Summary
Un modello murino di guarigione della ferita cutanea che può essere utilizzato per valutare composti terapeutici in contesti fisiologici e fisiopatologici.
Abstract
Guarigione delle ferite e la riparazione sono i processi biologici più complessi che si verificano nella vita umana. Dopo l'infortunio, diverse vie biologiche si attivano. La guarigione della ferita, che si verifica in pazienti diabetici, ad esempio, può portare ad esiti sfavorevoli gravi come l'amputazione. Esiste, pertanto, una crescente impulso per sviluppare nuovi agenti che promuovono la riparazione della ferita. La sperimentazione di questi è stato limitato a grandi modelli animali quali maiali, che sono spesso impraticabile. Topi rappresentano il modello preclinico ideale, in quanto sono economici e suscettibili di manipolazione genetica, che consente l'indagine meccanicistica. Tuttavia, la guarigione della ferita in un mouse è fondamentalmente diversa da quella degli esseri umani, come si verifica principalmente attraverso la contrazione. Il nostro modello murino supera questo incorporando una stecca intorno alla ferita. Con splintaggio la ferita, il processo di riparazione è quindi dipendente da riepitelizzazione, la proliferazione cellulare e l'angiogenesi, che rispecchiano da vicino laprocessi biologici di guarigione della ferita umana. Pur richiedendo coerenza e cura, questo modello murino non comporta tecniche chirurgiche complicate e consente la prova robusta di agenti promettenti che possono, per esempio, promuovere o inibire l'angiogenesi infiammazione. Inoltre, ogni mouse funge come proprio controllo come due ferite sono preparati, consentendo l'applicazione sia del composto in esame e il controllo del veicolo sullo stesso animale. In conclusione, abbiamo dimostrato una, facile da apprendere, e robusto modello pratico di guarigione delle ferite, che è paragonabile a quello umano.
Introduction
La guarigione della ferita è responsabile per una significativa morbidità e mortalità in tutto il mondo, questo è particolarmente vero per chi soffre di diabete mellito di 1,2. Negli esseri umani, la guarigione della ferita è un continuum di processi, in cui vi sia una significativa sovrapposizione 3. Subito sono iniziati seguenti, processi infiammatori ferimento. Cellule infiammatorie rilasciano fattori che favoriscono i processi di proliferazione cellulare, la migrazione e l'angiogenesi. Dopo riepitelizzazione e formazione del nuovo tessuto vi è una fase di rimodellamento che comporta sia apoptosi e riorganizzazione di proteine della matrice come il collagene.
La complessità di guarigione della ferita attualmente non può essere replicata in vitro e ciò richiede l'uso di modelli animali. Ad oggi, gli studi cicatrizzanti sono stati limitati a grandi modelli animali, come maiali, per garantire che i processi di guarigione sono equivalenti e comparabili per l'uomo. Tuttavia, utilizzando gran animals per tali studi possono essere difficili da casa e non sono sempre pratici 4. Il topo di laboratorio rappresenta un modello animale economico che può essere facilmente manipolato geneticamente per indagini meccanicistica 5-7. Tuttavia, le ferite guariscono murini diverso ai umana di, principalmente a causa del processo di contrazione 8. Questo è in parte dovuta ad un esteso strato muscolare striato sottocutaneo chiamato panniculus carnosus che risulta praticamente assente nell'uomo. Nei topi, questo strato muscolare permette alla pelle di muoversi indipendentemente dei muscoli più profondi ed è responsabile della rapida contrazione della pelle seguente ferimento.
Per superare questa limitazione, cicatrizzante murino può essere adattato per replicare guarigione della ferita umana mediante l'uso di una stecca (Figura 1) 8,9. In questo video dimostriamo il modello murino ferita steccata che elimina la contrazione della ferita e più strettamente approssima i processi umani di ri-epithelializazione e la formazione di nuovo tessuto. In questo modello due escissioni tutto spessore che includono il pannicolo carnosus vengono creati sul dorso, uno su ciascun lato della linea mediana del mouse. Una stecca silicone è disposto intorno alla ferita con l'assistenza di adesivo e la stecca poi fissato con punti staccati. Ogni mouse funge come proprio controllo, con una ferita in trattamento e l'altro controllo del veicolo, riducendo così il numero degli animali. A seguito di applicazioni topiche, viene applicata una medicazione occlusiva trasparente. La medicazione può essere rimossa quando richiesto per ulteriori applicazioni topiche e / o misurazione della superficie della ferita 10,11. Al completamento di esperimenti, chiusura della ferita, architettura morfologica e grado di neovascolarizzazione può essere valutata mediante immunoistochimica. Questo economico e facile da eseguire modello può anche essere utilizzato per valutare la guarigione delle ferite nel contesto del diabete mellito o altre pathophysiologies.
