Summary
Мышиной модели кожной заживление ран, которые могут быть использованы для оценки терапевтических соединений в физиологических и патофизиологических условиях.
Abstract
Заживление ран и ремонта наиболее сложных биологических процессов, происходящих в жизни человека. После травмы, множественные биологические пути активизируются. Ухудшение заживления ран, которое происходит у больных сахарным диабетом, например, может привести к серьезным неблагоприятным последствиям, например, ампутации. Существует, следовательно, все большее толчком для развития новых препаратов, которые способствуют заживлению ран. Тестирование этих была ограничена большой модели на животных, таких как свиньи, которые часто являются непрактичными. Мыши являются идеальным доклинической модели, так как они экономичны и поддается генетической манипуляции, что позволяет механистической расследования. Тем не менее, заживления ран у мышей в корне отличается от людей, как это в первую очередь происходит через сокращение. Наши мышиной модели преодолевает это путем включения шины вокруг раны. По шинированием раны, процесс восстановления, то в зависимости от эпителизации, клеточную пролиферацию и ангиогенез, которая тесно зеркалобиологические процессы человека заживление ран. Несмотря на то, требующих согласованности и заботы, это мышиной модели не задействованы сложные хирургические методы и позволяет надежное тестирование перспективных агентов, которые могут, например, стимулировать ангиогенез или подавлять воспаление. Кроме того, каждая мышь действует как своим собственным контролем в виде двух ран готовят, позволяя применение обоих тестируемого соединения и управления транспортным средством на том же животном. В заключение мы демонстрируем практичный, легкий в освоении и надежная модель заживления раны, которая сопоставима с человека.
Introduction
Ухудшение заживления ран отвечает за значительной заболеваемости и смертности во всем мире, это особенно актуально для страдающих сахарным диабетом 1,2. В организме человека, заживление ран континуум процессов, в которых имеется значительное перекрытие 3. Сразу же после ранения, воспалительные процессы инициируются. Воспалительные клетки высвобождают факторы, которые стимулируют процессы клеточной пролиферации, миграции и ангиогенез. После повторной эпителизации и формирования новых тканей есть фазы ремоделирования, что влечет за собой как апоптоз и реорганизации матрицы белки, такие как коллаген.
Сложность заживления ран в настоящее время невозможно воспроизвести в пробирке, и это требует использования животных моделях. К настоящему времени заживления ран исследований были ограничены больших моделей животных, таких как свиньи, чтобы гарантировать, что процесс заживления эквивалентны и сравнимы с человека. Тем не менее, с использованием больших AnimaLs для таких исследований может быть трудно дома и не всегда практичны 4. Мышь лаборатории представляет собой экономичный животной модели, которые могут быть легко генетически модифицированных для механистической исследование 5-7. Тем не менее, мышиный раны заживают по-разному к человеку, в первую очередь в связи с процессом сжатия 8. Это отчасти, в связи с обширным подкожным слоем поперечно-полосатых мышц называется подкожной клетчатки carnosus, что в значительной степени отсутствует в организме человека. У мышей этой мышцы слой позволяет коже перемещаться независимо от глубоких мышц и отвечает за быстрое сжатие кожи ранения следующее.
Чтобы преодолеть это ограничение, мышиных заживление раны может быть адаптирован для репликации человеческих заживление раны за счет использования шины (рис. 1) 8,9. В этом видео нам демонстрируют шинируются мышиной модели рану, которая устраняет контракции раны и более тесно приближает человека процессы повторного epithelializaния и формирования новой ткани. В этой модели два полную толщину вырезами, которые включают в подкожной клетчатки carnosus создаются на тыльной поверхности, по одному с каждой стороны от средней линии мыши. Шина помещается силиконовый вокруг раны с помощью клея и шину затем фиксируется узловыми швами. Каждая мышь действует как свой собственный контроль, с одной раны, получающих лечение и другие управления транспортным средством, тем самым сокращения численности животных. После местного применения прозрачный окклюзионной повязки. Повязка может быть удален, если требуется дальнейшая местного применения и / или измерение области раны 10,11. По завершении экспериментов закрытия раны, морфологические архитектуры и степень неоваскуляризации может быть оценена с помощью иммуногистохимии. Этот экономичный и легко выполнить модель также может быть использована для оценки заживления ран в контексте сахарный диабет или другие pathophysiologies.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка шины и окклюзионные соусов
- Краткие сведения 10 мм круги на 0,5 мм листа толщиной от силикона и использовать ножницы или дерматома для создания силиконовых дисков.
- Центр 5 мм биопсии удар в середине 10 мм круга и сильно прижать для создания отверстия в форме "пончика", как диск, который будет использоваться в качестве шины.
