiben dorsal, dorsal lateral ve lateral subventricular bölgesi ile mücavir neredeyse tüm radyal glia ve etiketleme Yenidoğan subventricular dilimi elektroporasyon sonuçlar. Ancak, elektroporasyon ilgili deney şartı uyarlanmış ancak elektrot süpürme ve video ayrıntılı olarak belirli yerleşimi ve yönlendirme kullanarak değil olabilir. Dorsal lokalize radyal glia bu astar ventrikülün lateral bölümünde farklı yana Örneğin, biri sadece tek bir bölgede 9,10 elektroporasyonu seçebilir. Daha fazla spesifisite da daha küçük elektrotlar kullanılarak verilebilir.
Plazmid DNA hızla ilk üç hafta 11 içinde seyreltilir. Bu nedenle, plazmid DNA kullanılarak tespit genomik değiştirilmiş hücreler tavsiye edilmez. Bu sınırlama aşmak için, CRE Rekombinaz ifade eden plasmidler introd edilmektediryukarı bir genomik ifade floresan proteini (tdTomato) 12 lox P siteleri ile çevrili bir durak sırası var farelere GFP ile birlikte uced. Rekombinasyon sonra, durdurma sekans kaldırılır ve floresan protein (Şekil 1F) ifade edilir. Daha birçok tdTomato pozitif hücreler görülür ise dört hafta sonrası elektroporasyon birkaç GFP plazmid salgılayan hücrelerin subventricular bölgesinde görülür. Bu tdTomato ifade hücrelere göre, çok daha az GFP ifade hücreleri mevcut olduğu da açıktır koku ampul kesit üzerine, ancak hem olgun granül hücreleri özellikleri (Şekil 1G) almış.
Şekil 1. Yenidoğan subventricular Bölgesi Elektroporasyon. Bir (A) şematikBeyin omurilik sıvısı (çamurcun) içeren ventriküler sistem ve omurilik ile yavru P0-P1 (Yeşil) plazmid kodlama gelişmiş GFP (eGFP) enjekte vurgulanır. (B) Koronal kesit enjeksiyon yeri ve lateral ventriküle göre kürekler yönünü gösteren. (C) . (-) negatif Oryantasyon. yavru aşağıdaki elektroporasyon yavru enjekte (D) Yatay görünümde XYZ eksenine göre (+) pozitif elektrot bir eGFP kodlama vektör lateral ventrikül 24 saat aşağıdaki elektroporasyon (E) Görüntü (Yeşil). 28 gün CRE elektroporasyon sonra lateral ventrikül (F) Görüntü Rekombinaz ve tdTomato upstream bir stop kodonu taşıyan farelere eGFP kodlama plazmidler. Rekombinasyon tdTomato (Kırmızı) ifadesi indükler. Genomik ifade tdTomato oysa kalan birkaç eGFP SVZ pozitif hücrelerde plasmid ardışık olarak dilüsyonları kalıcı olarak ifade edilir. (G)Plazmid DNA (yeşil) seyreltilmesi koku ampul granül hücre tabakası daha hücrelerinin genomik işaretleyici, tdTomato (kırmızı) ifade verilen açıktır. LV: Lateral ventrikül; OB: koku ampul. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada ayrıntılı yenidoğan SVZ elektroporasyon tekniği, hızlı ve güçlü bir etiket ve SVZ kök hücre ve yavrularının işlemek için bir tekniktir. Elektroporasyon için diğer teknikler ile karşılaştırıldığında, sahip olduğu birkaç avantajı vardır. İlk olarak, hücrelerin odak etiketleme göz önüne alındığında, tek hücre ve otonom olmayan hücre otonom etkilerini ayırt edebilir. Indüklenebilir sistemleri kullanarak İkincisi, genetik manipülasyon birini önce veya sinaptik entegrasyon sonra etkilerini karşılaştırmak için izin verir. Ayrıca, bir loxP bölgelerini içeren bir plazmid ile CRE ifade fareler electroporating birden fazla plazmidin kullanılması atlayabilir. Dördüncü olarak, gen haberci plazmid transkripsiyonel transaktivasyon incelemek için kullanılabilir. Bu durumda, transkripsiyonel aktivite sadece manipüle hücrelerde ölçülebilir; alt bölgelerini microdissected olduğunda ilave özgüllük sokulabilir. Beşinci olarak, geçici sürekli çoğalması nedeniyle nakliye yükseltici hücre etiketleme ve seyreltme of plazmid timidin analoglan 11 ile etiketleme için benzer "birthdating" yöntemi olarak kullanılabilir. Hücrelerin geçici etiketleme bir dezavantaj olarak görülebilir rağmen Altıncı olarak, bu teknik genomik entegrasyon 13 indüklemek için transposase-transpozon çiftleri için müsait olması gerekmektedir. Alternatif olarak, devam eden nöron loxP siteleri 7,11 çevrili allelleri içeren farelerde genomik değişiklik ikna etmek CRE Rekombinaz ile değiştirilebilir. Bu protokolü kullanarak, yenidoğan nöronlar durağı kaset loxP siteleri 12 çevrili olduğu Rosa26R-Stop-tdTomato farelerde dört ay sonrası elektroporasyon kadar belirlenmiştir. Birlikte ele alındığında, yenidoğan SVZ elektroporasyon geçici veya kalıcı genetik manipülasyon ve önbeyin nöral kök hücreler ve yenidoğan nöron etiketleme için uygun maliyetli ve zaman verimli minimal invaziv bir araçtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar yapmak için hiçbir açıklama yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Savunma Bakanlığı (Fikir geliştirme ödülü, W81XWH-10-1-0041, AB), CT Kök hücre hibe (AB) ve Sağlık NRSA 10.668.225 (DMF) Ulusal Enstitüsü bağışları ile desteklenmiştir. Mevcut malzeme kısmen Connecticut Kök Hücre Araştırma Hibeler Programı kapsamında Connecticut Eyaleti tarafından desteklenen çalışmaya dayanır. İçeriğinde sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Connecticut, Connecticut veya CT Yeniliklerin Devlet Halk Sağlığı Bölümü Devletin resmi görüşlerini temsil etmemektedir, Inc fon, veri toplama çalışması tasarım herhangi bir rolü vardı ve analiz, yayınlamak kararı veya yazının hazırlanması.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heavy Polished Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | BF150-110-10 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10H | |
| Fast Green | Fischer Scientific | 0521192205 | |
| ECM 830 Square Wave Pulse generator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Tungsten Halogen lamp | USHIO America, Inc | 1002247 | |
| Picospritzer II | Parker Instruments | 052-0312-900 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64 (2011).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, Suppl 1. i120-i125 (2009).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883 (2008).
- Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13 (2011).
- de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
- Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380 (2012).
