Summary
Este protocolo demonstra dois métodos de inoculação de introduzir o entomopatógeno fungos
Abstract
Beauveria bassiana é um entomopatógeno fúngico com a capacidade de colonizar plantas endofíticamente. Como um endófito, B. bassiana podem desempenhar um papel na protecção de plantas a partir de herbivoria e doença. Este protocolo demonstra dois métodos de inoculação para estabelecer B. bassiana endofíticamente no feijão comum (Phaseolus vulgaris), em preparação para avaliações subseqüentes de controle biológico endofítica. As plantas são cultivadas a partir de sementes esterilizadas na superfície, durante duas semanas antes de receberem a B. bassiana tratamento de 10 8 conídios / ml (ou água) aplicado quer como uma pulverização foliar ou uma rega do solo. Duas semanas depois, as plantas são colhidas e suas folhas, caules e raízes são colhidas amostras para avaliar a colonização de fungos endofíticos. Para isso, as amostras foram individualmente superfície esterilizada, cortadas em secções múltiplas, e incubados em meio de batata dextrose ágar durante 20 dias. A mídia é inspecionado a cada 2-3 dias para observar o crescimento de fungos comoassociada com seções de plantas e registrar a ocorrência de B. bassiana para estimar a extensão da sua colonização endofítica. As análises de sucesso inoculação comparar a ocorrência de B. bassiana dentro de uma parte determinada planta (folhas, caules ou seja, ou raízes) entre os tratamentos e controles. Para além do método de inoculação, o resultado específico da experiência pode depender da espécie alvo ou variedade de culturas, as espécies de fungos entomopatógenos estirpe ou isolar utilizado, e as condições de crescimento da planta.
Introduction
Entomopatógenos fungos são importantes reguladores das populações de insetos com potencial considerável como mycopesticides 1. Apenas recentemente, contudo, tem sido mostrado por fungos entomopatógenos a ocorrer como endófitos, ambos naturalmente e, em resposta a vários métodos de inoculação 2. A função ecológica da endofíticas entomopatógenos fúngicas permanece em grande parte desconhecida, mas alguns estudos têm implicado los no crescimento de plantas 3,4, resistência herbívoro 5-8, e resistência a doenças 9,10. O objetivo geral dos métodos apresentados aqui é a introdução de um entomopatógeno fungos como um endófito, em preparação para avaliações subseqüentes de controle biológico endofítica.
Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) é a mais estudada entomopatógeno fúngica endofítica 5-9,11-19, e está disponível como uma mycopesticide comercial. Métodos de inoculação testados para estabelecer
O feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) está entre as culturas mais vulneráveis a pragase doenças. Ele pode ser afetada por mais de 400 pragas e patógenos 200, cujo ataque é pensado para ser o fator mais limitante da produção de feijão em todas as regiões 28. Por conseguinte, o feijão comum pode ser uma colheita excelente modelo para estudar o espectro de controlo biológico endofítica por B. bassiana. Como um primeiro passo nesta direção, este artigo descreve pulverizações foliares e poções do solo como métodos de inoculação para introduzir B.bassiana como um endófito em feijoeiro.
Protocol
1. Plantas
- Surface-esterilizar as sementes de feijão (cv. Calima) por imersão durante dois minutos em hipoclorito de sódio a 0,5%, e dois minutos em etanol a 70%. Enxaguar as sementes três vezes em água destilada estéril.
- Avaliar o sucesso da sua esterilização através do plaqueamento de 100 ul de água de enxaguamento final em agar de batata dextroxe (PDA) meios de comunicação, e incubando a placa durante 10 dias a 25 ° C. Encerrar e reiniciar o experimento se algum crescimento é visto na placa.
- Plantar as sementes, em grupos de três em vasos contendo uma mistura estéril de solo e areia numa proporção de 2:1. Transferir os vasos para uma câmara de crescimento a 25 ° C, ca. 50% UR e 12 horas de fotoperíodo. Uma semana após a germinação, eliminar os menos duas mudas vigorosas. De água cada 2-3 dias com água destilada estéril e fertilizar 10 e 20 dias após plantação, com uma solução de água de 6 g / L de fertilizante NPK 15-15-15.
