Summary
En protokoll for kroniske infusjoner av glukose og Intralipid i rotter er beskrevet. Denne modellen kan brukes til å studere virkningen av næringsstoff overskudd på organfunksjon og fysiologiske parametere.
Abstract
Kronisk eksponering for høye nivåer av næringsstoffer er postulert til å påvirke funksjonen av flere organer og vev, og for å bidra til utvikling av de mange komplikasjoner forbundet med fedme og metabolsk syndrom, inkludert type 2-diabetes. For å studere de mekanismer som høye nivåer av glukose og fettsyrer påvirker pankreatisk p-celle-og utskillelsen av insulin, er det etablert en kronisk næringsstoff infusjon modell i rotte. Prosedyren består av kateteriserer den høyre halsvene og venstre karotidarterie under generell anestesi, slik at en 7-dagers rekonvalesens periode; forbinder kateter til pumpene ved hjelp av en svivel og motvekt-system som gjør det mulig for dyret å bevege seg fritt i buret, og infusjonen glukose og / eller Intralipid (en soyaolje-emulsjon som genererer en blanding av ca 80% unsaturated/20% mettede fettsyrer når det infuseres med heparin) i 72 timer. Denne modellen har flere BELIGGEger, inkludert muligheten til fint modulere mål nivåer av sirkulerende glukose og fettsyrer, mens muligheten til å co-sette mot farmakologiske forbindelser, og det forholdsvis korte tidsrom i motsetning til kosten modeller. Den kan brukes for å undersøke mekanismer for næringsstoff-indusert dysfunksjon i et mangfold av organer og for å teste effektiviteten av medikamenter i denne sammenheng.
Introduction
Kronisk forhøyet nivå av glukose og lipider i sirkulasjon har blitt foreslått å bidra til patogenesen av type 2 diabetes ved å endre funksjonen av flere organer implisert i opprettholdelsen av glukosehomeostase inkludert, men ikke begrenset til, pankreatisk p-celle (gjennomgått i 1). De glucotoxicity hypotesen tar for gitt at kronisk hyperglykemi forverrer beta-celle defekt som ga opphav til hyperglykemi i første omgang, og dermed skape en ond sirkel og bidrar til forringelse av glukose kontroll hos type 2 diabetes pasienter. Likeledes foreslår glucolipotoxicity hypotesen om at samtidig økning av glukose og lipid nivåer, som ofte observert i type 2 diabetes, er skadelig for beta celle.
Forklaring på de cellulære og molekylære mekanismer av de skadelige effektene av kronisk forhøyet næringsstoffer på bukspyttkjertelen beta-celle funksjon er nøkkelen til understanding av patogenesen av type 2-diabetes en. For å nå dette målet, har et stort antall studier undersøkte mekanismene for kronisk næringsstoff overflødig ex vivo i isolerte øyer Langerhans eller in vitro i klonal, insulin-sekresjon cellelinjer. Imidlertid er oversettelse av resultatene fra disse modellsystemer til hele organismen komplisert, særlig fordi konsentrasjonen av fettsyrer som brukes i dyrkede celler eller holmer sjelden passe sirkulerende nivåer i nærhet av beta-cellene in vivo 2.. På den annen side, har mekanismene for betacellesvikt i respons til næringsstoff overskytende blitt undersøkt i gnagermodeller av diabetes, som eksemplifisert ved den Diabetic Fatty Zucker rotte 3,4, ørkenrotte Psammomys obesus 5 og den høy-fett diett- matet mus seks. Disse modellene, er imidlertid karakterisert ved iboende metabolismeforstyrrelser og er ikke lett mottagelig for manipulasjoner av blodglukoseog / eller lipidnivåer i en mer kontrollert og mindre kronisk innstilling. For å kunne endre sirkulerende nivåer av næringsstoffer i en tidsramme dager i ellers normale dyr, har vi utviklet en kronisk infusjon modell i normale rotter som gjør oss i stand til å undersøke effekten av lipider og glukose, alene eller i kombinasjon, på fysiologiske parametre og funksjon 7,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Oversikt: Prosedyren består av kateteriserer høyre halsvene og venstre karotidarterie under generell anestesi, slik at en 7-dagers rekonvalesens periode; forbinder kateter til pumpene ved hjelp av en svivel og motvekt-system som gjør det mulig for dyret å bevege seg fritt i huset; og infusjon av glukose og / eller Intralipid (en soyaolje-emulsjon som genererer en blanding av ca 80% unsaturated/20% mettede fettsyrer Ved infusjon med heparin 9) i 72 timer.
