Eine einfache Methode der Maus Lung Intubation

Summary

Dieses Papier beschreibt eine striaghforward und effiziente Methode zur Intubation Mäusen Lungenfunktion Messungen oder pulmonale Instillation, dass die Mäuse sich zu erholen und zu späteren Zeitpunkten untersucht werden können. Das Verfahren beinhaltet eine kostengünstige LWL-Lichtquelle, die direkt beleuchtet die Luftröhre.

Abstract

Ein einfaches Verfahren, um Mäuse für Lungenfunktion Messungen intubieren hätte mehrere Vorteile in Längsschnittstudien mit einer begrenzten oder teure Tier. Einer der Gründe, dass dies nicht geschieht routinemäßig mehr ist, dass es relativ schwierig ist, obwohl es mehrere veröffentlichte Studien, die Wege dies zu erreichen beschreiben. In diesem Papier zeigen wir ein Verfahren, das eine der größten Hürden mit dieser Intubation assoziiert, dass der Visualisierung die Luftröhre während der gesamten Zeit der Intubation beseitigt. Der Ansatz nutzt eine 0,5 mm LWL-Lichtquelle, die als Einführer die Intubation Kanüle in die Luftröhre Maus lenken dient. Wir zeigen, dass es möglich ist, dieses Verfahren zu verwenden, um Lungenmechanik in einzelnen Mäusen über einen Zeitverlauf von mindestens mehreren Wochen zu messen. Die Technik kann mit relativ geringem Aufwand und Erfahrung eingestellt werden, und es kann routinemäßig mit relativ wenig Ausbildung erreicht werden. Dies sollte makê es jedem Labor routinemäßig Durchführung dieses Intubation, wodurch Längsschnittstudien in einzelnen Mäusen, wodurch eine Minimierung der Anzahl von Mäusen benötigt und Erhöhen der statistische unter Verwendung jeder Maus als seine eigene Kontrolle.

Introduction

In 1999 veröffentlichte Brown et al. Ein Papier beschreibt eine Methode zur Intubation der Mauslunge ^1. Eine solche Technik hat erhebliche Utility dabei wiederholen Lungenfunktion oder Bronchalveolarlavages in einzelnen Mäusen in Längsschnittstudien ^2. Seit diesem ursprünglichen Papier, gab es mehrere andere Papiere, die verschiedene Ansätze beschrieben haben, um mit der Maus Intubation ^3-9. Während all dieser Verfahren erfolgreich verwendet werden kann, sie in der Regel nur mit erheblichem Ausbildung oder einsehbar. Eines der Hauptprobleme bei solchen Intubation ist, dass die Intubationskanüle Ansätze nähert sich die Luftröhre anstehenden Insertion, sperrt die Kanüle selbst das Licht und damit die Visualisierung von wo es gehen muss. Somit wird das Einführen blinden am meisten kritischen Zeitpunkt. In diesem Papier zeigen wir, wie einfach und kostengünstig zu beseitigen diese Visualisierung Problem, wodurch eine erfolgreiche Intubation mit relativ wenig Training oderErfahrung.

Protocol

Ein. Vorbereitung für die Vorgehensweise

Man muss zuerst erhalten und bereiten die folgenden Elemente:

1. Die Kanüle. Für Intubation von 20-35 g Mäusen, verwenden wir eine 1 oder 1,5 Zoll lang, 20 Gauge IV-Katheter (BD Insylte, Sparks, MD oder Jelco Optiva, Carlsbad, CA). Ein neuer steriler Katheter kann für jede Maus verwendet werden, aber Kathetern können auch nach der Sterilisation durch Einweichen in 70% Ethanol über Nacht wiederverwendet werden. Obwohl weder der Rachen noch Trachea der Maus ist steril richtigen Sauberkeit Verfahren, einschließlich der Verwendung von sterilen Handschuhen und Instrumente angewendet werden sollten.
2. Die faseroptische Kabel. Wir verwenden ≈ 70 cm von 0,5 mm optische Kabel von Edmund Optics, aber die Länge ist nicht kritisch. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Faser ihrem Rand geglättet, da nach dem Schneiden des Kabels zu Länge mit einer Rasierklinge, die Kante nach links relativ scharfe, und es nimmt nicht viel Aufwand zu durchstechen die Trachealwand. Allerdings ist es is sehr leicht, diese Kante, indem die Faser etwa 2 cm vom Ende und dann machen kleine Kreise für ein paar Sekunden mit den Kanten der Spitze berühren ein Stück 1.000 Schmirgelpapier (siehe Demonstration in der Video-und der Abbildung 1 zu glätten MacDonald, et al. ^10). Das andere Ende ist durch einen Gummistopfen gesteckt. Dies geschieht am einfachsten, indem erste Schiebeglied eine 18-Gauge-Nadel durch den Stopfen, Einführen des Lichtwellenleiters durch die Nadelbohrung, dann Zurückziehen der Nadel erfolgt. Der Gummistopfen mit einer 150 Watt Halogen-Lichtquelle angeschlossen ist (zB NCL-150, Volpi USA, oder jede andere Lichtquelle oder sogar weniger als 150 Watt). Es ist darauf zu achten, um einen Stopfen aus Silikongummi (oder anderen hitzebeständigen Material) zu verwenden, da gewöhnlichen Gummi oder Kork kann verbrennen, wenn sich so nahe an der heißen Lichtquelle.

