Summary
Grafeen biedt potentieel als bekledingsmateriaal voor biomedische implantaten. In deze studie tonen we een werkwijze voor het bekleden nitinol-legeringen met nanometer dikke lagen grafeen en bepalen hoe grafeen kan implantaat respons beïnvloeden.
Abstract
Atomair glad grafeen als oppervlaktelaag heeft potentieel om implantaat eigenschappen te verbeteren. Hieruit blijkt een werkwijze voor het bekleden nitinol-legeringen met nanometer dikke lagen grafeen voor toepassingen als een stent materiaal. Grafeen werd gekweekt op koper substraten via chemical vapor deposition en vervolgens overgebracht naar nitinol substraten. Om te begrijpen hoe de grafeen coating kan de biologische respons te veranderen, werd levensvatbaarheid van de cellen van de rat aorta endotheelcellen en de rat aorta gladde spiercellen onderzocht. Bovendien werd het effect van grafeen-coatings op celhechting en morfologie onderzocht met fluorescentie confocale microscopie. Cellen werden gekleurd voor actine en kernen, en er waren aanzienlijke verschillen tussen pristine nitinol monsters vergeleken met grafeen beklede monsters. Totale actine expressie van rat aorta gladde spiercellen gevonden met Western blot. Eiwitadsorptie kenmerken en een indicator voor potentiële trombogeniciteit, were bepaald voor serum albumine en fibrinogeen met gel elektroforese. Bovendien werd de overdracht van lading van fibrinogeen tot substraat afgeleid met Raman spectroscopie. Het bleek dat grafeen coating op substraten nitinol de functionele eisen voor een stentmateriaal voldaan en verbeterd de biologische respons in vergelijking met onbeklede nitinol. Aldus grafeen bekleed nitinol een geschikte kandidaat voor een stentmateriaal.
Introduction
De afgelopen drie decennia zijn getuige geweest van de ontdekking van nieuwe materialen gebaseerde therapieën en apparaten voor de ziekte van behandelingen en diagnostiek. Nieuwe legering materialen zoals nitinol (NiTi) en roestvrij staal worden vaak gebruikt in biomedisch implantaat productie vanwege hun superieure mechanische eigenschappen. Een-drie echter tal van uitdagingen als gevolg van exogene materiaal cytotoxiciteit, bio-en hemo-compatibiliteit. De metallische aard van deze legeringen resulteert in slechte bio-en hemocompatibiliteit door metaaluitloging, gebrek aan celadhesie, proliferatie en trombose als het in contact met stromend bloed (zoals catheters, bloedvat enten, vasculaire stents, kunstmatige hartkleppen etc.). 1, 4, 5 De interactie van eiwitten of levende cellen met het implantaatoppervlak kan leiden tot een sterke immunologische reactie en de daaropvolgende cascade van biochemische reacties kan een negatieve invloed werking van het apparaat. Daarom wordt pertinENT om de controle over de interactie tussen biomedische implantaten en de omliggende biologische milieu te bereiken. Modificatie is vaak gebruikt om verminderen of voorkomen nadelige fysiologische respons afkomstig van het implantaatmateriaal. Een ideale coating zal hoge adhesiesterkte, chemische inertie, hoge gladheid en goede hemo-en biocompatibiliteit bezitten. Eerder hebben verschillende materialen zoals diamantachtige koolstof (DLC), SiC, TiN, TiO 2 en vele polymeren getest als biocompatibele implantaat oppervlakken. 1, 6-23 Deze materialen nog steeds niet om aan al de functionele criteria voor een geschikte implantaatoppervlak coating.
De ontdekking van atoom dikke laag sp 2 carbon, bekend als grafeen heeft deuren geopend voor de ontwikkeling van nieuwe multifunctionele materialen. Grafeen verwachting een ideale kandidaat voor implantaatoppervlak coating zijn omdatis chemisch inert, atomair glad en zeer duurzaam. In deze brief, onderzoeken we de haalbaarheid van grafeen als oppervlaktelaag voor biomedische implantaten. Onze studies tonen aan dat het grafeen gecoate nitinol (Gr-NiTi) alle functionele criteria voldoet, en bovendien ondersteunt een uitstekende gladde spiercellen en endotheelcellen en leidt tot een betere celproliferatie. We vinden ook dat de serum albumine adsorptie aan Gr-NiTi is hoger dan fibrinogeen. Belangrijker (i) onze gedetailleerde spectroscopische metingen bevestigden het ontbreken van ladingsoverdracht tussen grafeen en fibrinogeen suggereert dat grafeen coating remt bloedplaatjesactivering door implantaten, (ii) grafeen coatings geen significante vertonen in vitro toxiciteit voor endotheliale en gladde spier cellijnen bevestigen hun biocompatibiliteit, en (iii) grafeen coatings zijn chemisch inert, duurzame en ondoordringbare in stromend bloed omgeving. Deze hemo-en biocompatibel eigenschappen, samen met een hoge strength, chemische inertie en duurzaamheid, maken grafeen coatings als een ideale coating.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Grafeen-coating van NiTi
- De grafeen monsters die in deze studie werden gekweekt op koper (Cu) substraten met de chemische dampafzetting techniek, en vervolgens overgebracht naar 4,5 mm 2 NiTi substraten.