- Краткие сведения 10 мм круги на прозрачной герметичной повязкой, таких как Opsite и используйте ножницы, чтобы создать круговую повязку.
2. Экспериментальные животные
- Получить животных Комитета по этике утверждения для всех экспериментов, которые будут выполняться.
- Использование 8-недельных (22-26 грамм) самцам мышей линии C57BL/6J с коммерческой заводчика (например, The Jackson Laboratories).
- Держите мышей в стандартных условиях 21 ° С и 12 ч циклом свет-темнота со свободным доступом к пище и воде.
- (Необязательно): Диабет может быть вызвано от 6 до 7 недель мышей путем болюсной внутрибрюшинного Injeие 165 мг / кг стрептозотоцин (цитрат в буфере, рН 4,5), с гипергликемией подтверждается регулярными мониторинга глюкозы в крови (глюкометр AccuChek). Диабетических мышей может иметь полиурия и так их залегания, возможно, потребуется менять чаще для устранения влажности и их веса следует пристально следить.
3. Анестезия и оперативную подготовку
- Общей анестезии с использованием 5% изофлуран в 100% кислорода (расход 1 л / мин) и поддерживают анестезии с использованием 1-3% изофлуран.
- Убедитесь глубоких рефлексов педали мыши подавляются и поместите курсор в положении лежа.
- Подготовка оперативного регионе путем удаления мех с садовыми ножницами от основания шеи до 3 см дальше вниз и назад между двумя лопатками.
- Свет приложение для депиляции Крем можно наносить не более чем на 2 мин. Мокрый тампоны марли можно использовать, чтобы обеспечить все оставшиеся сливки и меха удаляются.
- Протирать кожуспиртовым тампоном и двух приложений на 10% повидон-йод (Бетадин) и драп мыши.
4. Удаление и шинирование ран
- Схематическое изображение мышиного ранозаживляющим модель представлена на рисунке 1.
- С помощью стерильной 4 мм дерматома очертить две круглые образцы для ран по обе стороны от средней линии мыши на уровне плеч (см. фиг.2а-2b).
- Использование зубчатые щипцы для подъема кожи в середине контура и диафрагмы ножницами, чтобы создать полную толщину раной, который проходит через подкожные ткани (фиг. 2c, 2d), в том числе подкожной клетчатки carnosus (рис. 2е), и акцизные круглый кусок ткани.
- Повторите этот процесс для ран по другую сторону от средней линии (рис. 2е).
- Удалить пластик защитного покрытия с каждой стороны шины силикона.
- Применить cyanoacrylaТе клея (например, супер клей или клей Krazy) на одной стороне шины силикона.
- Центр шины на рану (рис. 2 г) и якорь шину с прерван 6-0 швами нейлоном для обеспечения позиционирования (рис. 2 часа).
- Повторите шинированием процесса на другие раны.
- При необходимости в этот момент времени, применять терапевтический тестируемого соединения (до 100 мкл) в одну рану (рис. 2г) и управления транспортным средством в другой.
- Закрыть рану с прозрачной герметичной повязкой (например, Opsite) (рис. 2j-2k).
- Правителя находится ниже шины и микрофотография приняты (Рисунок 2 л).
6. Лечение послеоперационной
- Carprofen (5 мг / кг) вводят один раз в день с помощью подкожной инъекции для послеоперационной боли.
- После операции животным индивидуально клетке и поддерживается на тепло мАТС до полного восстановления.
- Монитор животных два раза в день для проявления боли и потеря веса. Мы не наблюдали валового поведенческие проявления боли или потери веса.
7. Измерение ран и лечение
- Рана может быть измерена в день.
- Общей анестезии с использованием 5% изофлурана газа (скорость потока 1 л / мин), а затем обеспечить глубокую сенсорные рефлексы мыши подавляются использованием 1-3% изофлурана.
- Аккуратно отогните окклюзионной повязки пинцетом.
- Использование хирургических суппортами для измерения диаметра раны. Мы возьмем среднее из трех измерений по X, Y и Z оси (рис. 2а-2м), а также микрофотографии для дальнейшего использования (рис. 2р).
- Дополнительно: В это время животное может быть оценена для перфузии крови с помощью лазерного доплеровского томографа (рис. 2д).
- Повторное применение терапевтических соединения и управления транспортным средством, может быть перформансаМед в этой точке.
- Чистой прозрачной герметичной повязкой затем применяются снова, и животных, содержащихся в тепле, пока полностью не восстановлено.
- Обратите внимание: если шины не обеспечена должным образом рана будет легко договора (рис. 2г).
8. Гистологический анализ
- Эвтаназии мышей через 10 дней с передозировки наркоза.