2. Durchführung der Intubation

1. Siehe Abbildungen 1 und 2. Legen Glasfaserkabel turch ein kurzes Stück aus Silikon-Kautschuk-Schlauch (≈ 0,8 mm ID x 4 mm OD, Cole-Palmer, EW-96410-13). Tie dieses Gummischlauch ziemlich eng, solange noch die Glasfaserkabel angepasst werden. Einsetzen der Silikonschlauch gut in der Luer Ende der Kanüle fixiert das Glasfaserkabel Position in der Kanüle. Passen Sie die Position des Fiberkabels so dass es sich durch die Kanüle ≈ 4 mm vor der Kanülenspitze.
2. Platzieren Sie die anästhesierten Maus auf einem vertikalen Träger, der mit seinem oberen Schneidezähne (Abbildung 3) suspendiert. Die meisten Ermittler finden Sie die besten Visualisierung mit der Bauchseite der Maus vor sich. Sehr vorsichtig die Zunge heraus und halten Sie mit Daumen und Zeigefinger. Der Mittelfinger ist zwischen dem Hals und Kunststoffträger platziert. Traction auf der Zunge mit dem Daumen und Zeigefinger wird verwendet, um den Mund zu öffnen, und die Intubation Weg begradigen, wird der Winkel des Kopfes mit dem Mittelfinger hinter dem Hals eingestelltin 3 gezeigt.
3. Mit dem LWL-Kabel als Lichtquelle und Einführhilfe, schieben Sie es durch die visualisierte Stimmbänder. Wenn die Kabel nicht sichtbar sind, sanft schwerer ziehen auf der Zunge mit dem Mittelfinger als Unterstützung. Nach dem Einlegen voran die Kanüle ≈ 5 mm weiter. Dann sehr vorsichtig nicht zu bewegen die Kanüle zurückziehen Glasfaserkabel. Liegen die Maus nach unten und sichern Sie die Kanüle mit einem Stück Klebeband und unterstützen die Kanülenansatz auf ein Stück Knetmasse (Modelliermasse), wie in Abbildung 4 dargestellt.
4. Das Verfahren in Schritt 3 nicht leicht gelehrt oder sogar nachgewiesen werden, da es ein Solobetrieb ist. Doch durch subtile Anpassungen der Traktion auf der Zunge und der Unterstützung hinter dem Kopf fast alle, die versuchen, diese bald den richtigen Weg finden, um die Maus zu positionieren, um die Stimmbänder zu visualisieren.

Representative Results

Als Bewertung des Verfahrens verwendeten wir vier 20 Wochen alte männliche BALB / c-Mäuse mit einem durchschnittlichen Gewicht (± SEM) von 27,7 ± 0,40 g auf. Sie wurden auf fünf aufeinanderfolgende Wochen untersucht, wobei die Lungenwiderstand wurde unter Verwendung eines Systems, wie zuvor beschrieben ^11. Jede Maus wurde mit Ketamin (100 ug / g BW) und Xylazin (15 ug / g BW) in Kochsalzlösung über IP-Injektion. Sie wurden dann intubiert wie oben beschrieben. Wenn es irgendeinen Zweifel, ob die Kanüle in der Luftröhre und nicht die Speiseröhre ist, kann diese validiert mit Hilfe eines kleinen Mundspiegel werden. Halten des Spiegels in einem Gefrierschrank, und bei Bedarf vor Ort des Luer-Hub des Katheters. Wenn der Katheter in die Trachea, wird die Ausatemluft ein sichtbares Kondensat auf dem Spiegel.

Nach der Intubation wir dann die Mäuse an das Beatmungsgerät und der gemessenen Widerstand Lung Die Mäuse mit einer Geschwindigkeit von 2 Hz und Atemvolumen von 0,2 ml belüftet wurden verbunden und respiratorischen Widerstands tung wurde vom inspiratorischen Okklusion Verfahren gemessen, wie zuvor beschrieben ^11. 5 zeigt 5 wöchentliche Messungen in jedem der 4 Mäusen. Reproduzierbarkeit ist ausgezeichnet, die zeigen, dass, zumindest in wöchentlichen Intervallen, gibt es keine Auswirkung des Standes der Messung. Dies ist konsistent mit früher berichtet Wochen der Mechanik und BAL Zellenprofile in einzelnen BALB / c-Mäusen mit einem schwieriger und potentiell traumatischen Prozedur ^2.

