Summary
وتصف هذه الورقة طريقة striaghforward وكفاءة تنبيب الفئران لقياس وظائف الرئة أو تقطير الرئوي، التي تسمح للفئران لاسترداد ويكون درس في أوقات لاحقة. الإجراء ينطوي على مصدر الضوء غير مكلفة الالياف البصرية الذي ينير مباشرة القصبة الهوائية.
Abstract
ومن شأن إجراء بسيط لينبب الفئران لقياس وظائف الرئة لديها مزايا عديدة في دراسات طولية مع عدد محدود من الحيوانات أو باهظة الثمن. واحدة من الأسباب التي لم يتم ذلك بشكل روتيني أكثر هو أنه من الصعب نسبيا، على الرغم من كونه هناك العديد من الدراسات المنشورة التي تصف طرق لتحقيق ذلك. في هذه الورقة نبين إجراء من شأنه أن يزيل واحدة من العقبات الرئيسية المرتبطة بهذا التنبيب، وذلك من خلال القصبة الهوائية تصور طوال الوقت من التنبيب. النهج يستخدم 0.5 مم مصدر الضوء الالياف البصرية التي تعد بمثابة التعريف لتوجيه قنية التنبيب إلى القصبة الهوائية الماوس. ونحن تبين أنه من الممكن استخدام هذا الإجراء لقياس ميكانيكا الرئة في الفئران الفردية على دورة زمنية لا تقل عن عدة أسابيع. يمكن تعيين هذه التقنية مع حساب قليلة نسبيا والخبرة، ويمكن أن يتحقق بشكل روتيني مع قليل من التدريب نسبيا. وهذا ينبغي أن ماكه من الممكن لأي مختبر لإجراء روتيني من هذا التنبيب، مما يسمح الدراسات الطولية في الفئران الفردية، وبالتالي تقليل عدد الفئران اللازمة وزيادة القدرة الإحصائية باستخدام الماوس كما كل ايقاعه.
Introduction
في عام 1999، نشرت براون وآخرون ورقة تصف طريقة لإدخال أنبوب في الرئة الماوس 1. مثل هذا الأسلوب له فائدة كبيرة في القيام وظيفة تكرار الرئوي أو غسل القصبات في الفئران الفردية في الدراسات الطولية 2. منذ تلك الورقة الأصلية، كانت هناك العديد من الأوراق الأخرى التي وصفت نهج مختلفة لالتنبيب الماوس 3-9. في حين يمكن استخدام جميع هذه الأساليب بنجاح، فإنها تتطلب عادة التدريب أو تكلفة كبيرة. واحدة من القضايا الرئيسية مع التنبيب هو أن مثل هذه مع اقتراب قنية التنبيب يقترب من القصبة الهوائية المعلقة الإدراج، وقنية نفسه يمنع الضوء، وبالتالي تصور حيث يجب ان يرحل. وهكذا، فإن الإدراج يصبح أعمى في الوقت الأكثر حرجا. في هذه الورقة نعرض كيفية ببساطة وبتكلفة زهيدة القضاء على هذه المشكلة التصور، وبالتالي ضمان التنبيب ناجحة مع قليل من التدريب أو نسبياالخبرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. التحضير لإجراء
يجب على المرء أولا الحصول على وإعداد العناصر التالية:
- وقنية. للالتنبيب من الفئران ز 20-35، نستخدم 1 بوصة أو 1.5 الطويل، 20 قسطرة IV قياس (BD Insylte، سباركس، MD أو Optiva Jelco، كارلسباد، كاليفورنيا). ويمكن استخدام قسطرة جديدة معقمة في كل الماوس، ولكن يمكن أيضا القسطرة إعادة استخدامها بعد التعقيم عن طريق نقع في الايثانول 70٪ بين عشية وضحاها. على الرغم من أن أيا من البلعوم ولا القصبة الهوائية من الفأرة عاقر إجراءات النظافة السليمة، بما في ذلك استخدام القفازات المعقمة والأدوات، ينبغي اتباعها.