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Protocol
1. Preparazione di stecche e medicazioni occlusive
- Delineare 10 mm su cerchi 0,5 millimetri teli di silicone spessa e uso forbici o una biopsia per creare i dischi di silicone.
- Centro un punzone 5 mm biopsia nel mezzo del cerchio 10 mm pressione al fine di generare un foro per formare una "ciambella"-come disco che verrà utilizzato come stecco.
- Delineare 10 mm su cerchi una medicazione occlusiva trasparente come opsiti e usare le forbici per creare condimenti circolari.
2. Animali da esperimento
- Ottenere Animal approvazione Comitato Etico per tutti gli esperimenti che verranno eseguite.
- Utilizzare 8 settimane di età (22-26 grammi) topi maschi C57BL/6J da un allevatore commerciale (ad esempio The Jackson Laboratories).
- Tenere i topi in condizioni standard di 21 ° C e un ciclo di 12 ore luce-buio con libero accesso a cibo e acqua.
- (Opzionale): Il diabete può essere indotta in 6-7 settimane di età i topi da un bolo intraperitoneale injection di 165 mg / kg streptozotocin (in tampone citrato, pH 4,5), con iperglicemia confermato dal monitoraggio della glicemia normale (accuchek glucometro). Topi diabetici possono avere poliuria e quindi la loro biancheria da letto possono avere bisogno di essere cambiato più frequentemente per eliminare l'umidità e il loro peso deve essere attentamente monitorati.
3. Anestesia e preparazione Operativo
- Indurre l'anestesia generale usando 5% isoflurano in ossigeno al 100% (portata 1 L / min) e mantenere l'anestesia con isoflurano 1-3%.
- Assicurarsi che i profondi riflessi pedale del mouse vengono soppressi e posizionare il mouse in posizione prona.
- Preparare la regione operativa rimuovendo pelliccia con tagliaunghie dalla base del collo a 3 cm più in basso la schiena e tra le due scapole.
- Una leggera applicazione di crema depilatoria può essere applicata per non più di 2 min. Tamponi di garza umida può essere utilizzato per garantire tutti crema e rimanendo pelo viene rimosso.
- Asciugare la pelle con untampone imbevuto di alcool e due applicazioni di 10% di povidone-iodio (Betadine) ed attaccare il mouse.
4. Escissione e splintaggio Ferita
- Rappresentazione schematica del modello murino di guarigione è presentato nella figura 1.
- Utilizzare una sterile 4 millimetri biopsia per delineare due schemi circolari per la ferita ai lati della linea mediana del topo a livello delle spalle (vedi figure 2a-2b).
- Utilizzare seghettate pinze per sollevare la pelle nel mezzo del contorno iride e forbici per creare una ferita a tutto spessore che si estende attraverso il tessuto sottocutaneo (Figure 2c-2d), compreso il pannicolo carnosus (figura 2e), ed asportare il pezzo circolare di tessuto.
- Ripetere il processo per la ferita sull'altro lato della linea mediana (Figura 2f).
- Rimuovere rivestimento protettivo plastico da ogni lato della stecca silicone.
- Applicare cyanoacrylate collante (ad esempio colla eccellente o Krazy Glue) ad un lato di una stecca di silicone.
- Centro la stecca sopra la ferita (Figura 2g) e ancora la stecca con interrotte 6-0 punti di sutura in nylon per garantire il posizionamento (Figura 2 ore).
- Ripetere il processo di immobilizzazione, dall'altro ferita.
- Se richiesto a questo punto temporale, applicare il composto terapeutico da testare (fino a 100 microlitri) ad uno ferita (Figura 2i), e il controllo del veicolo all'altro.
- Coprire la ferita con una medicazione occlusiva trasparente (per esempio, nell'Opsite) (Figura 2j-2k).
- Un righello è posto sotto le stecche e una microfotografia presa (Figura 2l).
6. Gestione postoperatoria
- Carprofene (5 mg / kg) è somministrato una volta al giorno tramite iniezione sottocutanea per il sollievo del dolore post-operatorio.
- Dopo gli animali di chirurgia sono in gabbia e mantenuto sui calore m individualmenteats fino pienamente recuperato.
- Monitorare gli animali due volte al giorno per le manifestazioni di dolore e di perdita di peso. Non abbiamo osservato display comportamentali lordo di dolore o perdita di peso.
7. Ferita di misurazione e trattamento
- La ferita può essere misurato quotidianamente.