Abbildung 1. Bild, das Gegenstände zur Intubation verwendet. Die Lichtleitfaserkabel gezeigt eingefügt in ein Silicon-Gummistopfen, mit einem kleinen Stück aus Silikonkautschuk Schlauch nahe dem gegenüberliegenden Ende gebunden. Ein Silikonkautschuk Stopper an der Lichtquelle angebracht, wie in 2 gezeigt.

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Abbildung 2. Bild zeigt Gummistopfen verbunden Lichtquelle mit anderen Ende des LWL-Kabels durch die Intubation Kanüle eingeführt. Eine einfache Unterstützung stehen die Maus während der Intubation zu halten ist auch auf der linken Seite angezeigt.

Abbildung 3. Zwei Perspektiven, welche die Position der Maus vorbereitet zur Intubation.

Abbildung 4. Diese Abbildung zeigt eine intubierten Maus bereit für die Belüftung. Das Band um den Mund hilft, die Kanüle aus in Bewegung. Ein kleines Stück des Knetmasse (Knetmasse) bietet eine bequeme Rest der Kanülennabe zur Verbindung mit dem Beatmungsgerät zu sichern.

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Abbildung 5. Lung Widerstand von jeweils 4 Mäusen (in verschiedenen Farben) bei 5 wöchentlichen Abständen gemessen.

Abbildung 6. Gezeigt wird ein Diagramm Rekord von Atemwegsdruck in einem intubierten Maus nach Injektionen von 0,5, 0,75 und 1 ml. Jeder Band für 20-40 sec gehalten wurde, dann, bevor dann nächste Inflation veröffentlicht. Obwohl es ein sehr langsames Leck nach dem Stress Entspannung Erholung sein kann, wäre dies eine vernachlässigbare Wirkung auf normale Lüftung oder Beurteilung der dynamischen Lungenfunktion Messungen. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Discussion

Das hier beschriebene Verfahren hat mehrere Vorteile. Zunächst wird die Vorrichtung ist einfach und relativ kostengünstig .. Die Herstellung des Gerätes erfordert keine speziellen Werkzeuge oder teure Ausrüstung. Die Verwendung eines Katheters führt, daß auch die Lichtquelle bedeutet, daß man nie verliert der Trachealöffnung als die Einführeinrichtung die Trachealöffnung nähert. Die Verwendung eines 0,5 mm Einführungsvorrichtung dient auch dazu, Trauma, das mit einem anfänglichen Einsetzen eines größeren Kanüle auftreten könnten minimieren. Wir merken hier, dass eine ähnliche optische Sonde ab einem kommerziellen Anbieter (Braintree Scientific, Boston, MA) ist. Gerät verwendet eine ihrer Batteriebetriebene Lichtquelle und Glasfaser.

In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir das Verfahren mit Wiederholung Messung der Lungenfunktion Mechanik, aber wie Intubation könnte genauso gut verwendet werden, um Chemikalien oder Zellen in der Lunge vermitteln werden, wie es zur wiederholten Lieferung von LPS ¹² beschrieben worden. Zusätzlich ist einvorherigen Bericht mit einer primitiveren Intubation beschriebenen Verfahren die Möglichkeit, wiederholte BAL in einzelnen Mäusen ² zu tun, und das wäre viel einfacher mit dem neuen Intubation Ansatz erreicht.

In der Praxis hat das hier beschriebene Verfahren wurde leicht Stipendiaten, Studenten und Techniker, die noch nie Intubation versucht hatte gelehrt. In der Tat, während Gruppe Trainingseinheiten, werden einige der Schüler ausreichend beherrschen, um dann lehren einige der anderen Schüler, die noch nicht ausprobiert. Dieses Verfahren weist somit einen erheblichen Vorteil, da es die Anzahl der Mäuse für die Praxis erforderlichen Aufwand minimiert und sollte eine minimale Schädigung in wiederholten Studien zu ermöglichen.