- كابل الالياف البصرية. نحن نستخدم ≈ 70 سم من الكابلات البصرية 0،5 مم من ادموند البصريات، ولكن طول ليست حرجة. من المهم للتأكد من الألياف وسهلت لها حافة، منذ بعد قطع الكبل طول بشفرة الحلاقة، يتم ترك حافة حادة نسبيا، وأنها لا تأخذ الكثير من الجهد لاختراق الجدار القصبة الهوائية. ومع ذلك، فإنه طمن السهل جدا لتسهيل هذه الحافة من خلال عقد الألياف حوالي 2 سم من نهاية، وجعل دوائر صغيرة ثم لبضع ثوان مع حواف من طرف لمس قطعة ورق الصنفرة من 1،000 الحصباء (انظر الفيديو مظاهرة في الشكل و1 من ماكدونالد، وآخرون 10). يتم إدراج الطرف الآخر من خلال سدادة مطاطية. هو الأكثر بسهولة تحقيق ذلك عن طريق دفع الإبرة أولا 18-قياس من خلال سدادة، إدراج الألياف البصرية من خلال تحمل الإبرة، ثم سحب الإبرة. توصيل سدادة مطاطية لمصدر ضوء الهالوجين 150 واط (مثل NCL-150، فولبي الولايات المتحدة الأمريكية، أو أي مصدر آخر أو الضوء، حتى أقل من 150 واط). من المهم التأكد من استخدام سدادة مصنوعة من مطاط السيليكون (أو غيرها من المواد المقاومة للحرارة)، منذ المطاط أو الفلين العادية قد تحرق عندما تقع على مقربة من مصدر ضوء الساخنة.
2. أداء تنبيب
- أنظر الشكلين 1 و 2. إدراج كابل الألياف البصرية رhrough قطعة قصيرة من أنابيب مطاط السيليكون (≈ 0.8 مم × 4 مم ID OD، كول بالمر، EW-96410-13). ربط هذا الأنبوب المطاطي ضيق إلى حد ما، في حين لا يزال يسمح ليتم ضبط كابلات الالياف البصرية. إدخال أنابيب السيليكون بشكل مريح في نهاية الأنبوب للقنية يحدد موقف كابلات الالياف البصرية في داخل قنية. ضبط موضع كابل الالياف البصرية بحيث يمتد من خلال قنية 4 مم ≈ أمام الطرف قنية.
- ضع الماوس على تخدير الدعم العمودي، علقت من قبل القواطع العلوية في (الشكل 3). معظم المحققين العثور على أفضل التصور مع الجانب البطني من الفأرة التي تواجه أنفسهم. سحب بلطف جدا من اللسان وعقد مع الإبهام والسبابة. يتم وضع الإصبع الأوسط بين الرقبة والدعم من البلاستيك. يتم استخدام الجر على اللسان مع السبابة والإبهام لفتح الفم، وتصويب المسار التنبيب، يتم ضبط زاوية الرأس مع الاصبع الأوسط خلف الرقبةهو موضح في الشكل 3.
- باستخدام كابل الألياف البصرية كمصدر الضوء والتعريف، ودفع من خلال الحبال الصوتية والمرئية. إذا كانت الحبال تكون غير مرئية، وسحب بلطف أصعب على اللسان باستخدام الاصبع الوسطى والدعم. عند إدراجها، دفع ≈ 5 مم قنية أخرى. ثم، ويجري حريصا جدا على ألا نقل قنية، سحب كابلات الألياف البصرية. تقع أسفل الماوس وتأمين قنية مع قطعة من الشريط ودعم مركز قنية على قطعة من البلاستيسين (النمذجة الطين)، كما هو مبين في الشكل 4.