En. Canulation av Høyre halsvene og Venstre Carotisar
- Sterilisere kirurgiske instrumenter. Canulation Slangen må også være kald-steriliseres med steriliseringsmiddelet en væske (2,6% glutaraldehyd) før prosedyren. Dypp slangen i en autoklaverte beholder for 16-24 timer. Skyll og skyll grundig med sterilt destillert vann for å fjerne alle spor av glutaraldehyd før bruk.
- Vei rotte å beregnemedikamentdoser:
Carprofen 5 mg / kg: fortynning 1/10 = Kroppsvekt (g) x 0,001 ml SC (smertestillende)
Glycopyrrolate 0,01 mg / kg: fortynning 1/10 = BW (g) X 0,0012 ml SC (antikolinerge) - Anesthetize rotte med isofluran og oksygen.
- Plasser rotte på magen sin. Barbere området bak ørene til bunnen av skuldrene. Legge rotte på ryggen. Barbere regionen under halsen til forbeina.
- Prep inngrepsstedet med klorheksidin, alkohol og jod. Administrere legemidler.
- Overfør rotte til operasjonsområdet.
- Ved en aseptisk teknikk, canulate den høyre halsvene og den venstre halspulsåre med en PE-50 en kanyle festet til en 1 ml sprøyte fylt med 5 U av heparinisert saltvann. Skyll canulas med 50 U av heparinisert saltvann for å unngå koagulering under utvinning perioden. Bruk blunted 23G nåler. Lukke hvert kanylen med en 23G pin.
- Etter operasjonen, trim ca 2,5 mm utenforbottom fortenner og sted rotte i en infusjon jakke for å hindre at canulas fra å bli spist.
- Gi oksygen (1 L / min i 10 min) for å hjelpe evakuere isofluran.
- Plasser rotte i et oppvarmet bur til den er helt våken.
- Operere fire rotter til å bruke én per infusjon tilstand (Tabell 1).
2. Postoperativ Care (Post-kirurgisk behandling og tilkobling av katetre)
- Veie rotter på dag 1 og dag 2 etter operasjonen.
- Administrer glycopyrrolate (BW (g) x 0,00048 ml) subkutant to ganger på dag 1 etter operasjonen, og en gang på dag to etter operasjonen.
- Ekstra støttende behandling kan gis hvis nødvendig: væsker, oppvarming pad, våt kosthold, oksygen terapi, smertestillende, antikolinergika.
- På dag 7 etter operasjonen, veie rottene å beregne oljestrøm til infusjon.
- Koble hver rotte i et infusjonssystem med en snor og dreibart montert på et bur grill topp (figur 1).
- Skyll canulas med fem U av heparinisert saltvann for å fjerne klumper. Skyll canulas en gang til med 50 U av heparinisert saltvann for å forebygge blodpropp.
- La rottene å akklimatisere seg til tjore og sving i minst 24 timer før infusjon kan begynne.
3. Infusjon
- Tegn 0,15 ml blod fra karotid av hver rotte og måle glykemi. Spyl jugular canulas. Bruk 50 U av heparinisert saltvann for å forhindre blodpropp i begge canulas av hver rotte.
- Overfør blodprøven til et 0,5 ml samling rør som inneholder 2% EDTA. Sentrifuger ved 10.000 rpm i 2 min og fryse plasmaet ved -20 ° C.
- Fylle to 60 ml sprøyter for hver av infusjonen forholdene som er nevnt nedenfor. Plasser sprøyten på en fremre posisjon til pumpen og plassere Sprøyte 2 på den bakre posisjon av pumpen.
- Bli med hvert par av løsninger sammen med y-kontakter og CO-EX T22 rør som har blitt sterilisert. Plasser sprøyter på en Harvard 33dual sprøytepumpe.
- Endre bur nede og fjern all mat fra buret grill toppen.
- Vei 150 g standard chow og sted på buret grill toppen.
- Koble sprøytene til svivelen på buret grill. Skyll sprøytene riktig å fjerne innestengt luft fra linjene.
- Beregn infusjon strømningshastighet ved hjelp av kroppsvekt som ble tatt før du kobler rotte til infusjon system. Priser er beregnet med en Microsoft Excel-fil som konverterer glukoseinfusjonshastigheten (GIR) i ml / t.
- Sett pumpen for å administrere strømningshastigheter i 60 ml sprøyter i henhold til produsentens innstillinger. Skriv inn kursen for Sprøyte 1 (foran sprøyte) og satsen for Sprøyte 2 (tilbake sprøyte).
- Starte pumpen.
4. Overvåking
- Etter start av pumpen, verifisere at det ikke er noen lekkasje fra svivelen eller fra canulas og at tilførsel slangen ikke er vridd. Kontroller også at det ikke er noen luftbobler islangen.
