Summary
Citrobacter rodentium संक्रमण अंत्र बैक्टीरिया संक्रमण का अध्ययन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से चूहों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और कोलाइटिस की मेजबानी के लिए एक मूल्यवान मॉडल प्रदान करता है. यह प्रोटोकॉल बाधा अखंडता, रोगज़नक़ लोड और histological क्षति murine संक्रामक बृहदांत्रशोथ रोगज़नक़ और मेजबान योगदान की पूरी तरह से लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है की माप की रूपरेखा.
Abstract
इस प्रोटोकॉल संक्रामक रोग और कोलाइटिस के एक मजबूत मॉडल का निर्माण करने के लिए आवश्यक कदम है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से करने के लिए चूहों में Citrobacter rodentium संक्रमण विशेषताएँ तरीकों का इस्तेमाल किया रूपरेखा सी.. rodentium एक ग्राम नकारात्मक, murine विशिष्ट जीवाणु रोगज़नक़ कि निकट चिकित्सकीय महत्वपूर्ण मानव रोगज़नक़ों enteropathogenic ई. से संबंधित है enterohemorrhagic और ई. कोलाई कोलाई. सी. के साथ संक्रमण होने पर rodentium, असुरक्षित चूहों मामूली और क्षणिक वजन घटाने और दस्त से पीड़ित हैं. Histologically, आंतों तहखाना बढ़ाव, प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ, और जाम सेल रिक्तीकरण मनाया जाता है. संक्रमण की निकासी 3 से 4 सप्ताह के बाद हासिल की है. आंतों उपकला बाधा अखंडता, जीवाणु लोड, संक्रमण के बाद अलग - अलग समय बिंदुओं पर और histological क्षति के मापन, माउस संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील उपभेदों के लक्षण वर्णन अनुमति देते हैं.
डाह तंत्रजो बैक्टीरियल रोगज़नक़ों अपने मेजबान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विशिष्ट मेजबान प्रतिक्रिया है कि इस तरह के संक्रमण के खिलाफ की रक्षा के आंत्र पथ उपनिवेश खराब समझ रहे हैं. इसलिए सी. आंतों का जीवाणु संक्रमण के rodentium मॉडल इन प्रक्रियाओं के बारे में हमारी समझ में सहायता करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण के रूप में कार्य करता है. आंत्र जीवाणु भी सूजन आंत्र रोग (IBDs) से जोड़ा गया है. यह धारणा रही है कि maladaptive IBD रोगियों में जीर्ण सूजन देखा प्रतिक्रियाओं आंतों mucosal प्रतिरक्षा प्रणाली के असामान्य अंत्र बैक्टीरिया के लिए जोखिम के बाद आनुवंशिक रूप से अतिसंवेदनशील व्यक्तियों में विकसित. इसलिए, संक्रामक बृहदांत्रशोथ के मॉडल का अध्ययन संभावित परिभाषित अंत्र बैक्टीरिया रोगजनक मेजबान प्रतिक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण क्षमता प्रदान करता है सी.. rodentium प्रेरित बृहदांत्रशोथ कि अंत्र बैक्टीरिया को मेजबान प्रतिक्रियाओं के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, IBD रोगजनन के संभावित तंत्र के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाने के एक ऐसे दुर्लभ मॉडल है;उपन्यास preventative और चिकित्सीय उपचार के विकास में आवश्यक है.
