Summary
本論文では、マウスが回復することを可能にし、それ以降の回で学んだことが肺機能測定や肺点滴用のマウスを挿管のstriaghforwardかつ効率的な方法を説明します。手続きは、直接気管を照らす安価な光ファイバ光源を必要とする。
Abstract
肺機能測定のためのマウスを挿管するための簡単な手順では、限られた数字や高価な動物との縦断的研究では、いくつかの利点を持っているでしょう。これは、より日常的に行われていないことを理由の一つは、それを達成するための方法を説明するいくつか発表された研究があるにもかかわらず、相対的に難しいということです。本稿では、挿管の全体の時間の間に気管を可視化することが、この挿管に関連する主要なハードルの一つを排除する手順を示しています。アプローチは、マウスの気管内に挿管カニューレを指示するイントロデューサとして機能0.5ミリメートルファイバーオプティックライトソースを使用します。我々は、それが少なくとも数週間の時間経過とともに、個々のマウスの肺メカニクスを測定するためにこのプロシージャを使用することが可能であることを示している。技術は、比較的少ない費用と専門知識を使用して設定することができ、それが日常的に比較的少しのトレーニングで達成することができる。これは、MAKべき日常的にこの挿管を行うために、任意の実験室のための可能な電子ば、それによって個々のマウスにおける縦断的研究、それによって必要とされるマウスの数を最小限にし、独自のコントロールとして、それぞれのマウスを使用して統計的検出力を増加させることを可能にする。
Introduction
1999年には、ブラウンらは、マウス肺1の挿管のための方法を説明する論文を発表した。このような技術は、縦断的研究2における個々のマウスにおける反復肺機能や気管支肺胞洗浄を行う際に、かなりのユーティリティを持っています。そのオリジナルの紙なので、マウス挿管3月9日に異なるアプローチを説明してきた他のいくつかの論文があった。これらの方法のすべてが正常に使用できますが、彼らは通常、かなりのトレーニングやコストを必要とします。そのような挿管の主な問題の一つは、挿管カニューレが近づくにつれて気管保留中の挿入に近づく、カニューレ自体が故に光、それが行く必要がどこの可視化を阻止することである。したがって、挿入が最も重要な時期にあるブラインドになります。本稿では、それによって、比較的少ないトレーニングで成功した挿管を確保するか、または、簡単かつ安価この可視化の問題を解消する方法を示し経験。
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Protocol
1。手順の準備
一つは、最初に以下のアイテムを入手し、準備する必要があります。
- カニューレ。20〜35グラムのマウスの気管内挿管については、我々は長い1または1.5インチ、20ゲージの静脈カテーテル（BD Insylte、スパークス、MDまたはJelco Optiva、Carlsbad、CA）を使用しています。新しい滅菌カテーテルを各マウスに使用することができますが、カテーテルはまた一晩70％エタノールに浸漬することにより、滅菌後に再使用することができます。マウスの咽頭気管もどちらも滅菌手袋や楽器の使用を含め、適切な無菌の清浄度の手続きであるが、従わなければならない。
- 光ファイバーケーブルは、我 々は、エドモンド·オプティクスから0.5mmの≈70センチメートル光ケーブルを使用していますが、長さは重要ではありません。これは、カミソリで長さにケーブルを切断した後、エッジは比較的鋭い残されているので繊維は、その縁平滑化を持っていることを確認することが重要であり、それは気管壁を貫通するくらいの努力を取ることはありません。しかし、私はの端から約2cmファイバを保持してから、千グリットのエメリー紙（の映像と図1のデモンストレーションをご覧に触れるなど先端の縁に数秒間小さな円を作ることで、この縁を滑らかにするのは非常に簡単マクドナルドら 10）。もう一方の端はゴム栓に挿通されている。これは、最も簡単にまず針を引っ込める、ストッパーを介して、18ゲージの針を押し込み、針穴を通して光ファイバを挿入することによって達成される。ゴム栓は、150ワットのハロゲン光源（ 例えば 、NCL-150、ボルピ米国、またはその他の、光源、偶数未満150ワット）に接続されている。暑い光源に近いので位置する場合は通常のゴムやコルクが燃えるかもしれないので、シリコーンゴム（または他の耐熱性材料）で作られたストッパーを使用することを確認することが重要です。
2。挿管を行う
- 図1と図2を参照してください。光ファイバケーブルtを挿入hroughシリコーンゴムチューブの短い曲（≈0.8ミリメートル内径x外径4ミリメートル、コール - パーマー、EW-96410から13）。まだ光ファイバケーブルを調整することを可能にしながら、かなりタイトなこのゴムチューブを接続します。カニューレのルアー終わりにぴったりのシリコンチューブを挿入するカニューレ内部の光ファイバ·ケーブルの位置を修正しています。それがカニューレ先端の前にカニューレ≈4ミリメートルを通って延びるように、ファイバーオプティックケーブルの位置を調整します。
- その上顎（ 図3）によって中断され、垂直支持に麻酔マウスを置きます。ほとんどの研究者は、自分自身が直面しているマウスの腹側で最高の可視化を見つける。非常に優しく舌を引き出し、親指と人差し指で押したままにします。中指は首とプラスチック支持体との間に配置されます。人差し指と親指で舌の上でトラクションが口を開こうと、挿管経路をまっすぐにするために使用され、ヘッドの角度は、首の後ろに中指で調整されている図3に示す。
- 光源および導入として光ファイバケーブルを使用して、可視化声帯を通してそれをプッシュする。コードが表示されていない場合は、そっとサポートとして中指を使って舌の上で懸命に引っ張る。挿入されると、さらにカニューレ≈5ミリメートルを進める。その後、 カニューレを移動しないように非常に注意して、光ファイバケーブルを引き出す。マウスを横になってテープでカニューレを固定すると、 図4に示すようにプラスチシン（モデリングクレイ）の作品にカニューレハブをサポートしています。