- Cu folie (1 cm x 1 cm) werden in een 1 inch kwartsbuis oven en verwarmd tot 1000 ° C in aanwezigheid van 50 sccm van H2 en 450 sccm Ar.
- Vervolgens methaan (1 en 4 sccm) werd in de oven bij verschillende debieten gedurende 20-30 min. De monsters werden uiteindelijk afgekoeld tot kamertemperatuur onder stromende H2, Ar en CH4.
- Vervolgens werden de Cu folies roterend bedekken met PMMA (verdund met 4% anisool) bij 4.000 tpm, gevolgd door een warmtebehandeling gedurende 5 min bij 150 ° C. Grafeen verbonden met PMMA laag werd verkregen door het etsen van de Cu folie met Transene Inc, CE-100 etsmiddel en naspoelen in 10% HCl en gedeïoniseerd water gedurende 10 minuten.
- De samples werden overgebracht naar NiTi substraten (4,5 mm 2) en uitgegloeid bij 450 ° C in Ar (300 sccm) en H2 (700 sccm) gedurende 2 uur om de PMMA verwijderen. Tenslotte werden de substraten gewassen met aceton om het resterende PMMA te ontbinden Gr-NiTi monster. Een Dilor XY triple grating monochromator werd gebruikt voor de micro-Raman karakterisatie (met 100X doelstelling) van Gr-NiTisamples de 514,5 nm excitatie van een Ar + ion laser.
2. In vitro toxiciteit van Gr-NiTi
Rat aorta endotheelcellen (Cell toepassing Inc) werden gekweekt op met gelatine beklede 8 kamers dia. Voor het testen van de celgroei, ongerepte en Gr-NiTisubstrates werden in putjes zonder gelatine coating. Scanning electronen microscopie beelden werden verkregen met een Hitachi S-4800 SEM. Bovendien werden ratten aorta gladde spiercellen ook gekweekt in CellBind platen met 96 putjes als controle groep (Corning) in Dulbecco's Modified Eagle Medium (ATCC).
- Voor het testen cellevensvatbaarheid werden cellen (zowel endotheliale en gladde spiercellen) geënt op 10 5 cellen / putje in putjes met ongerepte NiTi, 1 sccm of 4 sccm Gr-NiTi substraten, waarbij de genoemde sccm overeenkomt met de stroom methaan in de CVD groei van grafeen. Cellen werden gedurende de gewenste periode in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2, uitwisselen media om de andere dag.
- Eind tijdstip werden media verwijderd en vers medium dat 0,5 mg / ml thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT of verkregen van Sigma) werd aan elk putje toegevoegd. Cellen werden daarna gedurende nog 3 uur. Voor de MTS assay werden media verwijderd in de laatste tijdstip en vervangen door 120 pl van MTS werkoplossing (Cell Tier 96 waterige, Promega) en geïncubeerd gedurende 3 uur.
- Vervolgens werd voorzichtig media verwijderd en 100 ml dimethylsulfoxide (Sigma) toegevoegd aan elk putje. Na allovleugel 10 min voor de MTT kristallen op te lossen, werd de oplossing overgebracht naar een andere putjes. Voor de MTS assay werd geen dimethylsulfoxide toegevoegd aan de wells. Nou inhoud werd verplaatst naar een nieuwe plaat.
- De absorptie werd afgelezen bij 490 nm en het percentage levensvatbaarheid werd bepaald door het normaliseren van de gemiddelde absorptie absorptie van de ongerepte NiTi monster. Ten minste vijf herhalingen werden uitgevoerd voor elk monster type.