- Использование щипцов и лезвие скальпеля удалить швы и тщательно очистить от шины.
- Использование диафрагмой ножницами, чтобы создать широкий, полное удаление вокруг и под области раны и инкубировать ткани в 4% параформальдегид в фосфатном буферном растворе (PBS) при 4 ° С в течение ночи.
- Передача ткани до 17% сахарозы в растворе PBS в течение 24 ч при 4 ° С, затем удалите излишки раствора посредством легкого внимательно на ткани и место в ОСТ соединения и заморозить при температуре -80 ° C.
- Гематоксилином и эозином может быть использован для визуализации структуры раны и эпителиального просвета. Neovascularisation можно оценить с помощью иммуногистохимического анализа, чтобы определить количество капилляров (с использованием фактор фон Виллебранда).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Кривая закрытия раны определяется путем вычисления среднего диаметра раны и выражения результатов в виде процента, т.е. 100 - (день 0 диаметр / диаметр день X). В этом эксперименте терапевтического соединения (или контрольный носитель) наносили ежедневно к ране. Терапевтического соединения значительно ускорило закрытие раны (рис. 3). Важно отметить, что шина должна быть сохранена в течение всего эксперимента, а удаление шины приведет к быстрому сокращение раны (рис. 2г) и расходятся от картины заживления ран наблюдается у людей.
Рисунок 1. Схематическое представление мышиной модели заживления раны. В этой модели два полных ран толщина создаются на эитермо стороны от средней линии позволяет каждой мыши в качестве их собственным контролем. Силиконовые шины приклеены и пришита к периметру раны, чтобы предотвратить сокращение раны, обеспечивая воспроизводимые модели этого человека.
Рисунок 2. Раны хирургии исцеления и послеоперационных измерений. После удаления волос и подготовки кожи йодом и спиртом (AB) дерматома мягко используются для выделения двух кругов на тыльной поверхности по обе стороны от средней линии. (C) небольшой разрез Затем создается и (г) круговой кусок кожи удаляется, (д), включая panniculosus carnosus, (е) для создания двух полную толщину ран. (г) Клей затем наносят на кремниевую одной шины и шины придерживался рану периметру. (H) Шины затем крепится с помощью швов. (I) Лечение и местного применения (JK) окклюзионная, прозрачные повязки помещают на рану и придерживался шин (клей может использоваться при необходимости). (л) Микрофотографии принимаются ежедневно и область раны рассчитывается среднее значение трех измерений на диаметр (м) оси у (п) х-оси и (о) оси. (р ) представитель фото ран на 10 день, отметив меньше раны с правого обрабатывали терапевтического соединения. (д) представитель лазерного доплеровского изображения перфузии крови из раны на 6-й день. (г) Пример быстрого раны сжатие после удаления силиконовых шин.
65/50265fig3.jpg "Alt =" Рисунок 3 "FO: Content-ширина =" 4 дюйма "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50265/50265fig3highres.jpg "/>
Рисунок 3. Представитель закрытия раны графике. Области раны рассчитывается от среднего из трех ежедневных измерений диаметра вдоль х, у и Z-оси. Закрытие ран выражено в процентах от первоначальной площади раны на 0 день.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это экспериментальный мышиной модели заживления кожной раны. Важной особенностью данной модели является использование силиконовых шин, чтобы предотвратить сокращение раны, так что реэпителизация и новообразование ткани может происходить, что делает его похож на процесс, который происходит в организме человека. Эта модель является универсальным и может быть использован для оценки заживления ран и в физиологических и патофизиологических (например, сахарный диабет) настройки. Эта модель может также использоваться для оценки потенциальных заживления ран или ангиогенез терапии в экономичном настройки. С каждой мыши действует как свой собственный контроль численности животных сведены к минимуму. Хирургические методы, необходимые для этой модели не очень сложные, таким образом, эта модель может быть широко использована теми, с относительно небольшой хирургический опыт.
Для обеспечения воспроизводимости и точной количественной крайне важно, чтобы шины адекватно придерживался и привязанный к коже со швами, и что тЗдесь минимальная задержка между созданием двух ран. Склонность мышиный раны быстро договора после ослабления удаления шину или частичное из-за царапин с помощью мыши требует ежедневного мониторинга шин. Тщательное нанесения клея необходимо также, чтобы минимизировать раздражение здоровой кожи вокруг шины, которые могут способствовать царапин. Кроме того, очень важно следить асептики и тщательно дезинфицировать оборудование, в частности, суппорты, между мышами. Применение окклюзионной повязки необходимо также учитывать, особенно если раны не собираются лечить или одетых в день. Opsite и Tegaderm (3M) повязки сравнимы 12, и было показано, что Tegaderm повязки могут остаться только придерживались в течение 1-2 дней. Если долгосрочные повязки потребоваться альтернативный подход был описан Чанг и коллеги 13.