2. Fungo
- Obter um commerformulação social de Beauveria bassiana cepa GHA (Mycotrol SE, Laverlam, Cali, Colômbia).
- Para gerar uma cultura de um único esporo, suspender ca. um circuito de inoculação cheia de conídios em 1 ml de uma solução aquosa a 0,1% de Triton X-100 e vortex durante 10 seg. Em seguida, a placa 100 uL da suspensão em 2,5% de agar Noble e incubar durante 24 horas a 25 ° C. Transferir um único conídio germinando em um PDA placa contendo 100 milímetros e crescer até cobrir toda a placa (cerca de 3-4 semanas).
- Sob condições estéreis, raspar o crescimento de fungos na superfície do meio e suspendê-lo em 10% de 0,1 ml estéril Triton X-100. Vortex durante um minuto. Em seguida, filtrar a suspensão através de uma gaze estéril para remover hifas e obter a suspensão de estoque.
- Usar um hemocitómetro para estimar a concentração de conídios de a suspensão de estoque. Para facilitar a contagem de conídios, preparar uma diluição de 10 mil vezes em série das ações, cada vez que a transferência de 100 o ulf suspensão de conídios em 900 ul de 0,1% de Triton X-100, e vortex durante 10 segundos antes da diluição seguinte.
- Para gerar o inóculo, ajustar a suspensão de pasta até uma concentração final de 10 8 conídios / ml, utilizando a fórmula:
- Para avaliar a viabilidade de conídios, a placa 100 uL de uma diluição de 10.000 vezes em 2,5% de agar Noble e incubar durante 24 horas a 25 ° C. Então, inspecionar três grupos aleatórios de 100 conídios para estimar a germinação por cento. Considere um conídio germinado quando um tubo de germe visível superior a metade do diâmetro dos projectos de conídios a partir dele. Só use a suspensão quando a porcentagem de germinação média superior a 90%.
3. Inoculação
- Inocular plantas quando atingirem o estágio de primeiras folhas (cerca de 14 dias após o plantio). As plantas aquáticas para a capacidade do solo estéril com destilared água 24 horas antes da inoculação.
- Para o método de pulverização da folhagem, utilizar um atomizador manual para aplicar a suspensão de conídios (tratamento) ou 0,1% de Triton X-100 (testemunha) para a superfície (superior) adaxial de folhas até atingirem a saturação. Cobrir a parte superior do vaso com folha de alumínio para evitar o escoamento de conídios ao solo. Após a pulverização, as plantas cobrir com um saco de plástico durante 24 horas para manter um elevado nível de humidade facilitando invasão de fungos.
- Para o método de rega do solo, utilizar um cilindro graduado para aplicar 10 ml de suspensão de conídios (tratamento) ou 0,1% de Triton X-100 (testemunha) para a superfície do solo na base da planta.
- Após a inoculação, as plantas retornar para as câmaras de crescimento organizando-os em um delineamento em blocos casualizados. Nada menos do que quatro blocos experimentais adicionais devem ser instalados para possibilitar a avaliação do crescimento das plantas, além de avaliações de colonização endofítica, no mesmo experimento.
4. Evaluations
- Avaliar a experiência um bloco de cada vez, a selecção dos blocos por ordem aleatória. Isto é particularmente importante para as experiências de grandes dimensões que não podem ser avaliados num único dia.
- Antes de processamento de uma planta, medir e registar a sua altura a partir da base para o meristema apical. Então, arrancar com cuidado e lave em água corrente.
- De cada planta amostra, dois folhetos, dois pedaços de raiz e dois pedaços de caule. Seleccionar amostras aleatoriamente a partir do folheto da primeira folha verdadeira da planta. Em seguida, obter duas amostras estaminais, 3 cm de comprimento cada, a partir do meio da planta e de perto da superfície do solo. Finalmente, obter duas amostras taproot, também 3 cm de comprimento cada, a partir do meio da raiz e a partir de 1 cm atrás da ponta da raiz. Colocar as amostras em três sacos de papel separados e etiqueta de forma adequada.
