Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

الجرافين عوازل للزراعة الحيوية الطبية

Published: March 1, 2013 doi: 10.3791/50276
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1,4
1Department of Physics, Clemson University, 2Department of Pharmacology and Toxicology, East Carolina University, 3Department of Bioengineering, Clemson University, 4Center for Optical Materials Science and Engineering Technologies, Clemson University

Summary

الجرافين إمكانات كمادة طلاء لزراعة الطبية الحيوية. في هذه الدراسة أن نبرهن طريقة لطلاء سبائك الننتول مع طبقات سميكة من الجرافين نانومتر وتحديد كيفية استجابة الجرافين قد تؤثر الزرع.

Abstract

الجرافين السلس بالذرة بوصفها طلاء السطح لديها امكانات لتحسين خصائص الزرع. هذا يدل على طريقة لطلاء سبائك الننتول مع طبقات سميكة من الجرافين نانومتر لتطبيقات كمادة الدعامات. كانت تزرع الجرافين على ركائز النحاس عبر ترسيب الأبخرة الكيميائية ومن ثم نقل على ركائز الننتول. ولكي نفهم كيف يمكن تغيير طلاء الجرافين الاستجابة البيولوجية، والتحقيق بقاء الخلية من الخلايا البطانية الأبهر الفئران والجرذان خلايا العضلات الملساء الأبهر. وعلاوة على ذلك، تم فحص تأثير الطلاء، الجرافين على التصاق الخلايا والتشكل مع الفلورسنت المجهري متحد البؤر. كانت ملطخة الخلايا لالأكتين والنوى، وكانت هناك اختلافات ملحوظة بين عينات الننتول البكر مقارنة الجرافين المغلفة العينات. تم العثور على مجموع الأكتين التعبير من خلايا العضلات الملساء الأبهر الفئران باستخدام طخة غربية. البروتين خصائص الامتزاز، وهو مؤشر لthrombogenicity المحتملة، ثيحرث المحددة للمصل والفيزيولوجية مع الكهربائي للهلام. وعلاوة على ذلك، تم استخلاصه نقل المسؤول من الفيبرينوجين إلى الركيزة باستخدام رامان الطيفي. وجد أن طلاء الجرافين على ركائز الننتول استيفاء المتطلبات الوظيفية للمادة الدعامات وتحسين الاستجابة البيولوجية مقارنة الننتول غير المصقول. وهكذا، الجرافين المغلفة الننتول هو مرشح قابلة للمادة الدعامات.

Introduction

شهدت العقود الثلاثة الماضية اكتشاف العلاجات القائمة على المواد والأجهزة رواية لعلاج المرض والتشخيص. وغالبا ما تستخدم السبائك مثل رواية الننتول (نيتي) والفولاذ المقاوم للصدأ في صناعة الطب الحيوي زرع بسبب خصائصها الميكانيكية متفوقة 1-3 من ومع ذلك، لا تزال العديد من التحديات بسبب السمسة المواد الخارجية، وطاهية الحيوي التوافق. طبيعة هذه النتائج المعدنية سبائك الفقراء في الحيوية وبسبب الرشح hemocompatibility المعدنية، وعدم التصاق الخلية، وانتشار، وتجلط الدم عندما يتعلق الأمر في اتصال مع تدفق الدم (مثل القسطرات، ترقيع الأوعية الدموية، الدعامات الأوعية الدموية، صمامات القلب الاصطناعية الخ.) 1، 4، 5 ويمكن للتفاعل البروتينات أو الخلايا الحية مع سطح الغرسة يؤدي إلى استجابة مناعية قوية وسلسلة من التفاعلات الكيميائية الحيوية التي تلت ذلك قد يؤثر سلبا على وظائف الجهاز. ولذلك، فمن pertinالأنف والحنجرة لتحقيق السيطرة على التفاعلات بين زراعة الحيوية الطبية والبيولوجية بيئتها المحيطة. ويعمل في كثير من الأحيان تعديل السطح للحد من أو منع الاستجابة الفسيولوجية الضارة الناشئة عن المواد الزرع. ومن المتوقع طلاء السطح مثالية لديهم ارتفاع في قوة التصاق، همود الكيميائية، نعومة عالية، وحسن طاهية وتوافق مع الحياة. سابقا، وقد تم اختبار العديد من المواد بما في ذلك الماس مثل الكربون (DLC)، كربيد، القصدير، قيس (2) والعديد من مواد البوليمر الحيوي ومتوافق مع مواد الطلاء الزرع. 1، 6-23 ومع ذلك، فإن هذه المواد لا تزال غير قادرة على تلبية جميع المعايير الفنية لطلاء سطح زرع مناسبة.