Introduction
अंत्र बैक्टीरियल रोगज़नक़ों द्वारा संक्रमण गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (GI) सूजन, साथ ही आंतों विकृति और pathophysiology दस्त और आंतों उपकला बाधा शिथिलता सहित, चलाता है. डाह तंत्र है जिसके द्वारा बैक्टीरियल रोगज़नक़ों उनके मेजबान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विशिष्ट मेजबान प्रतिक्रिया है कि इस तरह के संक्रमण के खिलाफ की रक्षा के सैनिक पथ उपनिवेश खराब समझ रहे हैं, लेकिन हाल के अग्रिमों अंत्र जीवाणु संक्रमण के मॉडलिंग में इन प्रक्रियाओं के बारे में हमारी समझ के लिए सहायता करने के लिए शुरू कर दिया है. आंत्र जीवाणु भी सूजन आंत्र रोग (IBDs) से जोड़ा गया है. IBDs है Crohn रोग (सीडी) और UC अज्ञात एटियलजि के जटिल रोगों, पुरानी आंतों में सूजन और ऊतकों को नुकसान द्वारा विशेषता हैं. / - IL10 के रूप में आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों में सहज सूजन से आंतों में सूजन के कई माउस मॉडल मौजूद हैं, चूहों, dextran सोडियम (DSS) सल्फेट और घ के रूप में इस तरह के यौगिकों, के साथ चुनौतियों का सामना करने के लिए रासायनिकinitrobenzene सल्फोनिक एसिड (गैर - बैंकिंग पर्यवेक्षण विभाग) 1. यह धारणा रही है कि maladaptive IBD रोगियों में जीर्ण सूजन मौजूद प्रतिक्रियाओं आंतों mucosal प्रतिरक्षा प्रणाली के असामान्य अंत्र बैक्टीरिया के लिए जोखिम 2, इसलिए संक्रामक बृहदांत्रशोथ के मॉडल का अध्ययन भी संभावित रोगजनक मेजबान को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण क्षमता प्रदान करता है पर आनुवंशिक रूप से अतिसंवेदनशील व्यक्तियों में विकसित अंत्र बैक्टीरिया के लिए प्रतिक्रियाओं Citrobacter rodentium प्रेरित बृहदांत्रशोथ एक संक्रामक बृहदांत्रशोथ के दुर्लभ मॉडल है कि अच्छी तरह से किया गया है 1,3 विशेषता है, अंत्र बैक्टीरिया और IBD रोगजनन के संभावित तंत्र के आगे समझने के लिए मेजबान प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, एक आवश्यक कदम उपन्यास preventative और चिकित्सीय उपचार के विकास में.
सी. rodentium एक ग्राम नकारात्मक संलग्न और शर्मीला (ए / ई), murine विशिष्ट जीवाणु रोगज़नक़ कि निकट महत्वपूर्ण मानव से संबंधित हैरोगज़नक़ों enteropathogenic ई. (EPEC) कोलाई और enterohaemorrhagic ई. कोलाई (EHEC) 3-8. ए / ई रोगजनकों के परिवार के परिचित cecal और colonic उपकला के शिखर मेजबान कोशिका झिल्ली को देते हैं, एक गैर इनवेसिव मेजबान सेल पर कुरसी की तरह संरचना बनाने. सी. के साथ ओरल चुनौती 10 9 8 -10 जीवों के rodentium संक्रामक बृहदांत्रशोथ के एक मजबूत मॉडल colonic या तहखाने, mononuclear प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ और जाम सेल रिक्तीकरण 3,4 hyperplasia बढ़ाव द्वारा विशेषता पैदा करता है. उपनिवेशवाद की प्रारंभिक साइट, चुनौती के कुछ घंटे बाद, पैच पर cecal है, बाहर का बृहदान्त्र 3 संक्रमण के बाद 2 से 3 दिनों के लिए प्रगति के द्वारा पीछा किया. असुरक्षित माउस उपभेदों में रोगज़नक़ की निकासी 1,3,4 संक्रमण के बाद 3 से 4 सप्ताह में हासिल की है. हालांकि, कई उपभेदों आनुवंशिक रूप से संशोधित, यानी जीन की कमी या पीटा चूहों (- / -), increa प्रदर्शित करने के लिए मिल गया हैअतिरंजित क्षति और / या पुराने संक्रमण और सूजन 9-14 को संक्रमण के लिए संवेदनशीलता sed. इन पीटा उपभेदों में इस संक्रामक बृहदांत्रशोथ मॉडल का प्रयोग, कई जन्मजात संकेत प्रोटीन की कमी, कई मेजबान आंत्र संक्रमण और सूजन के संकल्प का अभिन्न अंग प्रोटीन खुलासा में अनिवार्य कर दिया गया है.
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Protocol
1. Citrobacter rodentium inoculum और चूहे की मौखिक नलिका - पोषण की तैयारी
- तैयार है और आटोक्लेव Luria Bertani शोरबा (पौंड).
- व्यवहार्य सी. Obtain एक जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक और लकीर से लेग अगर एक बाँझ inoculating पाश या विंदुक टिप का उपयोग कर थाली पर rodentium. 37 ° रातोंरात सी सेते हैं. एक inoculating पाश या विंदुक टिप का उपयोग लेग प्लेट से कालोनियों के साथ एक बाज़ संस्कृति ट्यूब में बाँझ लेग शोरबा के 3 मिलीलीटर टीका लगाना. Inoculum की तैयारी सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग किया जाना चाहिए.
