Summary
生理学的および病態生理学的環境における治療用化合物を評価するために使用され得る皮膚の創傷治癒のマウスモデル。
Abstract
創傷治癒と修復は、人間の生活の中で発生する最も複雑な生物学的プロセスである。怪我の後、複数の生物学的経路が活性化。例えば糖尿病患者に起こる障害創傷治癒は、このような切断などの重篤な不利な結果につながることができます。創傷修復を促進する新規な薬剤を開発するために増加させる原動力は、したがって、がある。これらのテストは、例えば、しばしば非実用的であるブタなどの大型動物モデルに限られていた。彼らは経済的で機械的な調査が可能に遺伝子操作に適しているようにしたマウスは、理想的な前臨床モデルを表しています。しかし、マウスにおける創傷治癒は、それが主に収縮を介して行われるように、人間のそれとは根本的に異なる。我々のマウスモデルは、創傷の周りに添え木を組み込むことによって、これを克服する。傷を副木で、修復プロセスが密接にミラー上皮化、細胞増殖や血管新生に次に依存しているヒトの創傷治癒の生物学的プロセス。一貫性とケアを必要とする一方で、このマウスモデルは、複雑な手術手技を伴い、例えば、血管新生を促進したり、炎症を阻害する可能性がある有望な薬剤の堅牢なテストのためにできません。 2創傷を調製するようさらに、各マウスは、試験化合物と同じ動物上の車両制御の両方のアプリケーションを可能にし、それ自体の対照として作用する。結論として、私たちは、人間に匹敵する創傷治癒の実用的に学ぶことが簡単に、かつ堅牢なモデルを示しています。
Introduction
障害創傷治癒にはかなりの罹患率と死亡率を世界的に責任があるが、これは糖尿病1,2の患者のために特に当てはまります。ヒトでは、創傷治癒は3と重なる重要な存在である、工程の連続である。直後に負傷、炎症プロセスが開始されます。炎症細胞は、細胞増殖、遊走及び血管新生の過程を促進する因子を放出する。再上皮化し、新しい組織の形成後にコラーゲンなどのマトリックスタンパク質のアポトーシス及び再組織の両方を伴うリモデリングの段階がある。
創傷治癒の複雑性は、現在、 インビトロで複製され、これは、動物モデルの使用を必要とすることはできない。現在までに、創傷治癒研究は治癒過程が同等と人間に匹敵することを保証するために、例えば、ブタなどの大型動物モデルが、これらに限定されている。しかし、大規模なアニマを使用このような研究のためのlsが家に困難になり、常に実用的4ではありませんすることができます。実験用マウスは簡単に遺伝的に5-7序調査のために操作することができる経済的な動物モデルを表しています。しかし、ネズミの傷は人間の、収縮8の過程が主な原因とは異なって癒す。これは、部分的にヒトに主として存在しないか、皮筋層と呼ばれる広範な皮下横紋筋層によるものである。マウスでは、この筋層は、皮膚が独立深い筋肉の移動することができ、皮膚の次の負傷の急速な収縮を担当しています。
この制限を克服するために、マウスの創傷治癒は、スプリント（ 図1）8,9を用いてヒトの創傷治癒を複製するように構成することができる。このビデオでは、創傷収縮がなくなり、より密接に再epithelializa人間の過程を近似splintedマウス創傷モデルを実証ると新しい組織形成。このモデルでは、皮筋層を含む2つのフル厚切除がマウスの正中線の両側に背、1で作成されます。シリコーンスプリントは、接着の支援、その後中断した縫合糸で固定スプリントで傷の周囲に配置されています。各マウスことにより、動物の数を減少させる、傷一つは、治療およびその他の車両制御を受け取ると、自身のコントロールとして作用する。局所適用に続いて、透明密封包帯を適用する。さらに、局所適用および/ または創傷領域10,11の測定に必要なときに包帯を除去することができる。実験では、創傷閉鎖の終了時に、血管新生の形態アーキテクチャおよび程度は、免疫組織化学により評価することができる。この経済的モデルを実行することが容易にも糖尿病または他の病態生理との関連で創傷治癒を評価するために利用することができる。
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Protocol
1。スプリントと閉塞性ドレッシングの調製
- シリコンディスクを作成するために厚さ0.5mmのシリコンシートと利用ハサミや生検パンチで10ミリメートルの円を概説。
- センター10ミリメートルサークルの真ん中に5ミリメートル生検パンチと添え木として使用され、 "ドーナツ"のような円盤を形成するための穴を作成するためにしっかりと押します。