فتحت اكتشاف طبقة سميكة من ذرة الكربون 2 ليرة سورية، والمعروفة باسم الجرافين، والأبواب لتطوير مواد متعددة الوظائف الرواية. ومن المتوقع الجرافين أن يكون المرشح المثالي لطلاء السطح منذ أن زرعهو خامل كيميائيا، على نحو سلس ودائم للغاية بالذرة. في هذه الرسالة، ونحن التحقيق في جدوى الجرافين بمثابة طلاء السطح لزراعة الطبية الحيوية. دراساتنا تشير إلى أن الننتول الجرافين المغلفة (GR-نيتي) يلبي جميع المعايير الفنية، وبالإضافة إلى ذلك يدعم العضلات الملساء ممتازة ونمو الخلايا البطانية التي تؤدي إلى انتشار خلايا أفضل. نجد أيضا أن الامتزاز على مصل GR-نيتي أعلى من الفيبرينوجين. الأهم من ذلك، (ط) أكدت القياسات الطيفية لدينا مفصلة عدم وجود انتقال الشحنة بين الجرافين والفيزيولوجية مما يشير إلى أن طلاء الصفائح الدموية الجرافين يثبط تفعيل عن طريق زرع، (الثاني) الطلاء الجرافين لا يحمل أي سمية كبيرة في المختبر لبطانة الأوعية الدموية على نحو سلس وخطوط الخلايا العضلية يؤكد توافق مع الحياة الخاصة بهم، و (الثالث) الطلاء الجرافين هي خاملة كيميائيا ودائم وغير منفذة في تدفق الدم البيئة. هذه طاهية وخصائص حيويا، جنبا إلى جنب مع سانت عاليةrength والكيميائية همود والمتانة، وتجعل الطلاء الجرافين بمثابة طلاء السطح المثالي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الجرافين طلاء من نيتي

  1. كانت تزرع الجرافين عينات المستخدمة في هذه الدراسة على ركائز (النحاس) النحاس باستخدام تقنية ترسيب الأبخرة الكيميائية، ونقل فيما بعد إلى 4،5 مم ركائز نيتي 2.
  2. وضعت مكعب رقائق (1 سم × 1 سم) في 1 بوصة الفرن أنبوب الكوارتز ويسخن إلى 1،000 درجة مئوية في وجود من 50 SCCM من H 2 و 450 من سورة SCCM.
  3. وقدم المقبل، والميثان (1 و SCCM 4) في الفرن على معدلات تدفق مختلفة لمدة 20-30 دقيقة. وأخيرا تبريد العينات إلى درجة حرارة الغرفة تحت تتدفق H 2، CH 4 وصول.
  4. المقبل، رقائق النحاس كانت تدور المغلفة مع PMMA (مخفف مع anisole 4٪) في 4،000 دورة في الدقيقة تليها المعالجة الحرارية لمدة 5 دقائق في 150 ° C. تم الحصول على الجرافين تعلق على طبقة النقش PMMA من احباط النحاس باستخدام Transene شركة، CE-100 etchant، وبعد الشطف في حمض الهيدروكلوريك 10٪ والمياه غير المتأينة لمدة 10 دقيقة.
  5. لياليتم نقل amples إلى ركائز نيتي (4.5 ملم 2) وصلب في 450 ° C في سورة (300 SCCM) وH 2 (700 SCCM) لمدة 2 ساعة لإزالة PMMA. وأخيرا، تم غسلها مع الأسيتون ركائز حل PMMA المتبقية للحصول على عينة GR-نيتي. تم استخدام XY Dilor مستوحد اللون صريف الثلاثي لتوصيف الدقيقة رامان (باستخدام الهدف 100X) لجميع NiTisamples GR-مع الإثارة نانومتر ليزر من 514،5 صول أيون +.

2. السمية في المختبر من GR-نيتي

تم زراعة الخلايا البطانية الأبهر الفئران (خلية تطبيق شركة،) على الجيلاتين المغلفة الشريحة غرف 8. لاختبار نمو الخلايا، والبكر وضعت GR-NiTisubstrates في الآبار من دون أي طلاء الجيلاتين. تم الحصول على صور المسح الضوئي المجهر الإلكتروني باستخدام S-4800 هيتاشي SEM. بالإضافة إلى ذلك، كانت تزرع أيضا خلايا الفئران الأبهر العضلات الملساء في CellBind 96-وحات جيدة كمجموعة تحكم (كورنينج) في دوlbecco في معدلة النسر متوسطة (ATCC).

  1. لاختبار بقاء الخلية، خلايا المصنف (خلايا العضلات على حد سواء البطانية وسلس) في خلايا 5 10 / بشكل جيد في الآبار التي تحتوي على نيتي البكر، 1 أو 4 SCCM SCCM GR-نيتي ركائز، حيث ذكر SCCM يتوافق مع تدفق غاز الميثان المستخدم في CVD النمو من الجرافين. كانت تزرع الخلايا للفترة الزمنية المطلوبة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2، تبادل وسائل الإعلام كل يوم.
  2. نقطة في نهاية الوقت، تمت إزالة وسائل الاعلام وسائل الاعلام وتمت إضافة جديدة تحتوي على 0.5 ملغ / مل thiazolyl الأزرق تترازوليوم بروميد (MTT أو تم الحصول عليها من سيغما) إلى كل بئر. ثم حضنت الخلايا لساعة 3 معلومات إضافية. لفحص MTS، كان الإعلام إزالة عند نقطة مرة الأخيرة واستبدالها مع 120 ميكرولتر من محلول العمل MTS (96 خلية المستوى المائي، Promega) وحضنت لمدة 3 ساعة.
  3. المقبل، وإزالة بلطف وسائل الإعلام وتمت إضافة 100 مل من dimethylsulfoxide (سيغما) إلى كل بئر. بعد ألوالجناح 10 دقيقة لبلورات MTT حل، نقل الحل لوحة أخرى أيضا. لفحص MTS، وإضافة أي dimethylsulfoxide إلى الآبار. تم نقل محتويات جيدا لوحة جديدة.
  4. كان يقرأ الامتصاصية ب 490 نانومتر وكان مصمما على البقاء في المئة بحلول تطبيع الامتصاصية إلى امتصاص متوسط ​​العينة نيتي البكر. تم القيام به لا يقل عن خمسة يكرر لكل نوع العينة.