- Etter tre timers infusjon, ta en blodprøve for å overvåke glycemia. Gjenta etter 6, 24, 48, og 72 timer av infusjon. Som en forholdsregel er glycemia overvåkes også etter 30, 34, 54, og 60 timer av infusjonen. Blodsukker kan måles ved hjelp av en dråpe av helt blod ved hjelp av en bærbar glukose monitor. Dette begrenser mengden av blod trekkes under infusjonen og derfor unngår vesentlig forandre blodvolum og / eller hematokrit.
- Satsen for sprøyte en er endret basert på glykemi verdier for å opprettholde blodsukkeret på 220-250 mg / dl. Satsen for Sprøyte 2 endres ikke i løpet av 72 timer av infusjon fordi frie fettsyrer er opprettholdt på 1 mmol / L.
- Infusjon betingelser er koblet sammen, slik at volumet som mottas for kontrolldyrene tilsvarer volumet mottatt for testdyrene (tabell 1).
- Etter 24 timers infusjon, endre bur bunnen og veie maten igjen i buret grill. Tilbake oppspore del to buret grill. Gjenta etter 48 hr.
- Refill sprøyter daglig etter behov i løpet av 72 timer av infusjon.
- Under infusjonen, alltid observere rotte for tegn på betennelse eller ubehag. Gi hensiktsmessig behandling hvis nødvendig.
5. Post-infusjon Eutanasi
- Etter 72 timer med infusjon, rotter ble bedøvet intravenøst med 0,5 ml av en ketamin / xylazin cocktail (182 mg / kg ketamin og 11,6 mg / kg xylazin fortynnet 1:02 med 0,9% NaCl).
- Tå-pinch refleks brukes til å kontrollere nivået av anestesi. Ytterligere bedøvelse gis etter behov.
- Når den er bedøvet rotte, blir bukhulen åpnet med kirurgiske sakser. Rotten blir tappet for blod ved å tegne 10-15 ml blod i en sprøyte fra aorta eller vena cava.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ut av en serie på 42 rotter som gjennomgikk kirurgi, ble fem rotter tapt under den postoperative perioden og en rotte ble tapt under infusjonen, som representerer en samlet suksessrate på 86%. Den gjennomsnittlige kroppsvekt av 37 rotter som ble tilført til slutt var 608 ± 5 g før kirurgi, og 588 ± 6 g ved start av infusjonen (middelverdi ± SE, n = 37, p <0,0001 av paret t-test). Følgende representative resultater ble oppnådd i to infusjon grupper:. Saltvann (SAL), og glukose + Intralipid (GLU + IL) Tall 2A og 2B viser blodsukker og fettsyrer, henholdsvis i løpet av 72-timers infusjon periode. Ved design, er blodsukkeret opprettholdt rundt 220-250 mg / dl i løpet av infusjonen, basert på regelmessige målinger og justeringer av glukoseinfusjonshastigheten (GIR) som vist i figur 3.. Gnagere har en sterk evne til å kompensere for glukoseinfusjon ved å øke endogen insulin SEcretion. Derfor må GIR økes i løpet av infusjonen for blodglukosenivåer å bli opprettholdt ved en relativ steady-state. Likevel blodglukosenivåer tendens til å avta mot slutten av infusjonen, som vist i figur 2A. Siden dyrene er fylt med kaloribehovet næringsstoffer, de spontant minke matinntaket (figur 4).
| Infusjon Tilstand | Sprøyte 1 (fremre posisjon) | Sprøyte 2 (bakre posisjon) |
| 1 | Druesukker 70% | Saltvann |
| 2 | Saltvann | Saltvann |
| 3 | Druesukker 70% | Intralipid 20% + Heparin 20U/ml |
| 4 | Saltvann | Intralipid 20%% + Heparin 20U/ml |
Tabell 1. Infusjon regimer.
Figur 1. Fotografi av infusjon system som viser rotte med kateter på plass og tjore, sving og motvekt arm montert på buret grill.
Figur 2. . Plasmanivåer av glukose (A) og frie fettsyrer (b) under infusjon av saltløsning (SAL) eller ko-infusjon av glukose og Intralipid (GLU + IL) i en 6-måneders gamle Wistar-rotter data er gjennomsnitt ± SEM for 3 - 4 dyr i hver gruppe.
Figur 3 "src =" / files/ftp_upload/50267/50267fig3.jpg "/>
Figur 3. Justering av glukoseinfusjonshastigheten under co-infusjon av glukose og Intralipid (GLU + IL) i 6-måneder gamle Wistar rotter. Dataene er gjennomsnitt ± SEM av 4 dyr.