3. Confocale microscopie studies van Celmorfologie
- Voor confocale beeldvorming van rat aorta gladde spiercellen werden substraten geplaatst in een 8-kamer slide (Thermo Scientific). De cellen werden gezaaid aan 25.000 cellen / kamer en gedurende 3 dagen bij 37 ° C en 5% CO2.
- Cellen werden gefixeerd op het substraat met 4% formaldehyde in met fosfaat gebufferde zoutoplossing gedurende 20 minuten.
- Gepermeabiliseerd met 0,1% Triton-X 1 minuut.
- Actine werd gekleurd met Alexa Fluor 488 phalloidin (Life Technologies). 100 pl alexafluor 488 phalloidin bij 200 eenheden / ml in methanol werd toegevoegd aan 1,9 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing. Cellen werden gekleurd met 250 ui alexafluor 488 phalloidin gedurende 45 minuten en vervolgens tweemaal gewassen met fosfaat gebufferde zoutoplossing.
- Kernen werden gemonteerd met Vectashield fluorescent fixeermiddel met DAPI (Vector Laboratories). Confocale beelden werden verzameld met behulp van een Nikon Confocale TI. Een kamer geënt met cellen zonder substraat werd gebruikt als controle.
4. Eiwitadsorptiestudies
- Substraatafmetingen werden gemeten met calipers voordat de eiwitadsorptie experimenten. Drie metingen werden voor elke zijde van het vierkant ongeveer monsters en gemiddeld om de lengte en breedte krijgen.
- Elk monster pristine NiTi, 1sccm en 4sccm Gr-NiTiwere geïncubeerd met 1 mg / ml albumine in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of 1 mg / ml fibrinogeen in PBS bij kamertemperatuur temperatuur gedurende 3 uur.
- Gelijk monsters werden in een microcentrifuge buis met 200 ui verminderen monsterbuffer en gekookt gedurende 5 minuten.
- Werden verdund in een Tris / Glycine / SDS buffer (Bio-Rad) en geleid door een 4-15% Tris polyacrylamide gel elektroforese (Bio-Rad) bij 90 V gedurende 100 min.
- Gels werden gekleurd met Red SYPRO. Verdun SYPRO Red (Life Technologies) stock oplossing 1:5000 in 7,5 v / v% azijnzuur. Vlek gels gedurende 60 minuten.
- Afbeelding gels met behulp van een Flourchem SP (Alpha Innotech). Fluorescentie-intensiteit werd gekwantificeerd met behulp ImageJ software. Fluorescentie-intensiteit van elk monster werd genormaliseerd door het totale oppervlak van substraat en fibrinogeen adsorptie werd vergeleken met albumine adsorptie.
5. Western blotting voor eiwitexpressie
- Western blot werd uitgevoerd voor totaal actine analyseren rat aorta gladde spiercellen. Cellen werden uitgezet met 10.000 cellen / substraat in een 96-well plaat.
- Cellen werden gedurende drie dagen voor het verwijderen van media. Totaal eiwit werd geëxtraheerd met RIPA buffer en een standaard BCA assay (Lamda) werd uitgevoerd op totaal eiwit kwantificeren.
- Monsters werden verdund tot dezelfde concentratie in RIPA en vervolgens gekookt in een reducerende monsterbuffer gedurende 5 minuten.
- Eiwitten werden gescheiden door een 4-15% Tris polyacrylamide gel via elektroforese bij 90 V gedurende 100 min. Een caleidoscoop eiwitstandaard (Bio-Rad) werd gebruikt om eiwitten molecuulgewicht beoordelen.
- Eiwitten werden overgebracht naar een PVDF membraan en geblokkeerd met 1% niet-vette droge melk (Bio-Rad) oplossing.
- Totaal actine werd gelabeld met een konijn anti-rat actine antilichaam (Sigma). Een BM chemiluminescentie kit (Roche) werd gebruikt om de primaire antilichamen te detecteren. Membranen werden afgebeeld met behulp van FlourChem SP imaging apparatuur en fluorescentie-intensiteit werd gemeten met behulp van ImageJ software. Fluorescentie-intensiteit werd genormaliseerd door te vergelijken met de priStine NiTisample.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
. Figuur 1 a) CVD gekweekt polykristallijn grafeen op Cu folies bootst de metalen kristalkorrels (schaalmaat: 10 pm). b) Raman spectrum van 1 sccm (4 sccm) grafeen toont intense (relatief zwakkere) G 'band aangeeft monolaag (enkele laag) aard van de bereide grafeen. c) AFM afbeelding van grafeen overgebracht naar NiTi toont een ruwheid van ~ 5 nm. Scale bar = 500 nm.