3. الدراسات متحد البؤر المجهري من شكل الخلية

  1. مبائر للتصوير من الخلايا الأبهر الفئران العضلات الملساء، وضعت ركائز في الشريحة 8-غرفة (الحرارية العلمية). كانت المصنفة الخلايا في الخلايا 25000 / غرفة وحضنت لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  2. تم إصلاح الخلايا على الركيزة مع الفورمالديهايد 4٪ في الفوسفات مخزنة المالحة لمدة 20 دقيقة.
  3. Permeabilized مع 0.1٪ تريتون X-1 دقيقة ل.
  4. كانت ملطخة الأكتين مع phalloidin اليكسا فلور 488 (ليفتقنيات ه). تم إضافة 100 ميكرولتر من 488 phalloidin alexafluor في 200 وحدة / مل في الميثانول إلى 1.9 مل من الفوسفات مخزنة المالحة. كانت ملطخة الخلايا مع 250 ميكرولتر من 488 phalloidin alexafluor لمدة 45 دقيقة ثم يغسل ومرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة.
  5. ووضعت نواة المتوسطة الفلورسنت مع تصاعد VectaShield تحتوي على دابي (ناقلات المختبرات). تم جمع الصور مبائر باستخدام متحد البؤر نيكون TI. تم استخدام غرفة المصنف مع الخلايا دون أي الركيزة كمجموعة تحكم.

4. البروتين الامتزاز الدراسات

  1. تم قياس أبعاد الركيزة مع الفرجار قبل بدء التجارب البروتين الامتزاز. نقل ثلاثة قياسات لكل جانب من عينات مربع تقريبا وبلغ متوسط ​​للحصول على الطول والعرض.
  2. كل عينة، البكر نيتي، و1sccm 4sccm GR-NiTiwere حضنت مع 1 ملغ / مل الزلال في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أو 1 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني الفيبرينوجين في غرفة رemperature لمدة 3 ساعة.
  3. على حد سواء تم الجمع بين العينات في أنبوب microcentrifuge مع 200 ميكرولتر من العازلة عينة والحد من المغلي لمدة 5 دقائق.
  4. تم تخفيفه بعد ذلك في عينات العازلة تريس / جليكاين / SDS (بيو راد) وتشغيل من خلال هلام تريس 4-15٪ الكهربائي بولكرلميد (بيو راد) في 90 V لمدة 100 دقيقة.
  5. كانت ملطخة ثم المواد الهلامية مع الأحمر SYPRO. تمييع SYPRO الأحمر محلول (الحياة تكنولوجيز) في 1:5،000 في 7.5٪ حمض ت / ت الخليك. وصمة عار المواد الهلامية لمدة 60 دقيقة.
  6. وكميا باستخدام المواد الهلامية الصورة SP Flourchem (ألفا Innotech). شدة نيون باستخدام يماغيج البرمجيات. تم تطبيع كثافة الفلورية من كل عينة من إجمالي مساحة الركيزة وتمت مقارنة الفيبرينوجين الامتزاز الامتزاز إلى الألبومين.

5. يلطخ الغربية للتعبير البروتين

  1. تم إجراء تحليل لطخة غربية الأكتين في الخلايا مجموع الأبهر الفئران العضلات الملساء. خلايا المصنف في 10،000 خلية / الركيزة في W-96لوحة الذراع.
  2. كانت تزرع الخلايا لمدة ثلاثة أيام قبل إزالة وسائل الإعلام. تم استخراج البروتين الكلي باستخدام العازلة RIPA وتم إجراء الفحص القياسية BCA (LAMDA) لقياس البروتين الكلي.
  3. تم تخفيفه لعينات نفس التركيز في RIPA والمغلي ثم في المخزن مؤقت عينة تخفيض لمدة 5 دقائق.
  4. تم فصل البروتينات من هلام تريس 4-15٪ بولكرلميد عبر الكهربائي بنسبة 90 V لمدة 100 دقيقة. تم استخدام معيار مشكال البروتين (بيو راد) لتقييم الوزن الجزيئي البروتين.
  5. تم نقل البروتينات إلى غشاء PVDF وسدت مع الدهون غير جاف 1٪ حل (بيو راد) الحليب.
  6. وكانت المعلمة الأكتين مجموع الأكتين مع الأجسام المضادة لمكافحة الفئران الأرانب (سيغما). تم استخدام chemiluminescent BM مجموعة (روش) للكشف عن الأجسام المضادة الأولية. تم تصوير باستخدام الأغشية FlourChem SP أجهزة التصوير وتم قياس كثافة الفلورية باستخدام يماغيج البرمجيات. تم تطبيع كثافة الفلورية بمقارنة إلى الحزب الثوري المؤسسيستاين NiTisample.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الشكل 1
. الشكل 1 أ) CVD الجرافين الكريستالات نمت على رقائق النحاس يحاكي الحبوب الكريستال المعدنية (شريط النطاق: 10 ميكرون). ب) الطيف رامان من 1 SCCM (4 SCCM) الجرافين يظهر أحادي الطبقة مكثفة (أضعف نسبيا) G 'الفرقة تشير إلى (طبقة قليلة) وطبيعة الإعداد الجرافين. ج) AFM صورة الجرافين نقل إلى نيتي يظهر خشونة نانومتر 5 ~. شريط النطاق = 500 نانومتر.