- सी. सेते rodentium संस्कृति aerobically 37 डिग्री सेल्सियस पर 200 rpm पर एक benchtop ऊष्मायन प्रकार के बरतन में रातोंरात. inoculated लेग शोरबा रातोंरात संस्कृति के बाद बादल दिखाई देनी चाहिए.
- एक बल्ब का प्रयोग करें गैस्ट्रिक नलिका - पोषण एक 1 मिलीलीटर सिरिंज जुड़ी रातोंरात सी की 100 μl के साथ प्रत्येक माउस नलिका - पोषण सुई इत्तला दे दी rodentium संस्कृति. धीरे मजबूती से अपनी गर्दन और पीठ पर ढीली त्वचा लोभी द्वारा माउस कूड़ा,अंगूठे और उंगलियों के साथ. वापस अपने सूचकांक उंगली के साथ पशु के सिर खींचो सिर स्थिर और नलिका - पोषण सुई की प्रविष्टि के लिए घुटकी को सीधा.
- एक ईमानदार स्थिति में माउस को बनाए रखने और उसके मुंह के पक्ष के साथ और अपनी जीभ पर नलिका - पोषण सुई के बल्ब टिप प्रत्यक्ष. धीरे मुँह की छत के साथ सुई के पास है और यह नीचे अग्रिम घेघा. अगर वहाँ किसी भी प्रतिरोध इस प्रक्रिया के दौरान महसूस किया है, नलिका - पोषण सुई हटा दें और इसे फिर से डालें.
- धीरे बैक्टीरियल inoculum के 100 μl इंजेक्षन और धीरे नलिका - पोषण सुई को हटा दें. यह अपने पिंजरे में लौटने के बाद सांस लेने और माउस की दर व्यवहार मॉनिटर.
नोट:
- चरण 2 और 3 में भी एक बाज़ संस्कृति बाँझ लेग रातोंरात संवर्धित किया शोरबा के 3 मिलीलीटर के साथ सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि वहाँ शोरबा खुद की कोई जीवाणु संक्रमण है ट्यूब तैयार. लेग शोरबा रातोंरात संस्कृति के बाद स्पष्ट दिखाई देनी चाहिए.
- अगर यह 24 घंटे से अधिक के लिए किया गया inoculated ओवरनाइट संस्कृति को खारिज किया जाना चाहिए.
- सभी सी. rodentium और संक्रमण से संक्रमित जानवरों के आवास के एक जैवसुरक्षा स्तर 2 सुविधा में बाहर किया जाना चाहिए.
2. सी. में Colonic उपकला बैरियर पारगम्यता मापने rodentium संक्रमित चूहे
- एक वांछित समय के बाद संक्रमण बिंदु पर बाधा अखंडता उपाय.
- परख का दिन, पर्याप्त तैयार करते 4 केडीए fluorescein (FITC) आइसोथियोसाइनेट dextran फॉस्फेट में भंग 80 मिलीग्राम मिलीग्राम -1 के एक एकाग्रता के लिए 150 μl साथ प्रत्येक माउस नलिका - पोषण और मानक वक्र तैयार खारा (पीबीएस) buffered.
- कूड़ा और FITC dextran के 150 μl के साथ माउस नलिका - पोषण. इस समय पिंजरे से भोजन को वापस ले लें.
- चूहों के बाद 4 घंटा anesthetizegavaging और कार्डियक पंचर के माध्यम से संभव के रूप में ज्यादा के (~ 450 μl) रक्त के रूप में इकट्ठा. एक microcentrifuge जमावट रोकते ट्यूब में 3% dextrose साइट्रेट एसिड एक अंतिम एकाग्रता रक्त जोड़ें. चूहों euthanize और बैक्टीरिया की गिनती (3.1 कदम 3.5) के लिए पीबीएस में colonic ऊतकों को इकट्ठा करने और ऊतकों के निर्धारण के लिए 10 formalin और अंततः immunofluorescence धुंधला हो जाना% (4.1 कदम 4.8) में.
- एक अपकेंद्रित्र में 12 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1000 XG पर रक्त के नमूने स्पिन सीरम ले लीजिए और / 1 10/1 100 पीबीएस में जलमिश्रित. Replicates में एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए इन दो dilutions में प्रत्येक नमूने की 100 μl जोड़ें.