Dabei die Intubation, gibt es mehrere praktische Fragen, die erwähnt werden sollten. Es ist wichtig, so sanft wie möglich mit dem Zurückziehen der Zunge in der ersten Öffnung des Mundes. Wenn ungeschützte Pinzette verwendet werden, ist es leicht, die Zunge zu verletzen, und dies kann Lead zum Tod der Maus. Im ersten Erlernen des Intubation zu tun, ist das Wichtigste die Verwendung der Finger hinter dem Hals, um den Winkel des Kopfes anzupassen Visualisierung des Trachealöffnung aktivieren. Bei korrekter, mit ausreichender Traktion auf der Zunge fertig sind, können die Stimmbänder leicht gesehen werden. Es ist diese anfängliche Visualisierung Schritt, erfordert in der Regel die meiste Zeit, da, sobald die Trachealöffnung gesehen wird, ist es relativ einfach ist, das Glasfaserkabel und intravenösen Katheter einzuführen. Anfänglich, wenn ein Problem bei dieser Darstellung ist die oftmals nicht Auszubildender Ziehen an der Zunge mit ausreichender Kraft. Eine Erhöhung dieses Pull leicht wird gerade die Visualisierung Weg, so die Stimmbänder zu sehen. Hamacher, et al. Beschrieben eine einzigartige Intubationssystem mit mikroskopischen Visualisierung ^4. Ihre Online-Video von diesem Intubation ist hervorragend und sehr lehrreich, obwohl die Mittel der Positionierung des Kopfes und des Halses ist nicht ganz klar aus dem video und Figur. Während das System beschreiben sie scheint sehr effizient zu arbeiten, bedarf es einer speziellen Mikroskop. Mit dem System und Verfahren beschreiben wir die Stimmbänder und Trachealöffnung mit dem bloßen Auge gesehen werden kann. In unserem ursprünglichen Beschreibung dieser Methode ¹⁰ beschrieben wir ein Verfahren, um einen Kegel auf die Intubationskanüle hinzuzufügen. Dieser Kegel Keile in den engen Maus Rachen und verhindert, dass die Kanüle aus zu tief eingesetzt. Wir haben festgestellt, dass dieser Keil nützlich Lehr-Studenten das Verfahren ist, da es sehr einfach ist, die Kanüle zur carina oder jenseits einzufügen, möglicherweise durchdringt einen Luftweg Wand. Einfache Anweisungen, um den Keil herzustellen kann in diesem Papier gefunden werden. Allerdings, wenn jemand das Verfahren erfährt ausreichend gut und wo die Kanüle zu positionieren, wird diese Anpassung nicht mehr benötigt.

Schließlich sollten wir beachten, dass wir nur dieses Verfahren mit dem 20 g Kanüle getestet jungen erwachsenen Mäusen ein paar Stämme. In dieser Situation haben wir, dass die validierten Luftröhre und Stimmbänder kann eine sehr gute Abdichtung um die Kanüle mit normaler Ventilation Drücke bereitzustellen, dh eine minimale Luftleckage aus der Lunge mit mechanischer Beatmung. Abbildung 6 zeigt Ergebnisse aus auf Kanülierung in C57BL / 6 Mäuse, wo 3 steigenden Luft Boli (0,5, 0,75 und 1 ml) verwendet, um die Lungen aufzublasen wurden. Wie sich aus dieser Figur als Drucklecks minimal zu einem Luftweg Druck von mindestens 15 cm H ₂ O sind Allerdings, wenn eine im Wesentlichen verwendet jüngere oder ältere Mäuse oder Mäuse von Stämmen mit einem anderen Lungenanatomie, dann wäre es klug, um zu bestätigen, dass es minimale Leckagen. Wenn ja, kann das Verfahren dann erfordern Verwendung einer anderen Größe Kanüle.

Zusammenfassend ist die Intubation Verfahren beschreiben hier kostengünstig herzustellen und einfach zu bedienen, und es sollte damit die meisten Forscher und Laboranten, um schnell erfolgreich zu lernenintubieren Mäuse mit relativ wenig Erfahrung.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Intubation cannula	BD Insylte, Sparks, MD or Jelco Optiva, Carlsbad, CA		1-in.-long, 20-gauge intravenous (IV) catheter
Fiber-optic cable	Edmund Optics, Barrington, NJ	#NT02-542	Approximately 2-ft length of 0.5-mm optical fiber (Communication grade plastic fiber). The edge of the fiber end that is inserted into the trachea should be gently rounded by holding the fiber ≈2 cm from the end and then making small circles while dragging the tip for a few seconds on 1,000-grit emory paper.
Light Source	Volpi	NCL-150	Although we use a 150-W halogen light source, any equivalent light source, even with much lower wattage can be used.
Aluminum tube			One inch O.D., with 1/16 inch wall. This may need to be change to fit whichever light source is used.
Rubber stopper			A #4 rubber stopper fits the 1 inch tube.
Small silicone rubber tube	Cole-Palmer	EW-96410-13	A ≈1.5 cm piece of silicone rubber tubing (0.8 inner diameter, 4 mm outer diameter)
Angled support stand			Ours is constucted from plexiglass, but any material to which a thread or wire can be affixed to hold the mouse at an almost vertical angle can be use.