- などOpsiteなどの透明密封包帯に10ミリメートルの円を概説し、円形のドレッシングを作成するためにハサミを使用しています。
2。実験動物
- 実行されるすべての実験のための動物倫理委員会の承認を得る。
- 商業ブリーダー（ 例えばジャクソン研究所）から8週齢（22〜26グラム）の雄C57BL/6Jマウスを使用してください。
- 21の標準的な条件でマウスを保つ°Cと食物と水に自由にアクセスして12時間の明暗サイクル。
- （オプション）：糖尿病はボーラス腹腔麟蹄で6から7週齢のマウスに誘導することができる定期的な血糖測定（AccuChekグルコメーター）により確認高血糖と165 mg / kgでストレプトゾトシン（クエン酸緩衝液中で、pH4.5）中のction。糖尿病マウスでは、尿があるかもしれませんので、それらの寝具は湿気を排除するために、より頻繁に変更する必要があるかもしれませんし、その重みが密接に監視する必要があります。
3。麻酔と手術の準備
- 100％酸素でイソフルラン5％（流量1リットル/分）を使用して、全身麻酔を誘導し、イソフルラン1〜3％を使用して麻酔を維持します。
- マウスの深いペダル反射が抑制されていることを確認し、発生しやすい位置にマウスを置きます。
- 首の付け根から背中ダウンと2つの肩甲骨の間のさらに3 cmまでバリカンで毛を除去することにより、手術部位を準備します。
- 脱毛クリームの光照射は、2分を超えないために適用することができる。ウェットガーゼ綿棒は、すべてのクリームを確保するために使用することができ、残りの毛を除去する。
- で皮膚を拭きアルコール綿棒、10％ポビドンヨードの二つのアプリケーション（ベタジン）とマウスをドレープ。
4。傷の切除と副木
- マウスの創傷治癒モデルの概略図を図1に示されている。
- 肩のレベルで、マウスの正中線の両側に傷のために2つの円形のパターンを概説する無菌4ミリメートル生検パンチを使用してください（ 図2a-2b参照 ）。
- 皮筋層（ 図2E）を含む皮下組織（ 図2C-2D）を通って延びて全層傷、および消費税円形の作品を作成するためにアウトラインとアイリスのはさみの真ん中に皮膚を持ち上げるために鋸歯状の鉗子を使用して、組織の。
- 正中線（ 図2F）の反対側の傷のためにプロセスを繰り返します。
- シリコーンスプリントの各側面からプラスチックの保護コーティングを除去。
- cyanoacrylaを適用teの接着剤（ 例えば、スーパー接着剤またはクレイジー接着剤）シリコーンスプリントの片側に。
- センターでは、傷の上に添え木（ 図2G）と位置決め（ 図2H）を確実にするために中断された6-0ナイロン縫合糸で添え木を固定。
- 他の傷に副木プロセスを繰り返します。
- この時間の時点で必要に応じて、もう一方の傷（ 図2I）と、車両制御に（最大100μl）をテストする治療化合物を適用します。
- 透明密封包帯（例えば、OpSite）（ 図2J-2K）で傷口をカバーしています。
- 定規は、スプリントと（2リットル図 ）とら顕微鏡写真の下方に配置されている。
6。術後管理
- カルプロフェンは（5 mg / kg）を術後の疼痛緩和のための皮下注射により1日1回投与する。
- 手術動物は個別にケージと熱メートル上に維持された後ATSは完全に回復するまで。
- 痛みや体重減少の症状のために二回、毎日動物を監視します。我々は、痛みや体重減少の肉眼行動ディスプレイは観察されなかった。
7。傷の測定と治療
- 傷は、毎日測定することができます。
- 5％イソフルランガス（流量1リットル/分）を使用して、全身麻酔を誘導した後、マウスの深い感覚の反射を確実に1〜3％がイソフルラン使用して抑制されます。
- ピンセットでそっと裏閉鎖包帯。
- 巻径を測定するために外科キャリパーを使用してください。私たちは、X、YおよびZ軸方向（ 図2メートル-20）と同様に将来の参照（ 図2P）のための顕微鏡写真に沿って3つの測定値の平均を取る。
- オプション：この時点で動物はレーザードップラーイメージャ（ 図2Q）を使用して、血流のために評価することができる。
- 治療用化合物と車両制御の再アプリケーションがパフォーマンスすることができますこの時点でMED。
- きれいな透明閉鎖包帯は、その後再適用し、完全に回復するまでの動物は保温されています。
- 注：スプリントが適切に確保されていない場合、傷は容易に収縮する（ 図2R）。
8。組織学的分析
- 麻酔の過剰摂取で10日後のマウスを安楽死させる。
- 鉗子やメスの刃を使用すると、縫合糸、慎重剥がれ添え木を削除します。