- मानक वक्र तैयार पतला, मूल 80 मिलीग्राम मिलीलीटर -1 FITC - dextran निम्नलिखित सांद्रता पीबीएस में चूहों नलिका - पोषण के लिए इस्तेमाल किया: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, और 0 ग्राम / मिलीलीटर . एक तीन प्रतियों में 96 अच्छी तरह से थाली प्रत्येक एकाग्रता की 100 μl जोड़ें.
- प्रत्येक नमूने के प्रतिदीप्ति यों एक उत्तेजना wav एक fluorometer का उपयोग485 एनएम और 535 एनएम उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य elength.
- मानक वक्र की साजिश रचने से कच्चे डेटा का विश्लेषण. इनपुट मानक वक्र द्वारा उत्पन्न करने के लिए प्रत्येक नमूने में FITC dextran की एकाग्रता का निर्धारण लाइन के समीकरण में प्रत्येक नमूना के लिए कच्चे डेटा.
नोट:
- कदम आगे से 4, बर्फ पर रक्त के नमूनों को रखने के लिए और प्रकाश के लिए जोखिम कम से कम.
- जब उपकला बाधा अखंडता के एक समय बिंदु पर, या पहले मापने, 7 दिनों के बाद संक्रमण इष्टतम है, गंभीर ऊतकों को नुकसान के रूप में इस बिंदु के बाद होता है. मापने बाधा अखंडता गंभीर क्षति घटनेवाला करने से पहले आप सी. दौरान पारगम्यता में अधिक से अधिक मतभेदों को निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है माउस उपभेदों के बीच rodentium संक्रमण.
- सुनिश्चित करें कि uninfected चूहों पर नियंत्रण भी उपकला बाधा अखंडता के लिए परीक्षण कर रहे हैं.
3. सी. के ऊतकों में बैक्टीरियल लोड के मापन rodentium संक्रमित चूहे
- 1 मिलीलीटर बाँझ एक PBS जोड़ेंएन डी एक autoclaved एक दौर मनका धातु 2 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग तली. व्यक्तिगत प्रत्येक जानवर से एकत्र ऊतकों अलग पीबीएस ट्यूबों में रखा जाएगा. ट्यूबों पहले वजन ऊतक के अलावा.
- Cecum और माउस से बृहदान्त्र निकालें. बृहदान्त्र से cecum अलग और luminal संदंश का उपयोग कर सामग्री धक्का. एक PBS ट्यूब के लिए सामग्री जोड़ें. 10% formalin निर्धारण के लिए बाहर का बृहदान्त्र और cecum से 0.5 सेमी वर्गों को अलग करने के बाद, शेष बृहदान्त्र और cecum खुला longitudinally कटौती और ट्यूबों में ऊतकों को रखने से पहले बाँझ पीबीएस के साथ धोने.
- पीबीएस ट्यूबों ऊतक के साथ वजन और फिर 30 हर्ट्ज पर 6 मिनट के लिए एक मनका डिब्बा का उपयोग कर नमूने homogenize.
- सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करते हुए, एक 96 अच्छी तरह से थाली के लिए अच्छी तरह से प्रति 180 μl बाँझ पीबीएस. प्रत्येक पंक्ति में पहले अच्छी तरह से करने के लिए प्रत्येक homogenized नमूना के 20 μl जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स और serially कमजोर से प्रत्येक में अच्छी तरह से पिछले 20 μl जोड़ने के लिए 10 से dilutions -1 प्राप्त करने के लिए (हम पहले-6 10) करूँगा. प्लेट एक ग्रिड के साथ एक वर्ग नीचे लेग प्लेट पर तीन प्रतियों में प्रत्येक नमूना से प्रत्येक कमजोर पड़ने के 10 μl. 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस
- कॉलोनी के गठन इकाइयों (CFU), तो औसत 3 मायने रखता है, गणना, और कमजोर पड़ने है जो प्रत्येक नमूना गिना गया रिकॉर्ड. औसत CFU 50 से गुणा के रूप में मूल नमूना 1 मिलीलीटर की 20 μl इस्तेमाल किया गया था, और कमजोर पड़ने कारक है जिस पर नमूना CFU / मिलीलीटर में गिना गया. अंत में, ऊतक / CFU छ निर्धारित वजन से विभाजित.
4. Histological आकलन और संक्रमित बृहदान्त्र ऊतकों की इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला
- 3.2 चरण में ऊतकों ले लीजिए. Formalin रातोंरात स्टोर में ऊतकों, तो 70% इथेनॉल के साथ धो लो. तेल में ऊतकों एम्बेड और धुंधला के लिए 5 सुक्ष्ममापी वर्गों में कटौती. Histological मूल्यांकन लिए hematoxylin और लाल भामसान रंग के साथ दाग और immunofluorescence धुंधला के लिए चरणों का पालन करने के लिए आगे बढ़ना है.
