Summary
甲小鼠模型的皮肤伤口愈合,可用于评估治疗化合物在生理和病理生理设置。
Abstract
伤口愈合和修复,是发生在人类生活中最复杂的生物过程。伤好后,多种生物途径被激活。伤口愈合受损,发生在糖尿病患者中,例如,可导致截肢等严重的不利后果。因此,有动力开发新的药物,促进伤口修复。检测这些已经被限制到大动物模型,如猪,这往往是不切实际的。老鼠代表了理想的临床前模型,因为它们是经济和适合的遗传操作,它允许进行机械的调查。然而,伤口愈合的小鼠,人类是根本不同的,因为它主要通过收缩发生。我们的小鼠模型,克服这将夹板在伤口周围。夹板伤口,然后修复过程依赖于上皮细胞增殖和血管生成,密切镜像人的伤口愈合的生物学过程。虽然这个小鼠模型需要一致性和护理,不涉及复杂的外科技术,并允许为可靠的测试有前途的代理,例如,可能会促进血管生成或抑制炎症。此外,各小鼠作为它自己的控制制备两个伤口,使应用程序的试验化合物,并在同一个动物的车辆控制。总之,我们展示了一个实用,易于学习,伤口愈合,这是与人类相媲美的强大的模型。
Introduction
伤口愈合的受损是负责重大的发病率和死亡率全球糖尿病患者1,2,这是尤其如此。在人类中,伤口愈合是一个连续的过程,其中有显着的重叠3。紧随伤人,炎症过程的开始。炎症细胞释放的因素,鼓励细胞增殖,迁移和血管生成的过程。再上皮化和新组织形成后重构的相位,既需要细胞凋亡及基质蛋白如胶原蛋白的重新组织。
复杂伤口愈合目前尚未在体外复制,这需要使用的动物模型。迄今为止,伤口愈合的研究已被限制到大型动物模型中,如猪,以确保愈合过程是等价的,与人类。但是,使用大阿尼玛LS这类研究可能是困难的房子,并总是不踏实4。该实验室的的鼠标代表经济动物模型,可以很容易地操纵基因机制研究5-7。然而,小鼠的伤口愈合不同的人类的,主要是由于收缩的过程中,8。这部分是由于广泛皮下横纹肌层脂膜肉质是主要缺席的人类。在小鼠中,该肌肉层使皮肤更深的肌肉独立移动,负责皮肤以下伤人的迅速收缩。
为了克服这个限制,可以适应小鼠的伤口愈合,用夹板固定( 图1)8,9复制人类伤口愈合。在这段视频中,我们展示了夹板小鼠伤口模型,消除伤口收缩和更接近人类的过程中重新epithelialization和新组织的形成。在此模型中,两个全层切除,包括脂膜肉质上创建的背部,一个在中线的每一侧的鼠标。有机硅夹板放置在伤口周围与粘合剂的援助和夹板然后间断缝合固定。各小鼠作为它自己的控制,与接受治疗的伤口与其他车辆控制,从而降低动物数量。局部应用后,透明的闭塞敷料被应用。该敷料可以被删除,当需要用于进一步的局部应用和/或测定伤口面积10,11。通过免疫组化的实验,在完成伤口缝合,形态结构和新生血管的程度可以评估。这种经济和容易执行的模型也可以被用来评估糖尿病或其它病理生理学的上下文中的伤口愈合。
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Protocol
1。夹板包扎敷料的制备
- 0.5毫米厚的硅薄膜和使用剪刀或活检冲床创建硅磁盘上,勾勒出10毫米的圆圈。
- 中心一个5毫米的穿刺活检拳打在10 mm的圆圈中间,然后用力按压,创建一个孔洞,形成一个“甜甜圈”般的光盘将被用来作为夹板。
- 纲要10毫米的圆圈,在一个透明的闭塞敷料,如Opsite和使用剪刀创建循环敷料。
2。实验动物
- 获取将要执行的所有实验动物伦理委员会批准。
- 使用8周龄(22-26克)的雄性小鼠从商业饲养员( 如杰克逊实验室)。
- 养老鼠在标准条件下,21℃,12小时免费获得食物和水的光暗周期。
- (可选):糖尿病可在6〜7周龄小鼠诱导由丸腹腔仁济CTION 165毫克/公斤菌素(柠檬酸缓冲液,pH值4.5),高血糖定期血糖监测(血糖仪AccuChek)确认。糖尿病小鼠有尿,所以他们的床上用品可能需要更频繁地更换,以消除潮湿,应密切监测它们的权重。
3。麻醉和手术的准备
- 诱导全身麻醉,用5%异氟醚在100%的氧气(流速1升/分钟),并用1-3%异氟烷维持麻醉。
- 确保深踩油门反射被抑制的鼠标和鼠标放置在俯卧位。
- 准备手术的区域,从基地的脖子,用指甲刀去除毛皮〜3厘米进一步回落的背部和两个肩胛骨之间。
- 脱毛霜轻应用,可申请不超过2分钟。可以使用湿纱布,以确保所有的奶油,并除去剩余的毛皮。
- 擦拭皮肤与酒精棉签和两个应用程序10%的聚维酮碘(优碘)和悬垂鼠标。
4。伤口的切除和夹板
- 在图1中图解表示的小鼠的伤口愈合模型。
- 使用无菌4毫米活检冲床概述两个圆形型态的伤口上的鼠标的中线的两侧肩的水平(参见图2a-2b的 )。
- 使用锯齿钳,解除皮肤的轮廓和虹膜剪创建一个全层伤口穿过皮下组织( 图2C-2D),包括脂膜肉质( 图2e)在中间,和消费的一块圆形组织。