Figuur 2 Confocale microscopie beelden voor SMCs gekweekt op a) controle glasplaatje, b) pristine NiTi, c) 1 sccm Gr-NiTi en d) 4 sccm Gr-NiTi substraten (schaalmaat:. 50 pm).
Figuur 3. A) MTT assay toont dat Gr-NiTi substraten (1 en 4 sccm) vertonen geen significant verschil in SMC cellevensvatbaarheid ten opzichte pristine NiTi. B) MTS assay toont aan dat de 3 dagen cellevensvatbaarheid voor RAECs niet significant anders dan controles.
Figuur 4. Scanning electronen microscopie beelden voor RAECs gegroeid) ongerepte NiTi, b) 1 sccm Gr-NiTi en c) 4 sccm Gr-NiTi substraten blijkt dat grafeen coatings leiden tot een betere sferische celmorfologie van RAECs. Schaalbalk = 10 um.
Figuur 5. A) fibrinogeen / Albumine ratio voor ongerepte NiTi, Gr-NiTi (1 en 4 sccm monsters). B) Energie-niveau diagram voor fibrinogeen en elektronische toestandsdichtheid voor grafeen met het evenwicht van het Fermi-niveau. Een elektron transfer van fibrinogeen naar Gr-NiTi is alleen mogelijk vanaf de bezette elektronische toestanden van het fibrinogeen molecuul in lege elektronische toestanden van Gr-NiTi op hetzelfde energieniveau. Zowel single-en een paar lagen grafeen zijn semi-metalen bij kamertemperatuur met een lage dichtheid van staten op EF, wat resulteert in een zwakke (in vergelijking met kale nitinol) ladingsoverdracht van fibrinogeen in grafeen.
Figuur 6. Graphene vertoont geen veranderingen in de G-band lineshape of frequentie aangeeft afwezigheid van ladingsoverdracht van de plasma-eiwitten. De deconvoluted verkregen pieken van curve fitting worden weergegeven in zwart.
Figuur 7. A) Graphene beklede deel van een Cu cent blootgesteld aan 5% H 2 O 2 blijft ongewijzigd, terwijl het onbedekte deel is verkleurd. B) Geen verandering in de G-band werd waargenomen in onze in situ Raman studies van Gr- NiTi ondergedompeld in 70% HNO 3 bevestiging van de duurzaamheid van grafeen coatings. c) De etsen tijd voor Cu in CE 100 oplosmiddel wordt verdubbeld als Cu is bekleed met grafeen (zoals in Gr-NiTi) met vermelding van de ondoordringbaarheid van grafeen membranen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biocompatibiliteit en cytotoxiciteit: De chemical vapor deposition (CVD) methode leverde polykristallijn grafeen monsters Cu kristalkorrels, zie figuur 1a nagebootst. We gebruikten Raman spectroscopie de aanwezigheid van monolayer (enkele laag) grafeen bevestigen op 1 sccm (4 sccm) monsters (zie figuur 1b). Het is duidelijk, 1 sccm (4 sccm) monsters vertonen intense (relatief zwakkere) G 'band wijzen op monolaag (enkele laag) grafeen. Figuur 1c toont een atomic force microscopie (AFM) beeld van enkele laag grafeen op NiTi substraten. De gedetailleerde metingen een waarde opleveren van oppervlakteruwheid R q = 5 nm voor overgedragen grafeen lagen (Gr-NiTi). Het is bekend dat de nanogestructureerde oppervlak topografie sterk celvorm en cytoskelet montage endotheelcellen en gladde spiercellen beïnvloedt. Deze cellijnen reageren op de mechanische belasting door hun lipide-bilaagvloeibaarheid, hetgeen nadelig kan zijn eiwit translocatie en de toetreding van activatoren zoals calcium in de cellen. Vooral kan een toename van het celmembraan spanningsgradiënt veranderen conformatie en dichtheid van celoppervlakreceptoren. Om de invloed van grafeen coating op spanningsgradiënten van cellen te testen, hebben we de gladde spier-en endotheelcellen morfologie met microscopische technieken.