- धुंधला पहले ऊतकों deparaffinize जगह में स्लाइड10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में एक coplin धुंधला हो जार और डाल दिया. अगला, 2 मिनट प्रत्येक के चार washes के लिए xylene में जगह स्लाइड. इथेनॉल 95%, 75% इथेनॉल और DH 0 2: स्लाइड्स तो दो 100% इथेनॉल में 5 मिनट washes, एक निम्न में से प्रत्येक में 5 मिनट धोने से rehydrated होना चाहिए. इन washes एक धूआं हुड में किया जाना चाहिए हानिकारक vapors के जोखिम से बचने के लिए.
- पूर्व गर्म सोडियम साइट्रेट और फिर 30 मिनट के लिए एक स्टीमर में बफर जगह के साथ coplin जार में जगह स्लाइड, तो 30 मिनट के लिए बैठते हैं. इस प्रक्रिया प्रोटीन formalin निर्धारण संभावित प्रतिजनी साइटों को पुन: प्राप्त करने के द्वारा गठित पार से लिंक टूट जाता है.
- 5 मिनट, तीन बार के लिए पीबीएस azide से धो. सूखी स्लाइड और पैप कलम के साथ एक hydrophobic बाधा पैदा करने के लिए, धुंधला हो जाना ऊतक पर स्थानीय अभिकर्मकों रखने निशान ऊतक के आसपास क्षेत्र.
- अवरुद्ध बफर के साथ एक कमरे के तापमान पर एक immunostaining नमी कक्ष में (जैसे सीरम α - बकरी) घंटे के लिए ब्लॉक के ऊतकों.
- रस्मी पतलाआरे एंटीबॉडी वांछित एकाग्रता एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर का उपयोग. बंद डालो बफर अवरुद्ध और ऊतकों को प्राथमिक एंटीबॉडी के 50-100 μl जोड़ें. 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात या 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- 5 मिनट, तीन बार के लिए पीबीएस azide से धो. माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने बफर में ऊतकों और अंधेरे में 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर सेते को पतला एंटीबॉडी के 50-100 μl जोड़ें. DH 2 हे के साथ 5 मिनट के लिए, तीन बार धो लें.
- स्लाइड्स निर्जलीकरण, जोड़ने DAPI गोल्ड बढ़ते मध्यम लम्बा और एक coverslip लागू. एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे स्लाइड देखें.
नोट:
- पीबीएस azide हौसले से तैयार पीबीएस के साथ एक कदम आगे 4 से धोने के मध्यम में बैक्टीरियल वृद्धि से बचने के लिए एक विकल्प के रूप में प्रतिस्थापित किया जा सकता है.
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Representative Results
एक मानक संक्रमण प्रयोग के दौरान, चूहों लगभग 2.5 x 10 8 CFU के साथ 100 μl रातोंरात सी. नलिका - पोषण के माध्यम से संक्रमित होते हैं rodentium संस्कृति. सी. साथ C57BL / 6 चूहों के संक्रमण मामूली और क्षणिक वजन घटाने और दस्त में rodentium परिणाम है. हालांकि C57BL / 6 चूहों के साथ एक दुर्लभ घटना के रूप में, जानवरों के बीमार हो जाते हैं और euthanization की आवश्यकता हो सकता है. इसलिए, चूहों वजन घटाने और संकट के piloerect फर और hunched मुद्रा के रूप में इस तरह के लक्षण की डिग्री के लिए नजर रखी जा चाहिए, किस हद तक अलग अलग उपभेदों के संक्रमण से प्रभावित कर रहे हैं निर्धारित.