- Indurre l'anestesia generale, usando gas isoflurano 5% (tasso di flusso di 1 L / min), e quindi garantire i riflessi sensoriali profonde del topo sono soppresse utilizzando 1-3% isoflurano.
- Delicatamente staccare la medicazione occlusiva con una pinza.
- Utilizzare pinze chirurgiche per misurare il diametro ferita. Prendiamo la media di tre misurazioni lungo la X, Y e Z (Figure 2m-2o), nonché una microfotografia riferimento futuro (Figura 2p).
- Opzionale: In questo momento l'animale può essere valutata per la perfusione sanguigna utilizzando un laser Doppler Imager (Figura 2q).
- Riapplicazione del composto terapeutico ed il controllo del veicolo può essere effetmed a questo punto.
- Una medicazione occlusiva trasparente pulita viene poi riapplicata e gli animali tenuto caldo fino alla completa guarigione.
- Nota: se stecche non sono protetti adeguatamente la ferita facilmente contrarre (Figura 2r).
8. Analisi istologica
- Euthanize i topi dopo 10 giorni con una dose eccessiva di anestesia.
- Utilizzando pinze e una lama da bisturi rimuovere i punti di sutura e con attenzione staccarsi la stecca.
- Usare le forbici iris per creare un'ampia, completa escissione intorno e sotto l'area della ferita e incubare il tessuto in 4% paraformaldeide in tampone fosfato salino (PBS) a 4 ° C durante la notte.
- Trasferimento di tessuto al 17% di saccarosio in soluzione PBS per un ulteriore 24 ore a 4 ° C e rimuovere la soluzione in eccesso tamponando accuratamente sul tessuto e posto in OCT e congelare a -80 ° C.
- Ematossilina ed eosina possono essere utilizzati per visualizzare la struttura ferita e gap epiteliale. Neovascularisation può essere valutata mediante analisi immunoistochimica per determinare il numero di capillari (utilizzando Von Willebrand).
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Representative Results
Una curva chiusura della ferita è determinato calcolando il diametro medio della ferita ed esprimere i risultati in percentuale, cioè 100 - (giorno 0 diametro / diametro X Giorno). In questo esperimento un composto terapeutico (o controllo veicolo) è stato applicato giornalmente sulla ferita. Il composto terapeutico chiusura della ferita notevolmente accelerato (Figura 3). È importante notare che le stecche devono essere mantenuti per tutta la durata dell'esperimento, come la rimozione di stecche porti rapidamente contrazione della ferita (Figura 2r) e divergere dal modello di guarigione della ferita osservata nell'uomo.
Figura 1. Rappresentazione schematica del modello murino di guarigione delle ferite. In questo modello, due ferite a tutto spessore vengono creati su EIther lato della linea mediana che permette ogni mouse per servire come il loro controllo. Stecche silicone sono rispettate e suturati al perimetro ferita per prevenire la contrazione della ferita, fornendo un modello replicabile a quello umano.
Figura 2. Chirurgia guarigione delle ferite e misurazioni post-chirurgiche. Following epilazione e preparazione della cute con iodio e alcool (ab) un punzone biopsia viene delicatamente usati per delineare due cerchi sul dorso, due lati della linea mediana. (C) Una piccola incisione viene quindi creato e (d) un pezzo circolare di pelle viene rimosso, (e) compresa la panniculosus carnosus, (f) per creare due ferite a tutto spessore. (g) adesivo viene quindi applicata al silic uno stecche e le stecche rispettate il perimetro della ferita. (h) Stecche vengono poi fissati con punti di sutura. (i) I trattamenti sono applicati per via topica e (jk) una occlusiva, medicazione trasparente viene posto sopra la ferita e rispettate le stecche (adesivo può essere utilizzati se necessario). (l) microfotografie sono presi quotidianamente e l'area della ferita viene calcolata dalla media di tre misurazioni del diametro sull'albero (m) asse y, (n) xe (o) z. (p ) Una foto rappresentative delle ferite al giorno 10, notando la ferita più piccola a destra che è stata trattata con un composto terapeutico. (q) Rappresentante del laser Doppler immagine di perfusione sanguigna della ferita al giorno 6. (r) Esempio di rapida delle ferite contrazione dopo rimozione delle stecche di silicone.
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Figura 3. Rappresentante ferita grafico chiusura. Area della ferita viene calcolata dalla media di tre misurazioni del diametro giornaliere lungo la x, yez assi. La chiusura della ferita è espresso come percentuale di area iniziale della ferita al giorno 0.