- 4℃で一晩緩衝生理食塩水（PBS）創傷領域の周りや下に広い、完全切除を作成し、リンの4％パラホルムアルデヒドで組織をインキュベートするアイリスのはさみを使用しています。
- °C、その後-80℃でOCTコンパウンド、凍結、組織や場所に慎重に軽くたたくことで過剰の溶液を除去し4℃でさらに24時間PBS溶液中で17％ショ糖に組織を移す
- ヘマトキシリンおよびエオシン染色、創傷構造および上皮ギャップを可視化するために使用することができる。 Neovascularisationは、毛細管の数（フォンビルブラント因子を使用して）決定するために免疫組織化学的分析によって評価することができる。
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Representative Results
（0日目径/日のX径） -創傷閉鎖曲線は、創傷の平均直径を算出し、比率、 すなわち 100として結果を表現することにより決定される。この実験では、治療化合物（またはビヒクル対照）創傷に毎日適用した。治療化合大幅に加速された創傷閉鎖（ 図3）。これはスプリントの除去が迅速創傷収縮（ 図2R）につながり、ヒトで観察された創傷治癒のパターンから分岐するよう副木は、実験期間中維持されなければならないことに留意することが重要である。
図1。マウス創傷治癒モデルの概略図。このモデルでは、2つの完全な厚さの傷はEIに作成され各マウスは、独自のコントロールとして扱うことができるように正中線の熱側。シリコーン副木は、ヒトのものと複製モデルを提供する、創傷収縮を防ぐために、創傷の周囲に付着して縫合されている。
図2。創傷治癒の手術と術後の測定。ヨウ素とアルコールで皮膚の脱毛と準備の後は、（AB）生検パンチを穏やかに正中線の両側、背上の2つの円を概説するために使用されます（C）小切開（f）は 、2つの全層創傷を作成するために、panniculosus carnosus含む（e）は 、次に作成され、（d）は、皮膚の円形部分が除去される。（g）の接着剤は、次いで、ケイに適用される 1スプリントとスプリントは、創傷周囲に付着した。（h）のスプリントは、その後縫合糸で固定されています（I）（接着ができます治療は局所的に適用され、（JK）閉塞、透明ドレッシングは、創傷の上に配置されており、スプリントに付着必要に応じて）使用することができる。（l）を顕微鏡写真を毎日採取し、創傷領域は（m）を y軸、（n）は 、x軸及び（o）の Z軸上の3つの直径の測定値の平均から算出される。 た（p急速な傷の）10日目での傷の代表写真を、治療化合物で処理した右側に小さい傷を指摘した。（q）は 6日目での傷の血流の代表的なレーザードップラー画像。（R）例シリコーンスプリントの除去後に収縮。
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図3。描写創傷閉鎖グラフ。創傷領域は、x、y及びz軸に沿って3毎日の直径測定値の平均値から計算される。創傷閉鎖は、0日目での初期の創傷面積の割合として表される。
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Discussion
これは、皮膚の創傷治癒の実験マウスモデルである。このモデルの重要な特徴は、ヒトで発生するプロセスと、それが類似すること、再上皮化し、新しい組織の形成が起こることができるように、創傷収縮を防ぐために、シリコーン副木の使用である。このモデルは、用途が広く、生理学的および病態生理学的の両方（ 例えば、糖尿病）の設定における創傷治癒を評価するために使用することができる。モデルは、経済的な環境の中に潜在的な創傷治癒または血管新生の治療を評価するために使用することができる。独自のコントロールとして動作するそれぞれのマウスで、動物の数が最小限に抑えられます。このモデルのために必要な手術手技は、このように、このモデルは広く比較的少ない手術経験を有する者が使用することができ、高度に洗練されていません。
縫合糸で、それは添え木が十分に肌に付着して固定されていることが不可欠です再現性と正確な定量を確保し、そのTにここで2つの傷を作成する間の最小遅延はある。急激にマウスで傷に副木または部分的な除去は、次の緩みを引き締めることネズミの傷の性向は、スプリントの毎日のモニタリングを必要とします。接着剤の慎重なアプリケーションもスクラッチ促進する可能性が添え木の周りの健康な皮膚の刺激を最小限に抑えるために必要とされる。それは無菌技術をフォローし、徹底的にマウスの間で機器、特にキャリパーを消毒するためにも非常に重要です。傷は毎日処置または服装をするつもりはない場合は特に閉鎖包帯のアプリケーションも、考慮しなければならない。 Opsiteとテガダーム（3M）ドレッシング12同等であり、それはテガダームドレッシングはわずか1〜2日間付着したままであり得ることが示されている。長期的な創傷被覆材は、代替アプローチはチョンら13によって記載されている必要とされるべきである。