1 से 4 आंकड़े में परिणाम प्रस्तुत किया संक्रमण का उपयोग कर एक रात में एक जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक से तैयार संस्कृति के प्रतिनिधि हैं. 7 दिन के बाद संक्रमण, चूहों anesthetized थे और कार्डियक पंचर के माध्यम से रक्त एकत्र किया गया था चित्रा 1 से पता चलता है FITC dextran सीरम में मापा.C57BL / 6 चूहों के रूप में के रूप में अच्छी तरह रिसेप्टर 2 (TLR2) पीटा चूहों, जो पहले से बिगड़ा हुआ उपकला बाधा अखंडता प्रदर्शन 9 संक्रमण के दौरान पाया गया है की तरह टोल से. एक अक्षुण्ण आंतों उपकला बाधा की उपस्थिति में, 4 केडीए FITC dextran इस परत के माध्यम से खराब पारगम्य है. इसलिए, सीरम FITC - dextran में के स्तर में वृद्धि के इस अणु भर में लीक करने के लिए अनुमति देता है संक्रमण के दौरान आंतों उपकला बाधा अखंडता के एक हानि का सुझाव देते हैं. एक नियंत्रण के रूप में, असंक्रमित FITC - dextran साथ gavaged चूहों में सीरम का स्तर भी प्रस्तुत कर रहे हैं.
एक सप्ताह के बाद संक्रमण, बृहदान्त्र में बैक्टीरिया लोड करने के लिए लगभग 9 10 3,4 / CFU जी चोटी पाया गया है. बैक्टीरियल भार वांछित समय अंक के बाद संक्रमण से मापा जा सकता है संक्रमण की पुष्टि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आकलन अगर अलग पीटा चूहों बढ़ाई या घटाई बैक्टीरियल बोझ से पीड़ित है. सी के रूप में rodentium एक luminal रोगज़नक़ कि परिचित adh कर सकते हैंआंतों उपकला कोशिकाओं, luminal सामग्री, cecal और colonic ऊतकों में बैक्टीरियल भार अरे मापा जा सकता है. चित्रा 2 ठेठ बैक्टीरियल C57BL / 6 की आंतों लुमेन के भीतर दिन में 7 के बाद संक्रमण cecal और colonic ऊतकों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मापा भार से पता चलता है चूहों.
विकृति विज्ञान के अधिकांश सी. के दौरान मनाया C57BL / 6 चूहों में rodentium संक्रमण colon11 के बाहर 2 सेमी में होता है. Macroscopically दिन 7 के बाद संक्रमण से, colonic mucosa के एक उमड़ना के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बृहदान्त्र की लंबाई में एक छोटा, थोड़ा प्रकट C57BL / 6 चूहों में देखा नुकसान के साथ मनाया जाता है. संक्रमण के दौरान आम तौर पर, C57BL / 6 चूहों केवल मध्यम सूजन और विकृति प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ, colonic तहखाने और जाम सेल रिक्तीकरण (3 चित्रा) के बढ़ाव से histologically विशेषता पीड़ित हैं.
चित्रा 3 में एच एंड ई वर्गों में देखा है, कई मेजबान प्रतिक्रियाओं dur बढ़ रहे हैंसी. के साथ आईएनजी संक्रमण rodentium. आगे इन परिवर्तनों विशेषताएँ immunofluorescence धुंधला हित के प्रोटीन में प्रसार के मार्कर, कोशिका मृत्यु या जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में इस तरह के बदलाव की जांच करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना भी बैक्टीरियल प्रतिक्रिया के संक्रमित ऊतक के भीतर अपने स्थानीयकरण जैसे पहलुओं की जांच करने में मूल्यवान है. इस धुंधला हो जाना तकनीक का एक उदाहरण के लिए, एक मेजबान प्रोटीन ki67 (लाल), सेल प्रसार और सी के लिए एक मार्कर की जांच rodentium प्रोटीन tir, हरे, 12 दिन में बैक्टीरियल स्थानीयकरण की जांच के बाद संक्रमण चित्रा 4 में प्रस्तुत किया है.
चित्रा 1. FITC dextran सीरम उपकला बाधा अखंडता का आकलन करने चूहे के मापन थेअसंक्रमित शर्तों के तहत 4 FITC dextran केडीए के साथ और 7 दिनों के बाद संक्रमण पर gavaged, जिसके बाद सीरम FITC dextran स्तर निर्धारित किया गया है. C57BL / 6 चूहों (WT) असंक्रमित शर्तों की तुलना में 7 दिनों के बाद संक्रमण पर एक FITC dextran सीरम स्तर में नगण्य वृद्धि दिखा रहे हैं. इसके विपरीत, TLR2 / - चूहों में काफी आधारभूत सुझाव है गंभीर रूप से प्रभावित इस तनाव में बाधा और अखंडता की तुलना सी. दौरान FTIC-dextran के सीरम में स्तरों में वृद्धि हुई rodentium संक्रमण, के रूप में पहले से दिखाया गया है.