Потенциальные слабые стороны этой модели могут включать воспаление D UE к опорным швов, диффузия лечения или транспортного средства между ранами и вступления лечения в системный кровоток. В отношении швов вызывая местное воспаление, швы расположены относительно далеко от ран и в качестве каждой раны создается то же самое, поэтому любое воспаление, которое может произойти должны быть аналогичны между раны. Кроме того, расстояние между ран и отсутствие отеков между ранами сведет к минимуму диффузию между двумя кроватями. Существует ряд доказательств, что лечение может попасть в системный кровоток, что может ускорять заживление раны управления 9,10. Чтобы определить степень обработки ввода системный кровоток, однопометница мыши могут быть использованы, в котором два раны обрабатывали только транспортного средства. Различия в показателях закрытия раны от мышей, которым вводили только носитель, и мышей, получавших как транспортное средство и лечение может затем сравниваться.
"> В заключение, мы продемонстрировали относительно простой мышиной модели заживления ран, который показывает много характерных особенностей, наблюдаемых в человеческой заживлении ран.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность финансовой поддержке национального здравоохранения и медицинских исследований (NHMRC) Австралии (грантового проекта ID: 632512). Луиз Данн был поддержан NHMRC Ранняя карьера стипендий и Кристина Bursill по Национальной стипендий Фонда Сердца развития карьеры.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Press-to-seal silicone sheeting 0.5 mm thick | Invitrogen | P18178 | Cut into "donuts" with external diameter of 1cm external, 0.5 cm internal diameter |
| Biopsy punch 5 mm | Steifel | BC-B1-0500 | To outline wound area to be excised |
| Vannas scissors 8.5 cm curved | World Precision Instruments | 501232 | For wound incision and excision |
| Dumonte #7b forceps, 11 cm | World Precision Instruments | 501302 | To grip skin when creating incision and excising skin |
| Graefe forceps, serrated 10cm | World Precision Instruments | 14142 | To help attach silicone splint to skin |
| Needle holder, smooth jaws, curved, 12.5 cm | World Precision Instruments | 14132 | |
| Malis forceps, smooth, straight, 12 cm | Codman and Shurtleff, Inc (J&J) | 80-1500 | To suture the silicon rings to the skin |
| Ruler, 0.5 mm gradation | n/a | ||
| Calipers 0.25 mm gradation | Duckworth and Kent | 9-653 | To measure wound area |
| Opsite FlexiFix transparent adhesive film. 10 cm x 1 m | Smith & Nephew | 66030570 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Pfizer | 462986 |
References
- Sen, C. K., et al. Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair. 17, 763-771 (2009).
- Sen, C. K. Wound healing essentials: let there be oxygen. Wound Repair Regen. 17, 1-18 (2009).
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y.
- Lindblad, W. J. Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 1087-1096 (2008).
- Grose, R., Werner, S. Wound-healing studies in transgenic and knockout mice. Mol. Biotechnol. 28, 147-166 (2004).
- Reid, R. R., Said, H. K., Mogford, J. E., Mustoe, T. A. The future of wound healing: pursuing surgical models in transgenic and knockout mice. J. Am. Coll. Surg. 199, 578-585 (2004).
- Fang, R. C., Mustoe, T. A. Animal models of wound healing: utility in transgenic mice. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 989-1005 (2008).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J. Biomed. Biotechnol. 2011, 969618 (2011).
- Galiano, R. D., Michaels, J. t, Dobryansky, M., Levine, J. P., Gurtner, G. C. Quantitative and reproducible murine model of excisional wound healing. Wound Repair. 12, 485-492 (2004).
- Galiano, R. D., et al. Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogenesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells. The American Journal of Pathology. 164, 1935-1947 (2004).
- Thangarajah, H., et al. The molecular basis for impaired hypoxia-induced VEGF expression in diabetic tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13505-13510 (2009).
- Raza, A., Bayles, C., Biebel, D. Investigation of Bacterial Growth and Moisture Handling Properties of Transparent Dressings: 3M Tegaderm Transparent Dressing, 3M Tegaderm HP Transparent Dressing, and Opsite IV3000 Transparent Dressing. Smith and Nephew Report. , (1998).
- Chung, T. Y., Peplow, P. V., Baxter, G. D. Testing photobiomodulatory effects of laser irradiation on wound healing: development of an improved model for dressing wounds in mice. Photomed. Laser Surg. 28, 589-596 (2010).