Figur 4. Gjennomsnittlig daglig matinntak av 6-måneder gamle Wistar rotter infused med saltvann (SAL) eller co-infused med glukose og Intralipid (GLU + IL). Data er gjennomsnitt ± SEM av 3-4 dyr i hver gruppe. ** P <0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om en rekke tidligere studier har ansatt kroniske infusjoner av glukose (f.eks 10-15) eller lipider (f.eks 16,17) hos gnagere, til vår kunnskap kombinert tilførsel av både brensel har bare blitt rapportert hos mus 18 år. Den kroniske infusjon modellen som er presentert her gir flere fordeler for å studere effektene på næringsstoff overflødig på en rekke biologiske funksjoner hos rotter. Først, det innebærer ingen genetisk overvektige gnagere, og siden vanlig fedme hos mennesker er polygenic 19, funnene er derfor mer sannsynlig å være relevant for virkningene av næringsstoff overkapasitet i den generelle befolkningen. Sekund, har denne modellen mulighet til å teste effekten av ulike næringsstoffer (spesielt sukker eller fett) på ulike sirkulerende nivåer, ved å endre sin natur og infusjonen flow rate. Tredje, muliggjør IV administreringsmåten co-infusjon av forbindelser eller stoffer sammen med Nutrients 20. Endelig er den relativt korte tidsrammen av forsøket (72 timers kontra uker for høy-fett diett indusert modeller) kostnads-og tidseffektiv for prekliniske studier.
Denne modellen har også noen ulemper og begrensninger. Først, er som alle kirurgiske modellen krever høyt utdannede og dyktige personell i aseptisk kirurgi. Sekund, som nevnt i Representative Resultater avsnitt dyrene en tendens til å kompensere for glukoseinfusjon ved å øke endogen insulinsekresjon, som krever hyppig overvåking av blodsukkernivået og justeringer av GIR å opprettholde målet blodsukkeret gjennom hele infusjonen. Tredje, er prosedyren ikke lett anvendelig til mus, noe som ville være nødvendig for å kunne bruke den i genmodifiserte dyr. Vår erfaring er kateterisering av både halsvene og halspulsåren hos mus i teknisk utfordrende og den enkleste tilnærmingen i disse mindre dyr å plassere en juGular kateter til infusjon og til prøve fra en perifer fartøy. Dette er imidlertid betraktelig begrenser volumet og frekvensen for sampling under infusjonen.
Gitt fokus for vårt laboratorium har vi benyttet denne modellen til å studere mekanismene for glucolipotoxicity i bukspyttkjertelen beta-cell 7,8. Imidlertid kan den bli brukt for å studere effektene av næringsstoff i en hvilken som helst overskytende vev og organ slik som, men ikke begrenset til, 21 hjerte, skjelettmuskel, 22, 23 og leveren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vincent Poitout er co-grunnlegger av og fikk forskningsoppdrag fra Bêtagenex Inc., en kontrakt forskningsorganisasjon som tilbyr infusjonen modellen som er presentert i denne artikkelen som en kommersiell tjeneste.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (R01DK58096 til Vincent Poitout). Vincent Poitout holder Canada Research Chair i Diabetes og bukspyttkjertelen Betacellefunksjon. Bader Zarrouki mottatt postdocs fra Merck og Eli Lilly. Ghislaine Fontes ble støttet av en post-doc fra den kanadiske Diabetes Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline 0.9% | BD | JB1324 | |
| Dextrose 70% | McKesson | ||
| Intralipid 20% | Fresenius Kabi | JB6023 | |
| Metricide (Glutaraldehyde 2.6%) | Metrex | 11-1401 | |
| Heparin Sodium 10,000 USP u/ml | PPC | ||
| Carprofen | Metacam | ||
| Glycopyrrolate | Sandoz | ||
| Isoflurane | Abbott | ||
| Chlohexidine 2% | |||
| Alcohol 70% | |||
| Iodine | |||
| PE-50 | BD | 427411 | |
| CO-EX T22 | Instech Solomon | BCOEX-T22 | |
| Connector 22G | Instech Solomon | SC22/15 | |
| Swivel 22G | Instech Solomon | 375/22PS | |
| Y-Connector 22G | Instech Solomon | ||
| Counterbalance and arm | Instech Solomon | CM375BP | |
| 23 G blunted needles | Instech Solomon | LS23 | |
| 23 G canulation pins | Instech Solomon | SP23/12 | |
| Tethers (12 inch) | Lomir | RT12D | |
| Infusion jackets | Lomir | RJ01, RJ02, RJ03, RJ04 | |
| (SM-XL) | |||
| Tether attachment piece | Lomir | RS T1 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| 1 ml syringe | BD | 309602 |
References
- Poitout, V., Robertson, R. P. Glucolipotoxicity: fuel excess and beta-cell dysfunction. Endocr. Rev. 29, 351-366 (2008).