Zoals getoond in figuur 2, gladde spiercellen (SMC) morfologie pristine NiTi niet-bolvormig. Verder worden de cellen dun verspreid waarin zwakke adhesie van SMCs tot de oorspronkelijke NiTi. Integendeel, SMC dicht en de sferische Gr-NiTi (zowel 1 en 4 sccm) oppervlakken vergelijkbaar met de controle. Grafeen coating vermindert spanningsgradiënten in de cellen door gladdere oppervlakken (blijkt uit lage R q waarden getoond in figuur 1c) en dus resulteert in een betere celmorfologie.Om de cel levensvatbaarheid en proliferatie te meten, voerden we MTT assay op de SMC gegroeid op pristine en Gr-NiTisubstrates op 3 en 7 dagen tijdstippen. In deze bepaling wordt de kleurstof MTT (geel) gereduceerd tot formazan kleurstof (paars) door het actieve reductase enzymen en derhalve de gezonde en prolifererende cellen (of materiaal cytotoxiciteit) kan worden gekwantificeerd door de colorimetrische metingen. Zoals weergegeven in figuur 3a, hebben we geen significante veranderingen in de toxiciteit voor Gr-NiTi substraten na 3 en 7 dagen. Deze resultaten bevestigen dat het grafeen coatings niet teveel toxiciteit te veroorzaken, in vergelijking met de ongerepte NiTi substraten zelf.
Om de effecten van grafeen coating bevestigen, we gedetailleerde elektronenmicroscopie imaging experimenten uitgevoerd rat-aorta endotheelcellen (zie figuur 4). De cellen op de ongerepte NiTi substraten zijn schaars en langwerpig terwijl ze ellipsvormig en dense op de Gr-NiTi substraten. Dergelijke verbeterde celmorfologie en dichtheid bleek verwant aan SMCs bevestiging van de vermindering spanningsgradiënten door de grafeen coating. Verder maten we grafeen coating cytotoxiciteit op RAEC met MTS 3 - (4,5-dimethyl-2-yl) -5 - (3-carboxymethoxyphenyl) -2 - (4-sulfofenyl)-2H-tetrazolium assay. De rationale voor het gebruik van MTS assay (in plaats van MTT) ligt in de betere compatibiliteit met de RAEC groeimedia en voorwaarden. Zoals getoond in figuur 3b onze MTS assay op endotheelcellen vertoonde goede celoverleving en proliferatie bevestiging geen overmatige toxiciteit van de grafeen coatings zelfs RAEC. Belangrijker zowel 1 en 4 sccm Gr-NiTi geen significante veranderingen in celproliferatie suggereert geen afhankelijkheid van de cel morfologie vertoonden op aantal lagen grafeen.
Eiwitadsorptie en hemocompatibiliteit: Bloedstolling in de nabijheid van het implantaatmateriaal has is een van de belangrijkste hindernissen in het implantaat technologie sinds 2003. Zoals eerder vermeld, het implantaatmateriaal coagulatiecascade activeert wanneer het in contact met bloed. De interactie tussen biomedische implantaat en bloed begint met de adsorptie van plasma-eiwitten (serum albumine, fibrinogeen, etc.) Op het oppervlak. Aanvankelijk zijn zeer overvloedige eiwitten zoals serumalbumine, flbrinogen en flbronectin geadsorbeerd maar later vervangen door factoren XII en hoog molecuulgewicht kininogen. De verhouding van geadsorbeerde flbrinogen en albumine is cruciaal voor de bepaling van hemocompatibiliteit van het biomateriaal. Voorheen een lage verhouding van fibrinogeen / albumine geadsorbeerd op een biomedisch implantaatoppervlak is gecorreleerd met lage adhesie van bloedplaatjes en thrombusvorming. 1 Zoals getoond in Figuur 5a, Gr-NiTi vertonen laag fibrinogeen / albumine verhouding ten opzichte van pristine NiTi suggereren beter hemocompatibiliteit die van grafeen. De fib / alb ratio was significant lager voor zowel de 1 en 4 sccm Gr-NiTi aangeeft dat de hemocompatibiliteit van grafeen is laag onafhankelijk.
Het is bekend dat de elektronenoverdracht van fibrinogeen molecule op het implantaat is verantwoordelijk voor de vorming van fibrine als eerste stap in trombose groei. Zoals getoond in figuur 5b, fibrinogeen vertoont halfgeleiders zoals dichtheid van elektronische toestanden of DOS (aangeduid met p (E)) met een bandafstand van 1,8 eV. De Fermi niveaus (EF) van fibrinogeen en Gr-NiTi evenwicht op hun interface. Een ladingsoverdracht van een elektron per fibrinogeen is nodig voor de vorming van fibrine op ongerepte NiTi en elektronenoverdracht van het fibrinogeen molecuul in Gr-NiTi alleen vanaf de bezette elektronische toestanden van het fibrinogeen molecuul in lege elektronische toestanden van Gr-NiTi op hetzelfde energieniveau. Zowel individueel als enkele laag grafeen zijn semi-metalen bij kamertemperatuur met een lage p (E) E F 24. Aldus is de ladingsuitwisseling stroom van fibrinogeen grafeen onbeduidend (vergeleken met kale nitinol) als gevolg van lage waarden van p (E). Deze intrinsieke eigenschap van grafeen coatings is van cruciaal belang voor het remmen van alle kosten transfer van fibrinogeen (en latere bloedstolling).