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Discussion
Questo è un modello murino sperimentale di guarigione della ferita cutanea. Una caratteristica significativa di questo modello è l'uso di stecche di silicone per prevenire la contrazione della ferita in modo che possono verificarsi riepitelizzazione e formazione del nuovo tessuto, rendendolo simile al processo che si verifica negli esseri umani. Questo modello è versatile e può essere utilizzato per valutare la guarigione delle ferite in ambienti sia fisiologici e fisiopatologici (diabete mellito). Il modello può anche essere utilizzato per valutare la potenziale guarigione della ferita o terapeutica dell'angiogenesi in un ambiente economico. Con ogni mouse che agisce come proprio controllo, numero di animali sono ridotti al minimo. Le tecniche chirurgiche necessarie per questo modello non sono molto sofisticati, quindi questo modello può essere ampiamente utilizzato da coloro con relativamente poca esperienza chirurgica.
Per garantire la riproducibilità e quantificazione accurata è indispensabile che la stecca sia sufficientemente rispettato ed ancorata alla pelle con suture, e che tqui è minimo ritardo tra la creazione delle due ferite. La propensione delle ferite murini di contrarre rapidamente dopo l'allentamento della stecca o parziale rimozione a causa di graffi con il mouse richiede il monitoraggio quotidiano delle stecche. È richiesta anche l'applicazione attenta di adesivo per ridurre al minimo l'irritazione della pelle sana intorno alla stecca che possono promuovere graffi. E 'anche molto importante seguire le tecniche asettiche e accuratamente disinfettare attrezzature, in particolare i calibri, tra i topi. L'applicazione della medicazione occlusiva va anche considerato, soprattutto se ferite non stanno per essere trattati o preparate giornalmente. Opsiti e Tegaderm (3M) medicazioni sono comparabili 12, ed è stato dimostrato che le medicazioni Tegaderm possono solo rimanere aderito per 1-2 giorni. Dovrebbero medicazioni a più lungo termine sia necessario un approccio alternativo è stato descritto da Chung e colleghi 13.
I potenziali punti deboli di questo modello possono comprendere infiammazione d ue per l'ancoraggio di suture, la diffusione del trattamento o veicolo tra le ferite e l'entrata di trattamento nella circolazione sistemica. Per quanto riguarda le suture inducono infiammazione locale, le suture vengono posizionati relativamente lontano dalla ferita e come ogni ferita viene creato lo stesso, quindi qualsiasi infiammazione che può verificarsi dovrebbe essere simile tra ferite. Analogamente, la distanza tra le ferite e una mancanza di edema tra le ferite minimizzerebbe diffusione tra i due letti. Vi è qualche evidenza che un trattamento può entrare nella circolazione sistemica, che può accelerare la guarigione della ferita controllo 9,10. Per determinare l'entità di un trattamento di entrare nella circolazione sistemica, topi littermate potrebbero essere utilizzati, in cui le due ferite sono trattate solo sul veicolo. Le differenze nei tassi di chiusura della ferita tra topi trattati solo con il veicolo, ed i topi che ricevono sia il veicolo che il trattamento potrebbe quindi essere confrontati.
"> In conclusione, abbiamo dimostrato una relativamente semplice modello murino di guarigione delle ferite che presenta molte delle caratteristiche osservate nella guarigione della ferita umana.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il sostegno finanziamento dal National Health and Medical Research Council (NHMRC) dell'Australia (Progetto di Grant ID: 632512). Louise Dunn è stato sostenuto da un NHMRC Early Career Fellowship e Christina Bursill dal National Heart Foundation Fellowship Career Development.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Press-to-seal silicone sheeting 0.5 mm thick | Invitrogen | P18178 | Cut into "donuts" with external diameter of 1cm external, 0.5 cm internal diameter |
| Biopsy punch 5 mm | Steifel | BC-B1-0500 | To outline wound area to be excised |
| Vannas scissors 8.5 cm curved | World Precision Instruments | 501232 | For wound incision and excision |
| Dumonte #7b forceps, 11 cm | World Precision Instruments | 501302 | To grip skin when creating incision and excising skin |
| Graefe forceps, serrated 10cm | World Precision Instruments | 14142 | To help attach silicone splint to skin |
| Needle holder, smooth jaws, curved, 12.5 cm | World Precision Instruments | 14132 | |
| Malis forceps, smooth, straight, 12 cm | Codman and Shurtleff, Inc (J&J) | 80-1500 | To suture the silicon rings to the skin |
| Ruler, 0.5 mm gradation | n/a | ||
| Calipers 0.25 mm gradation | Duckworth and Kent | 9-653 | To measure wound area |
| Opsite FlexiFix transparent adhesive film. 10 cm x 1 m | Smith & Nephew | 66030570 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Pfizer | 462986 |
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