このモデルの潜在的な弱点は、炎症dを含むことができ縫合糸の固定にUE、傷および全身循環への治療のエントリの間に治療や車両の拡散。局所の炎症を誘発する縫合糸に関しては、縫合糸は、傷口から比較的遠くに配置され、それぞれの傷は傷の間のようになります発生する可能性があり、同じ、したがって、任意の炎症を作成される。同様に、傷と傷の間に浮腫性の欠如との間の距離は、2つのベッドの間の拡散を最小限に抑えます。治療はコントロールの治癒が9,10を巻か加速するかもしれない全身循環に入る可能性があるいくつかの証拠がある。全身循環に入る治療の程度を決定するために、同腹仔マウスは、2つの創傷を、ビヒクルのみで処理して、利用することができる。創傷のみビヒクルで処置したマウスの間に閉鎖し、車両と治療の両方を受けたマウスの速度の差は、その後、比較することができる。
">結論として、我々は、ヒトの創傷治癒において観察機能の多くを示す創傷治癒の比較的単純なマウスモデルが示されている。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、国民健康とオーストラリアの医学研究評議会（NHMRC）（：632512プロジェクト無償ID）から資金援助を承認したいと思います。ルイーズダン、国立心臓財団キャリア開発フェローシップによってNHMRC早いキャリアフェローシップとクリスティーナBursillによってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Press-to-seal silicone sheeting 0.5 mm thick | Invitrogen | P18178 | Cut into "donuts" with external diameter of 1cm external, 0.5 cm internal diameter |
| Biopsy punch 5 mm | Steifel | BC-B1-0500 | To outline wound area to be excised |
| Vannas scissors 8.5 cm curved | World Precision Instruments | 501232 | For wound incision and excision |
| Dumonte #7b forceps, 11 cm | World Precision Instruments | 501302 | To grip skin when creating incision and excising skin |
| Graefe forceps, serrated 10cm | World Precision Instruments | 14142 | To help attach silicone splint to skin |
| Needle holder, smooth jaws, curved, 12.5 cm | World Precision Instruments | 14132 | |
| Malis forceps, smooth, straight, 12 cm | Codman and Shurtleff, Inc (J&J) | 80-1500 | To suture the silicon rings to the skin |
| Ruler, 0.5 mm gradation | n/a | ||
| Calipers 0.25 mm gradation | Duckworth and Kent | 9-653 | To measure wound area |
| Opsite FlexiFix transparent adhesive film. 10 cm x 1 m | Smith & Nephew | 66030570 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Pfizer | 462986 |
References
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