- Poitout, V., et al.
- Unger, R. H. Minireview: weapons of lean body mass destruction: the role of ectopic lipids in the metabolic syndrome. Endocrinology. 144, 5159-5165 (2003).
- Harmon, J. S., Gleason, C. E., Tanaka, Y., Poitout, V., Robertson, R. P. Antecedent hyperglycemia, not hyperlipidemia, is associated with increased islet triacylglycerol content and decreased insulin gene mRNA level in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 50, 2481-2486 (2001).
- Bachar, E., Ariav, Y., Cerasi, E., Kaiser, N., Leibowitz, G. Neuronal nitric oxide synthase protects the pancreatic beta cell from glucolipotoxicity-induced endoplasmic reticulum stress and apoptosis. Diabetologia. 53, 2177-2187 (2010).
- Peyot, M. L., et al. Beta-cell failure in diet-induced obese mice stratified according to body weight gain: secretory dysfunction and altered islet lipid metabolism without steatosis or reduced beta-cell mass. Diabetes. 59, 2178-2187 (2010).
- Hagman, D. K., et al. Cyclical and alternating infusions of glucose and intralipid in rats inhibit insulin gene expression and Pdx-1 binding in islets. Diabetes. 57, 424-431 (2008).
- Fontes, G., et al. Glucolipotoxicity age-dependently impairs beta cell function in rats despite a marked increase in beta cell mass. Diabetologia. 53, 2369-2379 (2010).
- Stein, D. T., et al. Essentiality of circulating fatty acids for glucose-stimulated insulin secretion in the fasted rat. J. Clin. Invest. 97, 2728-2735 (1996).
- Leahy, J. L., Cooper, H. E., Weir, G. C. Impaired insulin secretion associated with near normoglycemia. Study in normal rats with 96-h in vivo glucose infusions. Diabetes. 36, 459-464 (1987).
- Hager, S. R., Jochen, A. L., Kalkhoff, R. K. Insulin resistance in normal rats infused with glucose for 72 h. The American Journal of Physiology. 260, 353-362 (1991).
- Laybutt, D. R., Chisholm, D. J., Kraegen, E. W. Specific adaptations in muscle and adipose tissue in response to chronic systemic glucose oversupply in rats. The American Journal of Physiology. 273, E1-E9 (1997).
- Jonas, J. C., et al. High glucose stimulates early response gene c-Myc expression in rat pancreatic beta cells. The Journal of Biological Chemistry. 276, 35375-35381 (2001).
- Tang, C., et al. Glucose-induced beta cell dysfunction in vivo in rats: link between oxidative stress and endoplasmic reticulum stress. Diabetologia. 55, 1366-1379 (2012).
- Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: a new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56, 1792-1801 (2007).
- Magnan, C., Gilbert, M., Kahn, B. B. Chronic free fatty acid infusion in rats results in insulin resistance but no alteration in insulin-responsive glucose transporter levels in skeletal muscle. Lipids. 31, 1141-1149 (1996).
- Goh, T. T., et al. Lipid-induced beta-cell dysfunction in vivo in models of progressive beta-cell failure. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 292, 549-560 (2007).
- Pascoe, J., et al. Free fatty acids block glucose-induced beta-cell proliferation in mice by inducing cell cycle inhibitors p16 and p18. Diabetes. 61, 632-641 (2012).
- Bell, C. G., Walley, A. J., Froguel, P.
- Fontes, G., Hagman, D. K., Latour, M. G., Semache, M., Poitout, V. Lack of preservation of insulin gene expression by a glucagon-like peptide 1 agonist or a dipeptidyl peptidase 4 inhibitor in an in vivo model of glucolipotoxicity. Diabetes Res. Clin. Pract. 87, 322-328 (2010).
- Crawford, P. A., Schaffer, J. E. Metabolic stress in the myocardium: Adaptations of gene expression. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. , (2012).
- Kewalramani, G., Bilan, P. J., Klip, A. Muscle insulin resistance: assault by lipids, cytokines and local macrophages. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab Care. 13, 382-390 (2010).
- Cusi, K. Role of obesity and lipotoxicity in the development of nonalcoholic steatohepatitis: pathophysiology and clinical implications. Gastroenterology. 142, 711-725 (2012).