We gebruikten micro-Raman spectroscopie te bevestigen dat de ladingsoverdracht dynamiek tussen fibrinogeen en Gr-NiTi inderdaad significant. De Raman spectrum van grafeen vertoont een aantal scherpe gelaatstrekken als gevolg van resonantie-effecten. Met name de tangentiële band (G-band) voortvloeit uit de vlakke trillingen uit koolstofatomen en is eerder gevonden dat zeer gevoelig voor overdracht laden. 25 De G-band frequentie bekend is opschakelen (afschakelen) wanneer een acceptor (donor) species interageert met grafeen via gat (elektron) overdracht. Belangrijk is dat de lineshape van de G-band deviates van een symmetrische Lorentz een asymmetrische Breit-Wigner-Fano (BWF) lineshape als gevolg van de overdracht op te laden. 25 Zoals verwacht, hebben we niet zien een verschuiving in de G-band frequentie van grafeen bij adsorptie van fibrinogeen bevestiging van de afwezigheid van ladingsoverdracht tussen Gr-NiTi en fibrinogeen (figuur 6). Dergelijke remming van ladingsoverdracht en lage fib / alb verhouding geven goede hemocompatibiliteit van grafeen coatings.
Chemische inertie van grafeen Coatings: Graphene is bekend als een beschermlaag door zijn unieke chemische eigenschappen. De SP 2 honingraat rooster zorgt voor een natuurlijke diffusie barrière en voorkomt daardoor metaalion uitloging van het implantaat materiaal. Onlangs is grafeen gebruikt als microscopisch luchtdichte ballon 26 en beschermlaag voor Cu / Ni. 27 Hoewel de stabiliteit en dichtheid van grafeen zijn goed gedocumenteerd in de literatuurtuur, presenteren wij onze gegevens met betrekking tot het etsen van een Cu munt in figuur 7 aan het nut en de levensvatbaarheid van grafeen als implantaat coatings herhalen. Zoals getoond in Figuur 7a, blijft het grafeen beklede gedeelte van de munt (~ 95% Cu) beschermd tegen oxidatie onder invloed van H 2 O 2 terwijl de kale gebied van de munt werden verkleurd bij contact met 5% H 2 O 2 (zie de vergrote optische microscoop beeld in figuur 7a).
De duurzaamheid van coatings grafeen testen we blootgesteld Gr-NiTi substraten tot 70% salpeterzuur tot de NiTi werd gedeeltelijk weggeëtst. De in situ Raman spectroscopie van Gr-NiTi ondergedompeld in HNO 3 toonde geen verandering in de D-en G-band grafeen impliceert dat de grafeen coating is zeer duurzaam (figuur 7b). Bovendien vonden we dat het grafeen coating in Gr-NiTi de etssnelheid van de onderliggende Coppe vermindertr zoals weergegeven in figuur 7c.