- それはソロの操作ですので、ステップ3の手順を簡単に教えたりさえ、例証することはできません。しかし、舌と頭の後ろのサポートのトラクションの微妙な調整によりほぼこれを試した全ての人はすぐに声帯を視覚化するためにマウスを置くための正しい方法を見つける。
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Representative Results
方法の評価として、我々は27.7の平均重量（±SEM）±0.40 gで4つの20週齢の雄BALB / cマウスを使用していました。彼らは肺抵抗が以前11に記載されているように 、システムを用いて測定した5週連続、について調査を行った。各マウスは、IP注射を介して生理食塩水にケタミン（100μg/ gでBW）およびキシラジン（15μg/ gで、BW）で麻酔しました。上記のように彼らはその後挿管した。カニューレが気管ではなく食道内にあるかどうか疑義がある場合、これは小さなデンタル·ミラーを使用して検証することができます。冷凍庫にミラーを保持し、カテーテルのルアー·ハブの前に場所を必要とするとき。カテーテルが気管内にある場合は、吐き出された息がミラーで見えるコンデンセートを形成することになる。
挿管後、我々は、マウスを2 Hzの速度と0.2ミリリットルの一回換気量で換気した換気装置と測定肺抵抗にマウスを接続し、呼吸抵抗インダクタンスは、前述の11として吸気閉塞法により測定した。 図5は、4匹のマウスのそれぞれに5週間の測定値を示しています。再現性は、少なくとも週間間隔で、測定前のは効果がない、ことを示す、優れています。これは、より困難な、潜在的外傷手順2で、個々のBALB / cマウスにおける力学とBAL細胞プロファイルの以前に報告された週刊誌の評価と一致している。
図1。挿管に使用する項目を示す絵が。ファイバーケーブルは反対側の端の近くに縛らシリコーンゴムチューブの小片で、シリコーンゴム栓に挿入されて示されている。 図2に示すように、シリコーンゴム栓は、光源に接続されています。
図2。挿管カニューレを介して挿入ファイバーオプティックケーブルのもう一方の端と光源に接続されたゴム栓を示す。シンプルなサポートは挿管中にマウスを保持するために立っている絵は、左に表示されます。
図3。マウスの位置を示す二つの視点は、挿管のために準備。
図4。この図は、換気のために準備ができて挿管され、マウスを示しています口の周りにテープが動いてからカニューレを保持するのに役立ちます。プラスチシンの小片（モデリング粘土）は、人工呼吸器に接続するためのカニューレハブを固定するのに便利な休息を提供します。
図5。 4匹のマウスのそれぞれからの肺抵抗（異なる色で）5週間間隔で測定。
図6。 0.5の注射、0.75、1ミリリットル以下の1挿管マウスにおける気道内圧のチャート記録が示されている。各ボリュームは20から40秒間保持した後、次のインフレその前にリリースした。応力緩和後の回復が非常に遅い漏れがあるかもしれませんが、これは正常な換気または動的な肺機能測定の評価にほとんど影響を持っているでしょう。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
ここで説明する手順では、いくつかの利点があります。最初の装置はシンプルで比較的安価である..装置の製作は、特別なツールや高価な設備を必要としません。カテーテルの使用はまた、光源が一つは紹介者が気管開口部に近づくにつれて、気管開口部の視力を失うことがないことを意味していることを紹介しています。 0.5ミリメートル導入器の使用はまた、大規模なカニューレの最初の挿入で発生する可能性のある外傷を最小にするのに役立ちます。我々はそれに類する光プローブは、商用ベンダー（トリー·サイエンティフィック、ボストン、マサチューセッツ州）から入手可能であることをここで注意。それらのデバイスは、バッテリ駆動の光源と光ファイバを使用しています。
本研究では、肺機能の繰り返し測定で手順をテストしたが、LPSの12の繰り返しの配信のために説明してきたような挿管は、同じように簡単に、肺内に化学物質や細胞を植え付けるために使用することができる。加えて、より原始的な挿管の手順と事前レポートには、個々のマウス2で繰り返さBALを行う能力を説明し、これははるかに単純に新しい挿管アプローチで達成されるでしょう。
実際には、ここで説明する方法は簡単に仲間や学生、挿管を試みたことがなかった技術者に教えられてきた。実際には、集合研修時に、学生の何人かはその後まだ試していなかった他の学生の何人かを教えることは十分に堪能になる。それは練習のために必要なマウスの数を最小限にし、検討を重ね、最小限のダメージを許可する必要がありますので、この方法は、このようにかなりの利点があります。
挿管をする際に、言及されるべきいくつかの実用的な問題があります。口の中の最初の開口部に舌の後退とともに、できるだけ穏やかにすることが重要です。保護されていない鉗子が使用されている場合、それは舌を傷つけることは容易であるが、これはLEAができマウスの死にd。第一挿管を行う方法を学ぶことに、最も重要なことは、気管開口部の可視化を可能にするために、ヘッドの角度を調整する際に、首の後ろに指を使用することである。舌の上で十分なトラクションと、正しく設定が完了したら、声帯を簡単に見ることができます。それは、通常、1回気管開口部が見られるので、それはファイバーケーブルおよび静脈カテーテルを挿入するのは比較的簡単ですが、ほとんどの時間を必要とし、この初期化ステップです。最初は、この可視化の問題がある場合には、研修生は、しばしば十分な力で舌を引っ張っていません。声帯が表示されるように、このプルを大きくすると、わずかに可視パスを整理します。 Hamacher、 らは 、顕微可視化4でユニークな挿管システムを述べる。頭と首の位置決め手段は、VIDから完全に明らかではありませんが、この挿管の彼らのオンラインビデオは、優れた、非常に有益であるEOと図。それらが記述するシステムは非常に効率的に動作するように思われるが、それは専用の顕微鏡を必要とします。私たちが記述したシステムと手順を使用して、声帯と気管開口部が肉眼で見ることができます。この方法で10の私達の元の説明では、挿管カニューレにコーンを追加する手順を説明した。このコーンは狭いマウス咽頭にウェッジとあまりにも深く挿入されるカニューレを防ぐことができます。我々は、それはおそらく、気道壁を貫通し、気管分岐部以降までカニューレを挿入するために非常に簡単ですので、このウェッジは、学生に手順を教えるのに有用であることを発見した。ウェッジを製作するための簡単な手順は、その紙に記載されています。しかし、一度誰かが十分によく手順を学習し、どこにカニューレを配置するには、この適応は不要になりました。