चित्रा 2 सी.. लुमेन, cecum में rodentium लोड, और संक्रमित C57BL / 7 दिनों के बाद संक्रमण में 6 चूहों के बृहदान्त्र. Lumen, cecal और colonic ऊतकों एकत्र थे, homogenized, और लेग अगर धारावाहिक कमजोर पड़ने में चढ़ाया हुआ. प्रत्येक गircle एक एकल व्यक्ति जानवरों से एकत्र नमूने का प्रतिनिधित्व करता है. ठोस लाइनों ज्यामितीय मतलब है संकेत मिलता है जबकि ऊर्ध्वाधर त्रुटि सलाखों SEM संकेत मिलता है.
चित्रा 3. सी. द्वारा वजह से नुकसान के histological विश्लेषण दिन 7 के बाद संक्रमण मध्यम प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तहखाने, जाम सेल रिक्तीकरण और हल्के edema के बढ़ाव rodentium संक्रमण. मनाया असंक्रमित ऊतक को नियंत्रित करने की तुलना में है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 4. असंक्रमित और 12 दिन के बाद infec इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जानाC57BL / 6 चूहों की tion डिस्टल colonic ऊतक ऊतकों. मेजबान ki67 प्रोटीन (लाल) और सी के लिए दाग है rodentium प्रोटीन tir (हरा).
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Discussion
Citrobacter rodentium संक्रमण दोनों संक्रामक रोग और चूहों में बृहदांत्रशोथ के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल प्रदान करता है. यह अनूठा मॉडल दोनों मेजबान प्रतिक्रियाओं, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बैक्टीरिया रोगजनक गुण की लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है. कदम इस प्रोटोकॉल के विस्तार में इस मॉडल का सफल उपयोग को रेखांकित किया.
इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम को ध्यान में रखना जब बृहदांत्रशोथ उत्प्रेरण और प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण कर रहे हैं. पहले, एक ताजा रातोंरात सी. की तैयारी लेग शोरबा में rodentium inoculum चूहों के सफल संक्रमण के लिए आवश्यक है. 10 8 9 -10 जीवों की एक खुराक के रूप में संक्रमित चूहों के सबसे उपभेदों, अगर inoculum प्रकार के बरतन में या विस्तारित अवधि के लिए कमरे के तापमान पर बेंच शीर्ष पर छोड़ दिया है करने के लिए आवश्यक है, वहाँ काफी व्यवहार्य जीवों के संस्कृति में शेष नहीं होगा संक्रमण पर बृहदांत्रशोथ प्रेरित. यह भी महत्वपूर्ण है पहले बैक्टीरियल inoculum को उत्तेजित करना हैसंक्रमण के लिए सिरिंज लोड हो रहा है, यह सुनिश्चित करें कि प्रत्येक माउस बैक्टीरिया के एक बराबर खुराक प्राप्त. संक्रमण टर्मिनस पर ऊतकों एकत्रित, 10% की पर्याप्त मात्रा में colonic ऊतकों की डुबकी formalin पूरा हो गया है, उचित ऊतक निर्धारण के लिए करने के लिए आवश्यक होते हैं. यह सुझाव दिया है कि ऊतकों ऊतकों को लगानेवाला की सिफारिश की है एक 10:1 अनुपात के रूप में microcentrifuge ट्यूब में एक 5 के बजाय मिलीग्राम शीशी में formalin के लिए जोड़ा जा. उचित निर्धारण बाद में histological विश्लेषण, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इन ऊतकों की immunofluorescence धुंधला हो के लिए आवश्यक है. यह भी महत्वपूर्ण है को ध्यान में रखना है कि अलग अलग पीटा उपभेदों सी. प्रेरण पर प्रतिक्रियाओं अलग है rodentium बृहदांत्रशोथ. जब पहली बार के लिए एक नई नस्ल को संक्रमित, चूहों को बारीकी से प्रयोग के लिए एक मानवीय अंत बिंदु निर्धारित निगरानी करनी चाहिए, अगर जरूरत है. उपकला बाधा अखंडता, बैक्टीरियल भार, और ऊतक विज्ञान के विश्लेषण के लिए समय अंक माउस की प्रतिक्रिया के आधार पर परिभाषित किया जा सकता हैसंक्रमण के हित के तनाव.