Tot slot, onze gedetailleerde spectroscopische metingen bevestigde het gebrek aan ladingsoverdracht tussen grafeen en fibrinogeen suggereren dat grafeen coating bloedplaatjesactivering door implantaten remt. Bovendien kan grafeen coatings vertonen geen significante in vitro toxiciteit voor endotheliale en gladde spier cellijnen bevestigen hun biocompatibiliteit. Verder werden grafeen coatings gevonden chemisch inert, duurzaam en ondoordringbaar zijn in stromend bloed omgeving. De bio-en hemocompatibiliteit van grafeen coatings samen met zijn chemische inertie, de duurzaamheid en waterdichtheid maken grafeen een uniek materiaal voor het coaten van biomedische implantaten. Tot slot merken we op dat we er in geslaagd grafeen vellen op individuele NiTi vezels, met behulp waarvan de grafeen-gecoate gaas kan worden vervaardigd. We hebben ook chemisch geëxpandeerd grafeen vellen die direct kunnen worden draaien gecoat onto de mesh-achtige stents. Bovendien, onze eerste experimenten tonen aan dat het inderdaad mogelijk is om grafeen te groeien direct op NiTi legering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ATCC | 30-2002 | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | Sigma-Aldrich | M2128 | |
| CellTiter 96 Aqueous One solution cell proliferation assay (MTS) | Promega | G3582 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 36.5% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Alexafluor 488 phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Human serum albumin | Sigma-Aldrich | A9511 | |
| Human fibrinogen | |||
| Tris/Glycine/SDS | Bio-Rad | 161-0732 | |
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1158 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 45726 | |
| SYPRO Red | Life Technologies | S-6653 | |
| Protein low BCA assay | Lamda Biotech | G1003 | |
| Precision Plus Protein Kaleidoscope Standard | Bio-Rad | 161-0375 | |
| Immun-Blot PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | |
| Blotting grade blocker non-fat dry milk | Bio-Rad | 170-6404XTU | |
| Anti-actin antibody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | A2066 | |
| BM Chemiluminescence Western Blotting kit (mouse/rabbit) | Roche Applied Science | 11520709001 | |
| RIPA buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| NiTi (51% Ni, 49% Ti) | Alfa-Aesar | 44953 | |
| Equipment | |||
| Horiba JobinYvon | Raman spectrometer | Dilor XY 98 | |
| Nikon | Confocal microscope | Eclipse TI microscope | |
| Thermoscientific | Plate reader | ||
| Bio-Rad | Power supply | 164-5050 | PowerPac basic power supply |
| Bio-Rad | Electrophoresis cell | 165-8004 | Mini-PROTEAN tetra cell |
| Bio-Rad | Gel holder cassette | 170-3931 | Mini gel holder cassette |
References
- Roy, R. K., Lee, K. -R. Biomedical applications of diamond-like carbon coatings: A review. Journal of Biomedical Materials Research Part B-Applied Biomaterials. 83 B (1), 72-84 (2007).
- Shah, A. K., Sinha, R. K., Hickok, N. J., Tuan, R. S. High-resolution morphometric analysis of human osteoblastic cell adhesion on clinically relevant orthopedic alloys. Bone. 24 (5), 499-506 (1999).
- Huang, N., Yang, P., Leng, Y. X., Chen, J. Y., Sun, H., Wang, J., Wang, G. J., Ding, P. D., Xi, T. F., Leng, Y.
- Gutensohn, K., Beythien, C., Bau, J., Fenner, T., Grewe, P., Koester, R., Padmanaban, K., Kuehnl, P. In vitro analyses of diamond-like carbon coated stents: Reduction of metal ion release, platelet activation, and thrombogenicity. Thrombosis Research. 99 (6), 577-585 (2000).
- Gillespie, W. J., Frampton, C. M. A., Henderson, R. J., Ryan, P. M. The Incidence of Cancer Following Total Hip-Replacement. Journal of Bone and Joint Surgery-British Volume. 70 (4), 539-542 (1988).
- Sperling, C., Schweiss, R. B., Streller, U., Werner, C. In vitro hemocompatibility of self-assembled monolayers displaying various functional groups. Biomaterials. 26 (33), 6547-6557 (2005).
- Mikhalovska, L. I., Santin, M., Denyer, S. P., Lloyd, A. W., Teer, D. G., Field, S., Mikhalovsky, S. Fibrinogen adsorption and platelet adhesion to metal and carbon coatings. Thrombosis and Haemostasis. 92 (5), 1032-1039 (2004).
- Airoldi, F., Colombo, A., Tavano, D., Stankovic, G., Klugmann, S., Paolillo, V., Bonizzoni, E., Briguori, C., Carlino, M., Montorfano, M., Liistro, F., Castelli, A., Ferrari, A., Sgura, F., Mario, C. D. i Comparison of diamond-like carbon-coated stents versus uncoated stainless steel stents in coronary artery disease. American Journal of Cardiology. 93 (4), 474-477 (2004).
- Allen, M., Myer, B., Rushton, N. In vitro and in vivo investigations into the biocompatibility of diamond-like carbon (DLC) coatings for orthopedic applications. Journal of Biomedical Materials Research. 58 (3), 319-328 (2001).
- Butter, R., Allen, M., Chandra, L., Lettington, A. H., Rushton, N. In-vitro Studies of DLC Coatings with Silicon Intermediate Layer. Diamond and Related Materials. 4 (5-6), 857-861 (1995).
- Dearnaley, G., Arps, J. H. Biomedical applications of diamond-like carbon (DLC) coatings: A review. Surface & Coatings Technology. 200 (7), 2518-2524 (2005).