- لا يمكن إجراء في الخطوة 3 أن تدرس بسهولة أو حتى تظاهر، لأنها عملية منفردة. ومع ذلك، تعديلات خفية من الجر على لسان والدعم خلف الرأس تقريبا كل الذين يحاولون هذا سرعان ما تجد الطريق الصحيح لوضع الماوس على تصور الحبال الصوتية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
كما تقييما لطريقة مستخدمة لدينا أربعة القديمة ذكر 20 الاسبوع BALB / ج الفئران مع الوزن المتوسط (± SEM) قدره 27.7 ± 0.40 غرام. ودرسوا على خمسة أسابيع متتالية، حيث تم قياس المقاومة الرئة باستخدام نظام كما هو موضح سابقا 11. كان كل تخدير الماوس مع الكيتامين (100 ميكروغرام / BW ز) وزيلازين (15 ميكروغرام / غرام BW) في المياه المالحة عن طريق الحقن IP. وبعد ذلك مدخل أنبوب كما هو موضح أعلاه. إذا كان هناك أي شك في ما إذا كان هو قنية في القصبة الهوائية والمريء لا يمكن التحقق من صحة هذه باستخدام مرآة صغيرة الأسنان. الحفاظ على المرآة في الفريزر، و. مكان عند الحاجة أمام مركز للقسطرة بالتركيبة إذا القسطرة هي في القصبة الهوائية، والتنفس الزفير تشكيل المكثفات واضحة على المرآة.
بعد التنبيب، ونحن متصل الفئران ثم إلى التنفس الصناعي وقياس المقاومة الرئة والتهوية والفئران بنسبة 2 هرتز وحجم المد والجزر من 0.2 مل، والجهاز التنفسي resis وقد تم قياس املساعدة من خلال طريقة انسداد الشهيق كما هو موضح سابقا 11. ويبين الشكل 5 5 القياسات الأسبوعية في كل من الفئران 4. استنساخ ممتازة، والتي تبين أنه، على الأقل على فترات أسبوعية، هناك أي تأثير للقياس قبل. وهذا يتفق مع تقييم الأسبوعية عنها سابقا لميكانيكا BAL وملامح خلية في الفئران BALB / ج الفردية مع إجراء أكثر صعوبة ويحتمل صدمة 2.
الشكل 1. صورة توضح العناصر المستخدمة في التنبيب. ويرد كابل الالياف البصرية إدراجه ضمن سيليكون سدادة مطاطية، مع قطعة صغيرة من مطاط السيليكون أنابيب مرتبطة بالقرب من الطرف المقابل. وترد سدادة مطاط السيليكون لمصدر الضوء كما هو مبين في الشكل 2.
الشكل 2. ويظهر في الصورة أيضا تظهر سدادة مطاطية متصلة مع مصدر الضوء الطرف الآخر من كابل الالياف البصرية من خلال إدخال قنية التنبيب. A الدعم بسيطة الوقوف على عقد الماوس أثناء التنبيب على اليمين.
الشكل 3. اعدت منظورين تبين موقف الماوس لالتنبيب.
الشكل 4. هذا الرقم يدل على الماوس المنببين استعداد للتهوية. الشريط حول الفم يساعد على الحفاظ على قنية من التحرك. قطعة صغيرة من البلاستيسين (النمذجة الطين) يوفر الراحة مريحة لتأمين محور قنية للاتصال التنفس الصناعي.
الشكل 5. المقاومة الرئة من كل من 4 الفئران (في ألوان مختلفة) في 5 قياس فترات أسبوعية.
الشكل 6. أظهرت هو سجل بيانيا من الضغط الهوائي في واحدة الماوس المنببين بعد حقن 0.5، 0.75، و1 مل. عقدت كل مجلد لثانية 20-40، ثم أطلق سراحه قبل ذلك التضخم المقبل. على الرغم من أنه قد يكون هناك تسرب بطيء جدا بعد الضغط الانتعاش والاسترخاء، هذا من شأنه أن يكون له تأثير يذكر على التهوية الطبيعية أو تقييم القياسات الحيوية وظائف الرئة. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الإجراءات الموصوفة هنا ديها العديد من المزايا. أول جهاز بسيط وغير مكلف نسبيا .. تلفيق جهاز لا يتطلب أي أدوات خاصة أو معدات مكلفة. استخدام قسطرة يدخل هذا هو أيضا مصدر الضوء يعني أن واحدا لم يفقد البصر لفتح القصبة الهوائية كما تقترب من جهة التعريف افتتاح القصبة الهوائية. استخدام التعريف 0.5 مم يعمل أيضا على تقليل الصدمات التي قد تحدث مع الإدراج الأولي لأكبر قنية. نلاحظ هنا أن تحقيق مماثلة البصرية تتوفر من بائع التجارية (برينتري العلمية وبرينتري، MA). أجهزتهم يستخدم بطارية تعمل بالطاقة مصدر الضوء والألياف البصرية.