الشكل 2
الشكل 2 متحد البؤر المجهر الضوئي للصور SMCS نمت على شريحة تحكم الزجاج)، ب) نيتي البكر، ج) 1 SCCM GR-نيتي ود) 4 SCCM GR-نيتي ركائز (شريط النطاق: 50 ميكرون).

E = "دائما"> الشكل 3
3 الشكل. مقايسة MTT) أن GR-نيتي ركائز (1 و SCCM 4) لا يحمل اختلاف كبير في بقاء الخلية SMC نسبة إلى نيتي البكر. ب) MTS الفحص تبين أن بقاء الخلية لمدة 3 أيام لRAECs لم يكن كبيرا مختلفة من الضوابط.

الشكل 4
الشكل 4. مسح الصور المجهر الإلكتروني لRAECs نمت أ) البكر نيتي، ب) 1 SCCM GR-نيتي وج) 4 SCCM GR-نيتي ركائز تبين أن الطلاء الجرافين يؤدي إلى شكل الخلية كروية أفضل من RAECs. شريط النطاق = 10 ميكرومتر.

الشكل 5
الشكل 5أ) الفيبرينوجين / الزلال نسبة لنيتي البكر، غرام نيتي-(1 و 4 عينات SCCM). ب) الرسم التخطيطي لمستوى الطاقة والكثافة الفيزيولوجية الالكترونية الدول عن الجرافين تظهر موازنة مستوى فيرمي. ونقل الإلكترون من الفيبرينوجين إلى GR-نيتي هو الوحيد الممكن من الدول المحتلة الالكترونية للجزيء الفيبرينوجين في الولايات الالكترونية فارغة من GR-نيتي على مستوى الطاقة نفسه. كل واحد الجرافين وقليلة هي طبقة شبه المعادن في درجة حرارة الغرفة منخفضة الكثافة مع الدول في EF مما يؤدي الى ضعف تهمة نقل (بالمقارنة مع الننتول العارية) من الفيبرينوجين إلى الجرافين.

الشكل 6
الشكل 6. الجرافين لا يحمل أي تغييرات في lineshape G-الفرقة أو تردد مما يدل على عدم وجود أي نقل المسؤول عن بروتينات البلازما. وdeconvoluوتظهر قمم تيد تم الحصول عليها من منحنى المناسب في الأسود.

الشكل 7
الشكل 7. أ) الجزء المغلفة الجرافين من بنس واحد النحاس يتعرض إلى 5٪ H 2 O 2 يبقى دون تغيير في حين أن تغير لونها الجزء المكشوف. ب) ولم يلاحظ أي تغيير في وتيرة الفرقة G-من خلال موقعنا في الدراسات رامان الموقع من GR- مغمورة في نيتي 70٪ HNO 3 يؤكد متانة الطلاء الجرافين. ج) وتضاعف الوقت لحفر النحاس في CE 100 المذيبات عند المغلفة النحاس مع الجرافين (كما في نيتي GR-) مما يدل على مناعة الأغشية الجرافين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أسفرت ترسيب الأبخرة الكيميائية (الأمراض القلبية الوعائية) طريقة العينات التي تحاكي الجرافين الكريستالات الحبوب الكريستال النحاس، كما هو مبين في الشكل 1A: توافق مع الحياة والسمسة. استخدمنا رامان الطيفي لتأكيد وجود من الجرافين (طبقة قليلة) أحادي الطبقة في 1 عينات (4 SCCM) SCCM (انظر الشكل 1B). بوضوح، 1 SCCM (4 SCCM) يحمل عينات الفرقة مكثفة (أضعف نسبيا) G 'يدل على أحادي الطبقة (طبقة قليلة) الجرافين. الشكل 1C يظهر الفحص المجهري القوة الذرية (AFM) صورة من الجرافين طبقة قليلة على ركائز نيتي. أسفرت قياسات مفصلة لدينا قيمة خشونة السطح R س = 5 نانومتر للطبقات الجرافين نقل (GR-نيتي). ومن المعروف جيدا أن تضاريس سطح ذات البنية النانومترية يؤثر بقوة شكل الخلية والتجمع في هيكل الخلية والخلايا البطانية خلايا العضلات الملساء. هذه خطوط الخلايا تستجيب للضغوط الميكانيكية الخاصة بهم عن طريق تغيير طبقة ثنائية الدهن،سيولة، والتي قد تؤثر سلبا إزفاء البروتين ودخول تفعيل مثل الكالسيوم إلى الخلايا. الأهم من ذلك، يمكن زيادة في الإجهاد التدرج الخلية غشاء تغيير التشكل وكثافة مستقبلات سطح الخلية. درسنا من أجل اختبار تأثير الطلاء على التدرجات الجرافين الإجهاد من الخلايا، والعضلات الملساء وشكل الخلية البطانية باستخدام تقنيات المجهر.