लेग प्लेटों पर ऊतक homogenates बैक्टीरियल भार निर्धारित चढ़ाना एक पूरी तरह से चयनात्मक तरीके से नहीं है, एक सी के लिए पीसीआर प्रदर्शन rodentium जीवाणु कॉलोनियों पर विशिष्ट जीन सी. अंतर किया जा सकता है थाली पर अन्य bacterialcolonies से rodentium. एक अन्य विकल्प MacConkey अगर पर थाली ऊतक homogenates है, इस माध्यम के रूप में सी. के लिए और अधिक चयनात्मक है लेग अगर तुलना में rodentium. एक वैकल्पिक दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए है एक स्ट्रेप्टोमाइसिन प्रतिरोधी जंगली प्रकार सी. एक स्ट्रेप्टोमाइसिन प्रतिरोधी तनाव के साथ rodentium तनाव instead.Substitution ही बृहदांत्रशोथ इस प्रोटोकॉल में वर्णित मॉडल की प्रेरण में परिणाम देगा. स्ट्रेप्टोमाइसिन प्रतिरोधी तनाव का उपयोग कर के लाभ बैक्टीरियल लोड के विश्लेषण के लिए आसान है, के रूप में इन संक्रमणों से ऊतक homogenates लेग लेग अकेले अगर बजाय स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक अगर पर चढ़ाया जा सकता है. कॉम के संभावित वृद्धि से बचा जाता हैथाली पर ensal रोगाणुओं, CFU गिनती की प्रक्रिया आसान और अधिक सटीक बनाने के. जबकि एक अन्य विकल्प बैक्टीरियल भार मापने, लेग अगर 37 या तो में ऊतक homogenates की dilutions चढ़ाना के बाद प्लेटों सेते हैं डिग्री सेल्सियस रातोंरात या 2-3 दिनों के लिए कमरे के तापमान, धीमी बैक्टीरियल वृद्धि में गिनती से पहले, जिसके परिणामस्वरूप.
इस प्रोटोकॉल संक्रामक बृहदांत्रशोथ के एक मजबूत मॉडल का निर्माण करने के लिए आवश्यक कदम की रूपरेखा है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सी विशेषताएँ इस्तेमाल तरीकों चूहों में rodentium संक्रमण. रोगज़नक़ मेजबान बातचीत और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए इस मॉडल का उपयोग करने के अलावा, यह भी अध्ययन करने के लिए कैसे एक जीवाणु संक्रमण पेट के कैंसर का खतरा बढ़ सकता है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस सी. उजागर द्वारा किया जा सकता है , या पढ़ाई कैसे उपकला कोशिका प्रसार पर, या जीन पर संक्रमण प्रभावों उपकला सेल भेदभाव या ट्यूमर के विकास 15 में शामिल करके rodentium कैसरजन azoxymethane संक्रमित चूहों. हमेंसंक्रामक बृहदांत्रशोथ इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित मॉडल आईएनजी, बैक्टीरियल संख्या भी mesenteric लिम्फ नोड्स, प्लीहा और यकृत के रूप में अतिरिक्त आंत्र साइटों, पर मूल्यांकन किया जा सकता है. इन अंगों में उच्च संख्या का संकेत हो सकता है परीक्षण किया जा रहा है कि माउस तनाव अत्यधिक संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील है. Immunofluorescence धुंधला हो जाना वर्णित तकनीक का उपयोग करना, संक्रमण के जवाब में एक तंत्र की लगभग अनंत संख्या का पता लगाया जा सकता है. एक बार यहाँ विस्तृत तकनीक के साथ परिचित, प्रोटोकॉल के ऊतकों को इकट्ठा करने के लिए शाही सेना निष्कर्षण और जीन की अभिव्यक्ति के स्तर का आकलन करने के लिए जैसे अन्य endpoints, को मापने के लिए और अधिक अच्छी तरह से सी. प्रतिक्रियाओं विशेषताएँ संशोधित किया जा सकता है संक्रमण rodentium.
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Disclosures
लेखक का घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.
Acknowledgments
यह काम Crohn है और कनाडा की बृहदांत्रशोथ फाउंडेशन (CCFC) और स्वास्थ्य अनुसंधान (CIHR) के लिए कनाडा के संस्थानों से ऑपरेटिंग BAV अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. जीबी CIHR से स्नातक छात्रवृत्ति द्वारा वित्त पोषित किया गया था. BAV आंतों और लीवर (बाल) बाल चिकित्सा IBD और बाल चिकित्सा गैस्ट्रोएंटरोलॉजी में कनाडा अनुसंधान चेयर रिसर्च फाउंडेशन चेयर विकार के साथ बच्चे है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
References
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