في العمل الحالي، ونحن اختبار الإجراء مع تكرار القياس لميكانيكا الرئة، ولكن يمكن بسهولة مثلما التنبيب يجوز استخدام هذه المواد الكيميائية لغرس أو الخلايا في الرئة، كما وصفت لتسليم المتكررة من LPS 12. بالإضافة إلى ذلك،ووصف التقرير قبل إجراء التنبيب مع أكثر بدائية القدرة على القيام BAL المتكررة في الفئران الفردية 2، وهذا من شأنه أن يكون أكثر من ذلك بكثير ببساطة تحقيق ذلك مع النهج الجديد التنبيب.
في الواقع، كانت الطريقة الموضحة هنا يدرس بسهولة إلى الزملاء والطلاب والفنيين الذين لم يسبق لهم حاول التنبيب. في الواقع، من خلال دورات تدريبية مجموعة، وبعض من الطلاب إتقان بما فيه الكفاية لتعليم ثم بعض الطلاب الآخرين الذين لم يحاكم حتى الآن. هذه الطريقة لها ميزة كبيرة وبالتالي كما يقلل من عدد من الفئران اللازمة لممارسة وينبغي أن يسمح أضرار طفيفة في الدراسات المتكررة.
في القيام التنبيب، وهناك العديد من القضايا العملية التي ينبغي ذكرها. من المهم أن يكون لطيف ممكن مع تراجع اللسان في افتتاح الأولي من الفم. إذا تم استخدام الملقط دون وقاية فمن السهل أن تجرح اللسان، وهذا يمكن لياد حتى الموت من الفأرة. في أول التعلم كيفية القيام التنبيب، والشيء الأكثر أهمية هو استخدام الاصبع وراء الرقبة لضبط زاوية الرأس لتمكين التصور لفتح القصبة الهوائية. عندما يتم بشكل صحيح، مع الجر كافية على اللسان، يمكن بسهولة أن ينظر الحبال الصوتية. هذا هو التصور الأولي الخطوة التي تتطلب عادة معظم الوقت، لأنه متى يعتبر افتتاح القصبة الهوائية، أنها بسيطة نسبيا لإدراج كابل الألياف وقسطرة وريدية. إذا كان أصلا هناك مشكلة مع هذا التصور، للمتدرب كثيرا ما لا سحب على اللسان مع قوة كافية. زيادة هذه السحب قليلا سوف تصويب المسار التصور بحيث يمكن رؤية الحبال الصوتية. وصف Hamacher، وآخرون، نظام التنبيب فريدة من نوعها مع 4 التصور المجهرية. فيديو على الانترنت من هذه التنبيب ممتازة ومفيدة للغاية، على الرغم من أن وسائل تحديد المواقع الرأس والرقبة ليست واضحة تماما من VIDEO والشكل. في حين أن النظام يصفون يبدو للعمل بكفاءة عالية، فإنه يتطلب المجهر مخصص. وباستخدام نظام الداخلي وصفنا، ويمكن أن ينظر إلى الحبال الصوتية والقصبة الهوائية مع افتتاح بالعين المجردة. في صفنا الأصلي لهذه الطريقة 10، صفنا إجراء لإضافة مخروط إلى قنية التنبيب. هذا أسافين مخروط في البلعوم الماوس الضيقة ويمنع إدراج قنية من يتم عميق جدا. لقد وجدنا أن هذا مفيد في إسفين تعليم الطلاب الإجراء، لأنه من السهل جدا لإدراج قنية إلى كارينا أو بعده، ربما من خلال اختراق جدار مجرى الهواء. ويمكن الاطلاع على التعليمات البسيطة لافتعال إسفين في تلك الورقة. ومع ذلك، مرة واحدة شخص يتعلم جيدا بما فيه الكفاية للإجراءات وحيث لوضع قنية، لم يعد هناك حاجة هذا التكيف.