كما هو مبين في الشكل 2، على نحو سلس العضلات الخلية (SMC) مورفولوجيا على نيتي البكر هو غير كروية. علاوة على ذلك، تنتشر الخلايا قليلة تشير إلى ضعف التصاق SMCS إلى نيتي البكر. على العكس من ذلك، SMCS كثيفة كروية وعلى GR-نيتي (سواء 1 و 4 SCCM) السطوح مماثلة إلى عنصر التحكم. طلاء الجرافين يقلل الإجهاد التدرجات في الخلايا عن طريق توفير أكثر سلاسة السطوح (واضح من انخفاض قيم س R هو مبين في الشكل 1C) وبالتالي نتائج أفضل في التشكل الخلية.أجرينا لقياس بقاء الخلية والانتشار، MTT مقايسة على SMCS نمت على البكر وغرام NiTisubstrates-في 3 و 7 نقاط النهار. في هذا الاختبار، يتم تقليل صبغة MTT (اللون الأصفر) إلى صبغ formazan (اللون الأرجواني) من الانزيمات النشطة واختزال يمكن كميا لذلك تنتشر الخلايا السليمة و(أو السمسة المواد ل) عن طريق إجراء القياسات اللونية. كما هو موضح في الشكل 3A، لم نكن نلاحظ أي تغييرات كبيرة في سمية للGR-نيتي ركائز بعد 3 و 7 أيام. هذه النتائج تؤكد أن الطلاء الجرافين لا تتجاوز لحث سمية مقارنة مع ركائز نيتي البكر أنفسهم.

إعادة تأكيد آثار طلاء الجرافين، أجرينا مفصلة التصوير المجهر الإلكتروني التجارب على الفئران الأبهر الخلايا البطانية (انظر الشكل 4). الخلايا على ركائز نيتي هي البكر متفرق وممدود وهم بيضاوي ودense على ركائز GR-نيتي. تم العثور على هذه شكل الخلية وتحسين الكثافة لتكون أقرب إلى SMCS يؤكد انخفاض في الضغط التدرجات المقدمة من طلاء الجرافين. علاوة على ذلك، قمنا بقياس الجرافين السمسة الطلاء على شركة كهرباء المناطق الريفية باستخدام MTS 3 - (4،5-dimethylthiazol-2-YL) -5 - (3-carboxymethoxyphenyl) -2 - (4-sulfophenyl)-2H-تترازوليوم الفحص. الأساس المنطقي لاستخدام MTS مقايسة (بدلا من MTT) يكمن في التوافق بشكل أفضل مع وسائل الإعلام وشركة كهرباء المناطق الريفية النمو شروطه. عرض لدينا MTS الفحص على الخلية البطانية كما هو مبين في الشكل 3B، جيد جدا بقاء الخلية ويؤكد انتشار أي سمية الزائدة من الطلاء لشركة كهرباء المناطق الريفية حتى الجرافين. الأهم من ذلك، عرضت كل من 1 و 4 SCCM GR-نيتي أي تغييرات كبيرة في تكاثر الخلايا يشير إلى عدم الاعتماد على شكل الخلية على عدد من الطبقات الجرافين.

البروتين الامتزاز وHemocompatibility: تخثر الدم في المنطقة المجاورة للهكتار زرع الموادق واحدة من العقبات الرئيسية في تكنولوجيا الزرع منذ عام 2003. كما ذكر في وقت سابق، والمواد زرع يطلق شلال التخثر عندما يتعلق الأمر في اتصال مع الدم. التفاعل بين الطب الحيوي وزرع الدم يبدأ امتصاص بروتينات البلازما (مصل الزلال، الفيبرينوجين، الخ.) على سطحه. في البداية، وكثف البروتينات وفيرة للغاية مثل مصل flbrinogen، الزلال، ولكن يتم استبدال flbronectin في وقت لاحق من العوامل XII وارتفاع الوزن الجزيئي مولد الكاينين. نسبة الألبومين وكثف flbrinogen أمر حاسم في تحديد hemocompatibility من مادة بيولوجية. في السابق، كانت نسبة انخفاض الفيبرينوجين مرتبطة / الالبيومين كثف على سطح زرع الطبية الحيوية مع التصاق الصفائح الدموية منخفضة وتشكيل خثرة .. 1 كما هو مبين في الشكل 5A، GR-نيتي المعرض انخفاض الفيبرينوجين / الزلال نسبة نسبة إلى نيتي البكر أفضل مما يستدل hemocompatibility الناشئة من الجرافين. وراتي فيب / ALBكان يا أقل من ذلك بكثير لكلا SCCM 1 و 4 GR-نيتي مشيرا إلى أن hemocompatibility من الجرافين طبقة مستقلة.