- Depois de lavar e amostragem todas as plantas em um bloco, começar pelo processamento das folhas, raízes, em seguida, e, finalmente, as hastes.
- Superfície esterilizar tquestões em um capuz de fluxo laminar estéril como em 1.1, acima. Lavar cada amostra três vezes por imersão em água destilada estéril e deixe secar em papel toalha estéril. Então, dissecar e descartar suas bordas exteriores, onde endófitos poderiam ter sido eliminado devido ao contato com desinfetantes.
- Cortar a amostra cortada em seis seções, com média de 6x6 mm para as folhas e 6 mm de comprimento para caules e raízes. Placa das seis secções sobre uma placa de Petri 60 mm com meio BDA suplementado com o antibiótico tetraciclina, estreptomicina e penicilina a 2 mg / L de cada. Selar a placa com parafilme e incubadas no escuro a 25 ° C. Cada planta produz seis pratos, duas peças por planta.
- Mude a água de enxágüe após o processamento de cada bloco de uma parte determinada planta. Antes de eliminar a água de lavagem utilizada chapa, uma amostra de 100 ul de meio BDA e incubar durante 10 dias a 25 ° C para avaliar o sucesso da esterilização. Se o crescimento de fungos se segue, não consideram as amostras correspondentes para análise.
- Inspecionar as placas a cada 2-3 dias durante 20 dias para observar e registrar crescimento de fungos. Seções especiais sobre o consumo de plantas e transferência exibindo presença de endófitos fúngicos para placas contendo PDA fresco. Isto irá evitar a contaminação das secções de plantas vizinhas na placa original.
- Registro B. bassiana crescimento das partes da instalação. Beauveria bassiana podem ser identificados por micélio branco característico denso tornando o creme a amarelo pálido na borda. Quando em dúvida, montar o espécime em uma gota de água e verifique sob um microscópio, procurando globosa conídios e em forma de ziguezague conidióforos, característica da espécie.
- Use blocos experimentais adicionais para avaliar o impacto dos tratamentos sobre a biomassa da planta. Em primeiro lugar, mede a sua altura a partir da base para o topo do meristema apical. Então, cuidadosamente desenraizar e lavar as plantas em água da torneira e deixar secar a 45 ° C durante três dias, para determinar o seu peso seco.
Representative Results
B. bassiana foi capaz de colonizar endofíticamente-p vulgaris, em resposta aos tratamentos com inoculação demonstrado (Figura 1). Ambas as pulverizações foliares e de solo poções resultou na colonização endofítica por B. bassiana, em mais de 80% das plantas tratadas (Figura 2). No entanto, a extensão da colonização depende da parte da planta avaliada eo método de inoculação utilizado. Folhas respondem melhor a inoculações de pulverização. Raízes, por outro lado, respondeu apenas a inoculações rega. Finalmente, caules responderam de forma semelhante para ambos os métodos de inoculação. B. bassiana não foi detectada em qualquer uma das secções de controlo de plantas.
Independente do tratamento, outros endófitos que B. bassiana cresceu de 15% das secções de plantas avaliadas, mas eles foram dissecados a partir de placas de meios antes que pudessem invadir secções vizinhas e influenciar os resultados.
Estações de tratamento e controle foram visivelmente indistinguíveis duas semanas após a inoculação. Não foram detectadas diferenças em seu peso seco e na sua altura.
Figura 1. Os resultados representativos de inoculação sobre a colonização endofítica de plantas de feijão (Phaseolus vulgaris cv Calima.) Por Beauveria bassiana superior esquerdo:. Controle de placas com nenhum crescimento. Superior direito: endófito fúngica de uma seção planta contaminando placa inteira. Canto inferior esquerdo: B. bassiana crescente a partir de duas partes da instalação. Inferior direito: endofítico B. bassiana e conidióforos como visto sob um microscópio.
Figura 2. Efeito da inoculação na colonização endofítica de beaplantas n (Phaseolus vulgaris cv. Calima) por Beauveria bassiana, duas semanas após a inoculação com a estirpe. GHA colonização por cento representa o número de secções de plantas colonizadas, dividido pelo número de secções de cultura.