- 重复该过程中线的另一侧( 图2f)上的伤口。
- 撕下的保护涂层从硅夹板的每一侧。
- 应用cyanoacryla“特粘合剂( 如强力胶或胶疯狂)一侧的硅酮夹板。
- 中心夹板的伤口( 图2g)和夹板固定中断6-0尼龙线缝合,以确保定位( 图2H)。
- 重复的夹板上的其他伤口的过程。
- 如果需要在此时间点,适用于一个伤口( 图2i),车辆控制的其他的治疗化合物以进行测试(100微升)。
- 用透明闭塞敷料(例如,OpSite)( 图2j的-2k的 )覆盖伤口。
- 一把尺子放在下面的夹板和采取的显微照片( 图21)。
6。术后管理
- 卡洛芬(5毫克/公斤),每天服用一次通过皮下注射液用于手术后疼痛缓解。
- 手术后动物笼和维护热米安非他明类兴奋剂,直到完全康复。
- 监控动物每天两次,表现为疼痛和体重减轻。我们没有观察到毛的行为显示疼痛或减肥。
7。伤口的测量和处理
- 每天可以测量伤口。
- 诱导全身麻醉,用5%异氟醚气体(流速为1升/分钟),然后确保鼠标深感觉反射被抑制使用1-3%异氟醚。
- 轻轻剥开闭塞敷料钳。
- 手术使用的游标卡尺来测量伤口的直径。沿X,Y和Z轴( 图2米-2°),以及以供将来参考的显微照片( 图2p)的三个测量值的平均值。
- 可选:在这个时候,可以评估的动物的血液灌流,用激光多普勒成像仪( 图2Q)。
- 可以重新适用的治疗化合物的车辆控制的perforMED在这一点上。
- 一个干净透明的包扎,然后再应用和动物保持温暖,直到完全康复。
- 注:如果没有正确固定夹板,伤口会很容易收缩(2R图 )。
8。组织学分析
- 安乐死过量的麻醉小鼠后10天。
- 使用镊子和,手术刀刀片去除缝线,并仔细剥离夹板。
- 使用虹膜剪创建一个宽,全切除伤口区域周围和下孵育组织中的4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水(PBS),在4℃下过夜。
- 组织转移到17%蔗糖的PBS溶液中的另外24小时,在4℃,然后除去多余的溶液在-80℃下通过仔细地涂抹在OCT化合物中,冷冻的组织和地点
- 苏木精和伊红染色,可以使用可视化的卷绕结构和上皮缺口。 Neovascularisation免疫组化分析,可以评估的数量来确定的毛细血管(血管性血友病因子)。
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Representative Results
甲伤口闭合曲线确定伤口的平均直径,通过计算和表达的结果的百分比, 即 100 - (0天的直径/天×直径)。在这个实验中的治疗化合物(或车辆用控制)每天施加到伤口。的治疗化合物大大加速伤口闭合( 图3)。重要的是要注意,夹板必须维持的持续时间的实验,去除夹板会导致伤口迅速收缩( 图2R)和伤口愈合的人类中观察到的模式偏离。
图1。示意图小鼠的伤口愈合模型,在这个模型中,两个全层伤口上创建了EI进一步侧中线允许每个鼠标作为自己的控制。硅胶夹板坚持和缝合伤口周边,以防止伤口收缩,人类提供了一个可复制的模型。
图2。伤口愈合手术和手术后的测量,用碘酒和酒精对皮肤的脱毛和准备(AB)活检冲头轻轻地用两个圆勾勒鼻背,两侧的中线(三)小切口。然后创建及(d)(E)包括panniculosus的肉质,(六)建立两个全层伤口一块圆形皮肤被删除,(G),然后应用到胶粘剂SILIC一个夹板与夹板附着到伤口周长(高)的夹板,然后用缝线固定的(一)治疗局部应用(JK)闭塞,透明敷料被放置在伤口上附着夹板(粘合剂可以使用,如果需要的话)。每天服用(升)的显微照片和伤口区域从第(m)y轴,(正)的X轴及(o)z轴的三个直径测量的平均值计算的(第)代表照片的伤口10天,注意到小伤口在右边的治疗化合物处理。(Q)代表激光多普勒图像的伤口血流灌注6天。(R)例伤口迅速收缩去除硅夹板后。
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图3。代表伤口闭合图形。伤口面积计算出的平均三个每日直径的测量,沿x,y和z轴。在第0天初始伤口面积的百分比表示为伤口闭合。
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Discussion
这是一个实验小鼠模型皮肤伤口愈合。在此模型中阿显着的特征是利用硅胶夹板,以防止伤口收缩,使再上皮化,形成新的组织,可能会发生,类似的过程发生在人类。此模型是通用的,可以用来评估在生理和病理( 如糖尿病)的设置的伤口愈合。该模型也可使用在一种经济的环境中,以评估潜在的伤口愈合或血管生成疗法。每个鼠标作为自己的控制,动物数量最小化。此模型所需的外科手术技术的高度复杂的,因此,该模型可广泛使用的以相对较少的手术经验。