وأخيرا، ينبغي أن نلاحظ أن لدينا فقط اختبار هذا الإجراء مع قنية مجموعة ال 20 في الفئران الشباب البالغين من سلالات قليلة. في هذه الحالة، قد صادق لنا أن القصبة الهوائية والحبال الصوتية يمكن أن توفر ختم جيدة جدا حول قنية مع الضغوط التهوية الطبيعية، أي أنه هو الحد الأدنى تسرب الهواء من الرئة مع التهوية الميكانيكية. ويبين الشكل 6 نتائج من على كيفية تركيب الكانيولا في C57BL / 6 الماوس، حيث تم استخدام 3 boluses الهواء زيادة (0.5، 0.75، ومل 1) لتضخيم الرئتين. يبدو واضحا من هذا الرقم من تسرب الضغط ضئيلة إلى الضغط الهوائي لا يقل عن 15 شركة بيت إدارة المال O. 2 ومع ذلك، إذا كان أحد يستخدم بشكل كبير الفئران أصغر أو أكبر، أو من سلالات الفئران مع التشريح الرئة مختلفة، ثم قد يكون من الحكمة للتأكد من أن هناك تسريبات الحد الأدنى. إذا كان هناك، قد تتطلب إجراء ثم استخدام قنية حجم مختلفة.
وباختصار، فإن الإجراء إدخال أنبوب وصف هنا غير مكلفة لصنع وسهلة الاستعمال، وينبغي أن تمكن معظم المحققين وفنيي المختبرات على التعلم بسرعة إلى بنجاحينبب الفئران مع خبرة قليلة نسبيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أي من الكتاب لديها أي تضارب في المصالح للكشف.
Acknowledgments
بدعم من المعاهد الوطنية للصحة HL-10342.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intubation cannula | BD Insylte, Sparks, MD or Jelco Optiva, Carlsbad, CA | 1-in.-long, 20-gauge intravenous (IV) catheter | |
| Fiber-optic cable | Edmund Optics, Barrington, NJ | #NT02-542 | Approximately 2-ft length of 0.5-mm optical fiber (Communication grade plastic fiber). The edge of the fiber end that is inserted into the trachea should be gently rounded by holding the fiber ≈2 cm from the end and then making small circles while dragging the tip for a few seconds on 1,000-grit emory paper. |
| Light Source | Volpi | NCL-150 | Although we use a 150-W halogen light source, any equivalent light source, even with much lower wattage can be used. |
| Aluminum tube | One inch O.D., with 1/16 inch wall. This may need to be change to fit whichever light source is used. | ||
| Rubber stopper | A #4 rubber stopper fits the 1 inch tube. | ||
| Small silicone rubber tube | Cole-Palmer | EW-96410-13 | A ≈1.5 cm piece of silicone rubber tubing (0.8 inner diameter, 4 mm outer diameter) |
| Angled support stand | Ours is constucted from plexiglass, but any material to which a thread or wire can be affixed to hold the mouse at an almost vertical angle can be use. |
References
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
- Walters, D. M., Wills-Karp, M., Mitzner, W. Assessment of cellular profile and lung function with repeated bronchoalveolar lavage in individual mice. Physiol. Genomics. 2, 29-36 (2000).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science / American Association for Laboratory Animal Science. 44, 52-55 (2005).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42, 222-230 (2008).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory Animals. 41, 128-135 (2007).
- Zhao, X., et al. A technique for retrograde intubation in mice. Lab Animal. 35, 39-42 (2006).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 8, 103-106 (2004).
- Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G.
- Hastings, R. H., Summers-Torres, D.
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J. Appl. Physiol. 106, 984-987 (2009).
- Ewart, S. L., Levitt, R. C., Mitzner, W. Respiratory system mechanics in mice measured by end-inflation occlusion. Journal of Applied Physiology. 79, 560-566 (1995).
- MacDonald, K. D., McKenzie, K. R., Mitzner, W., Zeitlin, P. L. Lung Mechanics in Heterozygous CF Mice after Repeated LPS Dosing. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 175 (4), A930 (2007).