ومن المعروف أن نقل الإلكترون من الجزيء الفيبرينوجين إلى زرع هو المسؤول عن تشكيل الليفين كخطوة أولى لنمو الجلطة. يسلك الفيبرينوجين كما هو مبين في الشكل 5B، أشباه الموصلات مثل الكثافة الإلكترونية أو الدول DOS (الرمز بواسطة P (E)) مع فجوة الطاقة من 1.8 إلكترون فولت. مستويات فيرمي (EF) من الفيزيولوجية وغرام نيتي-تتوازن في واجهة الخاصة بهم. مطلوب نقل المسؤول عن إلكترون واحد في الفيزيولوجية لتشكيل الليفين على نيتي البكر، ونقل الإلكترون من الجزيء الفيبرينوجين إلى GR-نيتي لا يمكن تحقيقه إلا من الدول المحتلة الالكترونية للجزيء الفيبرينوجين في الولايات الالكترونية فارغة من GR-نيتي على الصعيد نفسه الطاقة. كل واحد الجرافين وقليلة هي طبقة شبه المعادن في درجة حرارة الغرفة منخفضة مع ف (E) F E 24 وهكذا، وتبادل التهمة الحالية من الفيبرينوجين إلى الجرافين غير ذات أهمية (بالمقارنة مع الننتول العارية) وذلك بسبب انخفاض قيم P (E). هذه الخاصية الجوهرية للطبقات الجرافين هو أمر حاسم لمنع أي انتقال الشحنة من الفيبرينوجين (والدم تخثر اللاحقة).

استخدمنا رامان الطيفي الدقيقة للتأكد من أن ديناميات انتقال الشحنة بين الفيزيولوجية وغرام نيتي غير ذات أهمية، في الواقع. يسلك الطيف رامان من الجرافين ميزات حادة بسبب عدة تأثيرات الرنين. ومن الجدير بالذكر أن الفرقة عرضية (G-الفرقة) ينشأ من الاهتزاز مستو من ذرات الكربون وعثر في وقت سابق أن تكون حساسة للغاية لتوجيه الاتهام النقل. هو معروف (25) تردد G-الفرقة لتغيير التروس (بالاستعداد) عند أي متقبل (المانحة) الأنواع يتفاعل مع الجرافين عبر نقل (الإلكترون) حفرة. الأهم من ذلك أن lineshape من ديف الفرقة G-iates من Lorentzian متماثل إلى lineshape غير المتماثلة (BWF) Breit-فيغنر-فانو بسبب تهمة نقل 25 وكما كان متوقعا، لم نكن نلاحظ تحولا في وتيرة G-عصابة من الجرافين على امتزاز الفيزيولوجية تؤكد عدم وجود نقل المسؤول بين GR-نيتي والفيبرينوجين (الشكل 6). تثبيط هذه التهمة ونقل منخفضة نسبة فيبوناتشي / ALB تشير hemocompatibility جيدة من الطلاء الجرافين.

همود الكيميائية للطلاء الجرافين: الجرافين هو معروف ليكون بمثابة طبقة حماية بسبب خصائصه الفيزيائية فريدة من نوعها. في شعرية العسل SP 2 على حاجز يمنع نشر الطبيعية والمعادن ولذلك الترشيح أيون من المواد الزرع. في الآونة الأخيرة، وقد استخدم الجرافين كما البالون ومحكم المجهرية 26 و طلاء واقية للنحاس / ني 27 على الرغم من أن هناك توثيق جيد للاستقرار ومناعة من الجرافين في لترature، نقدم بياناتنا المتعلقة النقش النحاس لعملة واحدة في الشكل 7 أن أكرر فائدة وجدوى الجرافين والطلاء الزرع. كما هو موضح في الشكل 7A، لا تزال محمية الجزء الجرافين المغلفة لعملة و(~ النحاس 95٪) من الأكسدة عند تعرضها للH 2 O 2 في حين أن المنطقة العارية لعملة وأصبح مشوه على اتصال مع O H 2 5٪ 2 (انظر وتضخيم صورة المجهر الضوئي في الشكل 7A).

لاختبار متانة الطلاء الجرافين، نتعرض GR-نيتي ركائز لحامض النيتريك 70٪ حتى محفورا جزئيا نيتي بعيدا. لدينا في الموقع رامان الطيفي من GR-نيتي منغمسين في HNO 3 لم تظهر أي تغيير في D-G-والفرقة من الجرافين مما يعني أن طلاء الجرافين هو دائم للغاية (7B الشكل). وعلاوة على ذلك، وجدنا أن طلاء الجرافين في نيتي GR-يقلل من معدل حفر من coppe الكامنةص كما هو مبين في الشكل 7C.