为了确保重现性和准确的量化,它是夹板必须有足够的坚持和锚定缝合皮肤,使t这里是创建两个伤口之间的最小延迟。倾向的小鼠的伤口迅速收缩以下松动的夹板或部分切除因搔抓通过鼠标需要每天监测的夹板。仔细粘合剂应用还需要夹板可能促进刮伤周围的健康皮肤,以减少刺激。这也是非常重要的是要遵循无菌技术,并彻底消毒设备,特别是卡尺,小鼠之间。也必须加以考虑的闭塞敷料中的应用,特别是如果伤口不会被治疗或每天穿着。 opsite和Tegaderm(3M)的敷料是可比的12,它已被证明Tegaderm敷料可能只有1-2天保持附着。如果长期的伤口敷料,需要一种替代方法已经由仲和他的同事13。
这种模式的潜在弱点可能包括炎症Ð由于锚定的缝合线,扩散之间的伤口治疗或车辆进入体循环的处理的条目。在诱导局部炎症方面的缝合线,缝合线被放置在比较远的从伤口,每个伤口一样的,因此,任何的炎症反应,可能会发生伤口之间应该是相似的。同样,伤口之间的距离和水肿的伤口之间缺乏将最大限度地减少两张床之间的扩散。有一些证据表明,治疗可能会进入全身血液循环,这可能会加速伤口愈合,控制9,10。窝小鼠的程度来确定治疗进入全身血液循环,可以利用,其中两处伤口只与车辆处理。伤口缝合治疗小鼠仅与车辆之间,车辆和治疗小鼠接受率的差异,然后进行比较。
“总之,我们已经证明了一个相对简单的小鼠模型具有许多观察到的功能在人类伤口愈合的伤口愈合。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
什么都没有透露。
Acknowledgments
笔者想承认资金支持,从国家健康和医学研究委员会(NHMRC),澳洲(项目格兰特ID:632512)。路易丝·邓恩由国家心脏基金会事业发展奖由NHMRC早期职业团契和克里斯蒂娜Bursill的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Press-to-seal silicone sheeting 0.5 mm thick | Invitrogen | P18178 | Cut into "donuts" with external diameter of 1cm external, 0.5 cm internal diameter |
Biopsy punch 5 mm | Steifel | BC-B1-0500 | To outline wound area to be excised |
Vannas scissors 8.5 cm curved | World Precision Instruments | 501232 | For wound incision and excision |
Dumonte #7b forceps, 11 cm | World Precision Instruments | 501302 | To grip skin when creating incision and excising skin |
Graefe forceps, serrated 10cm | World Precision Instruments | 14142 | To help attach silicone splint to skin |
Needle holder, smooth jaws, curved, 12.5 cm | World Precision Instruments | 14132 | |
Malis forceps, smooth, straight, 12 cm | Codman and Shurtleff, Inc (J&J) | 80-1500 | To suture the silicon rings to the skin |
Ruler, 0.5 mm gradation | n/a | ||
Calipers 0.25 mm gradation | Duckworth and Kent | 9-653 | To measure wound area |
Opsite FlexiFix transparent adhesive film. 10 cm x 1 m | Smith & Nephew | 66030570 | |
Rimadyl (Carprofen) | Pfizer | 462986 |
References
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