最後に、我々はほんの数株の若い成体マウスでは20グラムカニューレを使用してこの手順をテストしていることに注意する必要があります。このような状況で、我々は気管と声帯は正常な換気圧力にカニューレの周りは非常に良いシールを提供することができることが確認されました、 すなわち最小の空気漏れは、機械換気と肺の外にあります。内挿管上から図6に示す結果は、 3増加する空気ボーラス（0.5、0.75、1ミリリットル）が肺を膨らませるために使用されたC57BL / 6マウス、。これは、圧力リークは少なくとも15 CMH 2 Oの気道内圧を最小限に抑えよりもこの図から明らかな一つは異なる肺の解剖を有する株から実質年下またはそれ以上の年齢のマウス、またはマウスを使用している場合しかし、それは最小限の漏れがあることを確認するのが賢明だろう。存在する場合、プロシージャは異なるサイズのカニューレを使用する必要があります。
要約すると、挿管の手順ここで説明するには、使用して製作するのが安価で簡単であり、そしてそれは、ほとんどの研究者や研究室の技術者が素早く正常に学ぶことができるはず比較的少ない経験でマウスを挿管する。
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Disclosures
執筆者はいずれも、開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
NIHは、HL-10342でサポートされている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intubation cannula | BD Insylte, Sparks, MD or Jelco Optiva, Carlsbad, CA | 1-in.-long, 20-gauge intravenous (IV) catheter | |
| Fiber-optic cable | Edmund Optics, Barrington, NJ | #NT02-542 | Approximately 2-ft length of 0.5-mm optical fiber (Communication grade plastic fiber). The edge of the fiber end that is inserted into the trachea should be gently rounded by holding the fiber ≈2 cm from the end and then making small circles while dragging the tip for a few seconds on 1,000-grit emory paper. |
| Light Source | Volpi | NCL-150 | Although we use a 150-W halogen light source, any equivalent light source, even with much lower wattage can be used. |
| Aluminum tube | One inch O.D., with 1/16 inch wall. This may need to be change to fit whichever light source is used. | ||
| Rubber stopper | A #4 rubber stopper fits the 1 inch tube. | ||
| Small silicone rubber tube | Cole-Palmer | EW-96410-13 | A ≈1.5 cm piece of silicone rubber tubing (0.8 inner diameter, 4 mm outer diameter) |
| Angled support stand | Ours is constucted from plexiglass, but any material to which a thread or wire can be affixed to hold the mouse at an almost vertical angle can be use. |
References
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- Walters, D. M., Wills-Karp, M., Mitzner, W. Assessment of cellular profile and lung function with repeated bronchoalveolar lavage in individual mice. Physiol. Genomics. 2, 29-36 (2000).
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- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42, 222-230 (2008).
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