وفي الختام، أكد القياسات الطيفية لدينا مفصلة عدم وجود انتقال الشحنة بين الجرافين والفيزيولوجية مما يشير إلى أن طلاء الصفائح الدموية الجرافين يثبط تفعيل من يزرع. بالإضافة إلى ذلك، والطلاء الجرافين لا يحمل أي سمية كبيرة في المختبر لبطانة الأوعية الدموية على نحو سلس وخطوط الخلايا العضلية يؤكد توافق مع الحياة الخاصة بهم. علاوة على ذلك، تم العثور على الطلاء الجرافين أن تكون خاملة كيميائيا ودائم وغير منفذة في تدفق الدم البيئة. الحيوي وhemocompatibility من الطلاء الجرافين مع همود الكيميائية، وقوة التحمل والكتامة جعل الجرافين مادة فريدة من نوعها لزراعة طلاء الطبية الحيوية. وأخيرا، نلاحظ أن نجحنا في نقل صحائف الجرافين على ألياف نيتي الفردية، وذلك باستخدام والتي يمكن تصنيعها شبكة الجرافين المغلفة. وقد وضعنا أيضا صحائف الجرافين تقشر كيميائيا التي يمكن تدور المغلفة مباشرة ONTيا الدعامات معشقة مثل الشبكة. وبالإضافة إلى ذلك، تجاربنا الأولية تظهر أنه من الممكن بالفعل أن تنمو مباشرة على الجرافين سبائك نيتي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
Dulbecco's Modified Eagle Medium ATCC 30-2002
Thiazolyl blue tetrazolium bromide Sigma-Aldrich M2128
CellTiter 96 Aqueous One solution cell proliferation assay (MTS) Promega G3582
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
36.5% formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Alexafluor 488 phalloidin Life Technologies A12379
VECTASHIELD mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Human serum albumin Sigma-Aldrich A9511
Human fibrinogen
Tris/Glycine/SDS Bio-Rad 161-0732
Ready Gel Tris-HCl Gel Bio-Rad 161-1158
Acetic acid Sigma-Aldrich 45726
SYPRO Red Life Technologies S-6653
Protein low BCA assay Lamda Biotech G1003
Precision Plus Protein Kaleidoscope Standard Bio-Rad 161-0375
Immun-Blot PVDF membrane Bio-Rad 162-0177
Blotting grade blocker non-fat dry milk Bio-Rad 170-6404XTU
Anti-actin antibody produced in rabbit Sigma-Aldrich A2066
BM Chemiluminescence Western Blotting kit (mouse/rabbit) Roche Applied Science 11520709001
RIPA buffer Sigma-Aldrich R0278
NiTi (51% Ni, 49% Ti) Alfa-Aesar 44953
Equipment
Horiba JobinYvon Raman spectrometer Dilor XY 98
Nikon Confocal microscope Eclipse TI microscope
Thermoscientific Plate reader
Bio-Rad Power supply 164-5050 PowerPac basic power supply
Bio-Rad Electrophoresis cell 165-8004 Mini-PROTEAN tetra cell
Bio-Rad Gel holder cassette 170-3931 Mini gel holder cassette