Discussion
Muitos fatores podem influenciar o resultado de um experimento específico para estabelecer um entomopatógeno fungos como um endófito. Os nossos resultados demonstram o método de inoculação é um deles. Fatores biológicos para experimentar com incluem a colheita de espécies ou de cultivares selecionadas e do fungo entomopatogênico tensão espécies ou isolar usado. Outros factores a considerar incluem a manipulação da concentração do inoculo, a idade da planta durante a inoculação, e as condições de crescimento da planta.
Seria ideal para um método de inoculação de resultar em colonização planta sistémica por um fungo entomopatógeno 14,17,18,21. Em vez disso, parece que os métodos de inoculação tendem a favorecer um padrão específico de colonização local. No café, por exemplo, pulverizações foliares, ao passo que favorecem a colonização folha poções solo favorecem a colonização de raiz 17. Encontramos o mesmo padrão do feijoeiro comum. Finalmente, a escolha do método de inoculação deve serguiado pelo local pretendido do endófito dentro de uma planta, provavelmente combinando o nicho do herbívoro alvo ou patógeno de planta.
Embora comumente usado detecção, endófito e quantificação com base em meios de cultura pode ser caro, difícil e sujeito a erros. Por exemplo, um total de 10.800 partes de plantas (plaqueadas em placas de Petri 1800) foram avaliados num ensaio de optimizar B. inoculações bassiana em banana 16. Destes, 4.496 seções foram colonizados por um suposto B. bassiana, conforme identificado principalmente pela morfologia das colónias. Claramente, uma verificação microscópica das espécies para cada colônia teria sido um passo desejável, mas inacessível. Por outro lado, as secções 1176 foram colonizados por outros fungos e foram descartados e tratados como dados perdidos 16. A probabilidade de existir, no entanto, que a B. bassiana era um concorrente pobres ou mais lento a crescer, e poderia ter eventualmente emergiu dessas seções se umtempo suficiente llowed. Portanto, os métodos de detecção de endofíticos baseados em culturas de mídia estão sujeitos a falsos positivos e falsos negativos. Por conseguinte, o desenvolvimento de uma detecção mais fiável e quantificação de métodos, por exemplo aquelas baseadas em reacção em cadeia de polimerase (PCR) 20,21,24, é bem justificado.
O objetivo final para experimentos de inoculação deve ser desenvolver um tratamento eficaz que proporciona resistência sistêmica durável contra herbivoria e / ou doença. Um plausível, mas ainda não testados, a hipótese é a de que a extensão da colonização endofítica deve correlacionar-se positivamente com o grau de resistência mediada endófita. Um próximo passo natural após o refino métodos de inoculação, portanto, poderia ser a de examinar essa correlação. Vários protocolos de vídeo pode ajudar os pesquisadores a desenvolver um ensaio de resistência adequada para uma praga ou patógeno alvo 29-31. Em última análise, este ensaio é o que vai determinar o sucesso da inóculosmétodo ção, e do potencial para o controle biológico associado endofítica.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.
Acknowledgments
A produção eo trabalho experimental aqui apresentados refletem a ajuda dedicado e entusiasta de Reynaldo Pareja. Financiado pelo Departamento Administrativo da Colômbia de Ciência, Tecnologia e Inovação (Colciencias) e por uma doação da Fundação Bill & Melinda Gates através da Grande iniciativa Explorations Desafios.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
| Mycotrol SE | Laverlam | 4167 | |
| Noble agar | Sigma | A5431-250G | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-25MU | |
| Petri dish (100 x 15 mm) | Fisher | 08-757-12 | |
| Petri dish (60 x 15 mm) | Fisher | 08-757-13A | |
| Potato dextrose agar | Difco | 213400 | |
| Regular bleach (NaOCl) | CLOROX | N/A | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
| Tetracycline | Sigma | T3258-25G | |
| Triple quince (NPK) | ABOCOL | N/A | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Biological safety cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Leica DM LB microscope | Leica | N/A | |
References
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