- Dorner-Reisel, A., Schurer, C., Nischan, C., Seidel, O., Muller, E. Diamond-like carbon: alteration of the biological acceptance due to Ca-O incorporation. Thin Solid Films. 420, 263-268 (2002).
- Dowling, D. P., Kola, P. V., Donnelly, K., Kelly, T. C., Brumitt, K., Lloyd, L., Eloy, R., Therin, M., Weill, N. Evaluation of diamond-like carbon-coated orthopaedic implants. Diamond and Related Materials. 6 (2-4), 390-393 (1997).
- Grill, A. Diamond-like carbon coatings as biocompatible materials - an overview. Diamond and Related Materials. 12 (2), 166-170 (2003).
- Hauert, R. A review of modified DLC coatings for biological applications. Diamond and Related Materials. 12 (3-7), 583-589 (2003).
- Windecker, S., Mayer, I., De Pasquale, G., Maier, W., Dirsch, O., De Groot, P., Wu, Y. P., Noll, G., Leskosek, B., Meier, B., Hess, O. M. Working Grp Novel Surface, C., Stent coating with titanium-nitride-oxide for reduction of neointimal hyperplasia. Circulation. 104 (8), 928-933 (2001).
- Zhang, F., Zheng, Z. H., Chen, Y., Liu, X. G., Chen, A. Q., Jiang, Z. B. In vivo investigation of blood compatibility of titanium oxide films. Journal of Biomedical Materials Research. 42 (1), 128-133 (1998).
- Bolz, A., Schaldach, M. Artificial-Heart Valves - Improved Blood Compatibility By PECVD a-SiC-H COATING. Artificial Organs. 14 (4), 260-269 (1990).
- Haude, M., Konorza, T. F. M., Kalnins, U., Erglis, A., Saunamaki, K., Glogar, H. D., Grube, E., Gil, R., Serra, A., Richardt, H. G., Sick, P., Erbel, R., Invest, C. T. Heparin-coated stent placement for the treatment of stenoses in small coronary arteries of symptomatic patients. Circulation. 107 (9), 1265-1270 (2003).
- Suggs, L. J., Shive, M. S., Garcia, C. A., Anderson, J. M., Mikos, A. G. In vitro cytotoxicity and in vivo biocompatibility of poly(propylene fumarate-co-ethylene glycol) hydrogels. Journal of Biomedical Materials Research. 46 (1), 22-32 (1999).
- Clarotti, G., Schue, F., Sledz, J., Benaoumar, A. A., Geckeler, K. E., Orsetti, A., Paleirac, G. Modification of the biocompatible and haemocompatible properties of polymer substrates by plasma-deposited fluorocarbon coatings. Biomaterials. 13 (12), 832-840 (1992).
- Gombotz, W. R., Guanghui, W., Horbett, T. A., Hoffman, A. S. Protein adsorption to poly(ethylene oxide) surfaces. Journal of Biomedical Materials Research. 25 (12), 1547-1562 (1991).
- Ishihara, K., Fukumoto, K., Iwasaki, Y., Nakabayashi, N. Modification of polysulfone with phospholipid polymer for improvement of the blood compatibility. Part 2. Protein adsorption and platelet adhesion. Biomaterials. 20 (17), 1553-1559 (1999).
- Jung, N., Kim, B., Crowther, A. C., Kim, N., Nuckolls, C., Brus, L. Optical Reflectivity and Raman Scattering in Few-Layer-Thick Graphene Highly Doped by K and Rb. ACS Nano. 5 (7), 5708-5716 (2011).
- Rao, A. M., Eklund, P. C., Bandow, S., Thess, A., Smalley, R. E. Evidence for charge transfer in doped carbon nanotube bundles from Raman scattering. Nature. 388 (6639), 257-259 (1997).
- Bunch, J. S., Verbridge, S. S., Alden, J. S., vander Zande, A. M., Parpia, J. M., Craighead, H. G., McEuen, P. L. Impermeable atomic membranes from graphene sheets. Nano Letters. 8 (8), 2458-2462 (2008).
- Chen, S., Brown, L., Levendorf, M., Cai, W., Ju, S. -Y., Edgeworth, J., Li, X., Magnuson, C. W., Velamakanni, A., Piner, R. D., Kang, J., Park, J., Ruoff, R. S. Oxidation Resistance of Graphene-Coated Cu and Cu/Ni Alloy. Acs Nano. 5 (2), 1321-1327 (2011).