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roy, R. K., Lee, K. -R. Biomedical applications of diamond-like carbon coatings: A review. Journal of Biomedical Materials Research Part B-Applied Biomaterials. 83 B (1), 72-84 (2007).
  2. Shah, A. K., Sinha, R. K., Hickok, N. J., Tuan, R. S. High-resolution morphometric analysis of human osteoblastic cell adhesion on clinically relevant orthopedic alloys. Bone. 24 (5), 499-506 (1999).
  3. Huang, N., Yang, P., Leng, Y. X., Chen, J. Y., Sun, H., Wang, J., Wang, G. J., Ding, P. D., Xi, T. F., Leng, Y. Hemocompatibility of titanium oxide films. Biomaterials. 24 (13), 2177-2187 (2003).
  4. Gutensohn, K., Beythien, C., Bau, J., Fenner, T., Grewe, P., Koester, R., Padmanaban, K., Kuehnl, P. In vitro analyses of diamond-like carbon coated stents: Reduction of metal ion release, platelet activation, and thrombogenicity. Thrombosis Research. 99 (6), 577-585 (2000).
  5. Gillespie, W. J., Frampton, C. M. A., Henderson, R. J., Ryan, P. M. The Incidence of Cancer Following Total Hip-Replacement. Journal of Bone and Joint Surgery-British Volume. 70 (4), 539-542 (1988).
  6. Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups. Biomaterials. 26 (33), 6547-6557 (2005).
  7. Mikhalovska, L. I., Santin, M., Denyer, S. P., Lloyd, A. W., Teer, D. G., Field, S., Mikhalovsky, S. Fibrinogen adsorption and platelet adhesion to metal and carbon coatings. Thrombosis and Haemostasis. 92 (5), 1032-1039 (2004).
  8. Airoldi, F., Colombo, A., Tavano, D., Stankovic, G., Klugmann, S., Paolillo, V., Bonizzoni, E., Briguori, C., Carlino, M., Montorfano, M., Liistro, F., Castelli, A., Ferrari, A., Sgura, F., Mario, C. D. i Comparison of diamond-like carbon-coated stents versus uncoated stainless steel stents in coronary artery disease. American Journal of Cardiology. 93 (4), 474-477 (2004).
  9. Allen, M., Myer, B., Rushton, N. In vitro and in vivo investigations into the biocompatibility of diamond-like carbon (DLC) coatings for orthopedic applications. Journal of Biomedical Materials Research. 58 (3), 319-328 (2001).
  10. Butter, R., Allen, M., Chandra, L., Lettington, A. H., Rushton, N. In-vitro Studies of DLC Coatings with Silicon Intermediate Layer. Diamond and Related Materials. 4 (5-6), 857-861 (1995).
  11. Dearnaley, G., Arps, J. H. Biomedical applications of diamond-like carbon (DLC) coatings: A review. Surface & Coatings Technology. 200 (7), 2518-2524 (2005).
  12. Dorner-Reisel, A., Schurer, C., Nischan, C., Seidel, O., Muller, E. Diamond-like carbon: alteration of the biological acceptance due to Ca-O incorporation. Thin Solid Films. 420, 263-268 (2002).
  13. Dowling, D. P., Kola, P. V., Donnelly, K., Kelly, T. C., Brumitt, K., Lloyd, L., Eloy, R., Therin, M., Weill, N. Evaluation of diamond-like carbon-coated orthopaedic implants. Diamond and Related Materials. 6 (2-4), 390-393 (1997).
  14. Grill, A. Diamond-like carbon coatings as biocompatible materials - an overview. Diamond and Related Materials. 12 (2), 166-170 (2003).
  15. Hauert, R. A review of modified DLC coatings for biological applications. Diamond and Related Materials. 12 (3-7), 583-589 (2003).
  16. Windecker, S., Mayer, I., De Pasquale, G., Maier, W., Dirsch, O., De Groot, P., Wu, Y. P., Noll, G., Leskosek, B., Meier, B., Hess, O. M. Working Grp Novel Surface, C., Stent coating with titanium-nitride-oxide for reduction of neointimal hyperplasia. Circulation. 104 (8), 928-933 (2001).
  17. Zhang, F., Zheng, Z. H., Chen, Y., Liu, X. G., Chen, A. Q., Jiang, Z. B. In vivo investigation of blood compatibility of titanium oxide films. Journal of Biomedical Materials Research. 42 (1), 128-133 (1998).
  18. Bolz, A., Schaldach, M. Artificial-Heart Valves - Improved Blood Compatibility By PECVD a-SiC-H COATING. Artificial Organs. 14 (4), 260-269 (1990).
  19. Haude, M., Konorza, T. F. M., Kalnins, U., Erglis, A., Saunamaki, K., Glogar, H. D., Grube, E., Gil, R., Serra, A., Richardt, H. G., Sick, P., Erbel, R., Invest, C. T. Heparin-coated stent placement for the treatment of stenoses in small coronary arteries of symptomatic patients. Circulation. 107 (9), 1265-1270 (2003).
  20. Suggs, L. J., Shive, M. S., Garcia, C. A., Anderson, J. M., Mikos, A. G. In vitro cytotoxicity and in vivo biocompatibility of poly(propylene fumarate-co-ethylene glycol) hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research. 46 (1), 22-32 (1999).
  21. Clarotti, G., Schue, F., Sledz, J., Benaoumar, A. A., Geckeler, K. E., Orsetti, A., Paleirac, G. Modification of the biocompatible and haemocompatible properties of polymer substrates by plasma-deposited fluorocarbon coatings. Biomaterials. 13 (12), 832-840 (1992).
  22. Gombotz, W. R., Guanghui, W., Horbett, T. A., Hoffman, A. S. Protein adsorption to poly(ethylene oxide) surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 25 (12), 1547-1562 (1991).
  23. Ishihara, K., Fukumoto, K., Iwasaki, Y., Nakabayashi, N. Modification of polysulfone with phospholipid polymer for improvement of the blood compatibility. Part 2. Protein adsorption and platelet adhesion. Biomaterials. 20 (17), 1553-1559 (1999).
  24. Jung, N., Kim, B., Crowther, A. C., Kim, N., Nuckolls, C., Brus, L. Optical Reflectivity and Raman Scattering in Few-Layer-Thick Graphene Highly Doped by K and Rb. ACS Nano. 5 (7), 5708-5716 (2011).
  25. Rao, A. M., Eklund, P. C., Bandow, S., Thess, A., Smalley, R. E. Evidence for charge transfer in doped carbon nanotube bundles from Raman scattering. Nature. 388 (6639), 257-259 (1997).
  26. Bunch, J. S., Verbridge, S. S., Alden, J. S., vander Zande, A. M., Parpia, J. M., Craighead, H. G., McEuen, P. L. Impermeable atomic membranes from graphene sheets. Nano Letters. 8 (8), 2458-2462 (2008).
  27. Chen, S., Brown, L., Levendorf, M., Cai, W., Ju, S. -Y., Edgeworth, J., Li, X., Magnuson, C. W., Velamakanni, A., Piner, R. D., Kang, J., Park, J., Ruoff, R. S. Oxidation Resistance of Graphene-Coated Cu and Cu/Ni Alloy. Acs Nano. 5 (2), 1321-1327 (2011).

Tags

الهندسة الطبية الحيوية، العدد 73، الهندسة الحيوية، الطب، الفيزياء الحيوية، علوم المواد، الفيزياء، علم الأدوية، علم السموم، جراحة، الكيمياء والمواد (عام)، الجرافين، يزرع الطبية الحيوية، وتعديل السطح، ترسيب الأبخرة الكيميائية، والتعبير البروتين، المجهري متحد البؤر، يزرع، الدعامات والسريرية
الجرافين عوازل للزراعة الحيوية الطبية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Podila, R., Moore, T., Alexis, F.,… More

Podila, R., Moore, T., Alexis, F., Rao, A. Graphene Coatings for Biomedical Implants. J. Vis. Exp. (73), e50276, doi:10.3791/50276 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter