Summary
Technieken om de mechanismen die ten grondslag liggen aan de afscheiding van HIV-1 Nef in exosomes ontleden worden beschreven. Specifieke korte peptiden afgeleid van Nef en eiwit transfectie werden uitgebuit om de structuur, functie, en bindende partners van Nef's Secretion Wijziging Region bepalen. Deze procedures hebben algemene belang in veel mechanistische studies.
Abstract
Specifieke korte peptiden afgeleid van motieven in full-length eiwitten, in dit geval HIV-1 Nef, niet alleen hun biologische functie behouden, maar ook concurrerend de functie van het eiwit van volledige lengte remmen. Een set van 20 Nef scanning peptides, 20 aminozuren lang met elkaar overlappende 10 aminozuren van zijn buur, werden gebruikt om motieven in Nef verantwoordelijk voor de inductie van apoptose te identificeren. Peptiden die deze apoptotische motieven apoptose vergelijkbaar niveau van volledige lengte Nef proteïne. Een tweede peptide, afgeleid van de Afscheiding Modification Gewest (SMR) van Nef, behield de mogelijkheid tot interactie met cellulaire eiwitten die betrokken zijn bij Nef's secretie in exosomes (exNef). Deze SMRwt peptide werd gebruikt als "lokaas" eiwit in co-immunoprecipitatie experimenten cellulaire eiwitten die specifiek binden aan de Nef SMR motief isoleren. Eiwit en antilichaam transfectie remming gebruikt wordt om de interactie verstoren inzetween Nef en mortalin, een van de geïsoleerde SMR-bindende proteïnen, en het effect werd gemeten met een fluorescentie-gebaseerde exNef secretie assay. Het vermogen van de SMRwt peptide om full-length Nef outcompete voor cellulaire eiwitten die de SMR motief binden, maken het de eerste remmer van exNef secretie. Aldus door het gebruik van hier beschreven technieken, die de unieke eigenschappen van specifieke korte peptiden afgeleid van motieven in full-length eiwitten gebruiken, kan men de identificatie van functionele motieven in eiwitten en de ontwikkeling van peptide-gebaseerde remmers van pathogene functies versnellen.
Introduction
Met de komst van de anti-retrovirale therapie, is de aids-epidemie in de westerse wereld is vertraagd, maar niet beperkt, en de verspreiding van HIV blijft een belangrijk gezondheidsprobleem last over de hele wereld. Met uitzondering van de weinig effectieve RV144 Thai onderzoek kregen HIV vaccins tot dusver geen bescherming tegen infectie. Zo is het onderzoek naar aanvullende, potentiële therapeutische doelen nog steeds gerechtvaardigd.
Naast CD4 T-cel depletie, persistente gegeneraliseerde immune activering is een kenmerk van HIV-infectie. Dit Chronische Immune Activering (CIA) leidt tot een verhoogde celvernieuwing, geactiveerd en gedifferentieerd lymfatische subpopulaties, cellulaire uitputting en veroudering, en het doden van T-cellen en B-cellen via Activering-geïnduceerde celdood (AICD) 1,2,3, en het is goed gevestigd als een van de sterkste voorspellers van progressie van de ziekte 4,5,6,7,8,9,10,11,12. Echter, de onderliggende mechanismen CIA en CD4T-celdepletie in HIV-infecties niet volledig opgehelderd.
Bewijs uit ons lab en anderen leidde ons naar een model voor de progressie van de ziekte (figuur 1) waarin de HIV-eiwit Nef (Negative Regulatory Factor) induceert de afscheiding in exosomes van HIV-1 geïnfecteerde cellen 13,14. Deze Nef-bevattende exosomes (exNef) induceren apoptose in een aantal cellijnen waaronder geïnfecteerde CD4 T-cellen 15,16. Als alternatief, in monocyten / macrofagen exNef verandert genexpressie patronen, bijv. cytokine-expressie, en lijkt een toestand van ongepland activering van het immuunsysteem veroorzaken. Deze hoeveelheid bewijs suggereert een belangrijke rol voor exNef in CIA en CD4 T-cel depletie.
Inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan het vermogen van Nef's te manipuleren de exosomaal mensenhandel route zal nuttig zijn in engineering nieuwe remmers van exNef secretie. Remming van exNef secretie de CD4 T-cel depletie verminderenen de CIA dat station HIV / AIDS pathogenese.
Om het bewijs dat leidde tot ons model voor HIV / AIDS progressie van de ziekte en de daaropvolgende data die bouwde op dit model te verzamelen, hebben we een aantal nieuwe reagentia en methoden die liet ons toe om de genetica van exNef secretie analyseren ontwikkeld, en beginnen aan het bepalen cellulaire proteïnen betrokken. In het eerste werk, we vonden dat Nef proteïne induceert apoptose in cellen omstanders en extracellulair vrij van Nef-getransfecteerde en HIV-geïnfecteerde cellen 15. Peptiden afgeleid van SDF-1α (stromale cel afgeleide factor-1, met alternatieve splicing alpha) was eerder aangetoond dat veel van de binding en signalerende activiteit van het volledige-lengte molecule 17 behouden. We speculeerden dat peptiden Nef enkele van de apoptotische activiteit van het volledige eiwit en dat deze peptiden zouden nood Nef apoptotische domein (en) bevatten kunnen behouden. Om deze peptiden te identificeren en dus de Nefapoptotische domein (en), verkregen we een set van 20 HIV-1 Nef scannen peptiden van de NIH AIDS Research and Reference Reagent Program. Deze 20-aa peptiden, elk overlappend 10 aminozuren van zijn buur, worden genoemd door het aantal van hun laatste aminozuur, dwz N20 overspanningen Nef aminozuren 1-20, N30 overspanningen Nef aminozuren 11-30, etc 16. We vonden dat het blootstellen van T-cellen extracellulair specifieke peptiden overlappen twee afzonderlijke 10-aa domeinen in de full-length Nef proteïne geïnduceerde apoptose in deze cellen. Daaropvolgende analyse van deze Nef-apoptotische afgeleide peptiden bleek hun vermogen om fysiek interactie met de chemokine receptor CXCR4 op het oppervlak van T-cellen, met bindingskinetiek die mogen deze peptiden om competitief binding te remmen tussen CXCR4 en natuurlijke ligand SDF-1α. Tenslotte, de Nef-afgeleide apoptotische peptiden interactie CXCR4 bleek een stressrespons in deze T-cellen leidt tot apoptose. Dit bewijsmateriaal liet ons toe om quicfunctionele domeinen kly kaart Nef's, een proces dat veel langer zou hebben genomen met behulp van standaard DNA-mutagene technieken zoals alaninescanningsmutagenese. Het toonde ook aan dat deze korte Nef-peptiden behouden de biologische functie van de apoptotische domeinen in het eiwit van volledige lengte.
Na een rol voor extracellulair Nef geïdentificeerd, dwz apoptose van T-cellen, zochten we een beter begrip van hoe Nef werd afgescheiden uit cellen. Met een reeks gemuteerde Nef constructen toonden we zeer geconserveerde motieven Nef eiwit in de N-terminale gebieden van zowel HIV Nef en de Rhesus macaque equivalente mac SIV (Simian Immunodeficiency Virus) Nef, die essentieel zijn voor exNef afscheiding 13. Een van deze motieven, de Afscheiding Modification Gewest (SMR; 66VGFPV70), was bijzonder kritisch, zoals alanine vervanging van een van haar vijf aminozuren ofwel sterk verminderd of afgeschaft exNef secretie. Bij aflevering aan cellen via Active Motif's CHariot Protein Delivery Reagent, een peptide dat de SMR aan een FLAG-peptide sequentie (SMRwt) bleek exNef secretie remmen van zowel Nef-getransfecteerde en HIV-geïnfecteerde cellen 18. Op basis van onze eerdere ervaringen met peptiden, hebben we besloten om dit peptide te gebruiken om de moleculen en mechanismen die ten grondslag liggen aan de rol van de Nef SMR's in exNef secretie verhelderen.
Met behulp van de SMRwt peptide als onze "lokaas eiwit", we co-immunogeprecipiteerd cellulaire binding partners van de SMR uit niet-geïnfecteerde T-cellysaten 18. De FLAG-peptide sequentie voorzien van een handig handvat voor het vastleggen van de SMRwt peptide met behulp van anti-FLAG affiniteitshars. Onze eerdere bevinding dat een enkele valine naar alanine mutatie in het SMRwt peptide was voldoende voor de afschaffing van de remming van exNef secretie identificeerde een handige, zeer specifieke controle peptide (SMRmut) die we gebruikten om uit te sluiten co-geïmmunoprecipiteerde eiwitten niet specifiek voor de SMR. Gebruik van een peptide met de specifiek domein plaats dan de full-length eiwit konden we de screening van tientallen cellulaire factoren die binden aan andere domeinen Nef 19 omzeilen.
Eens we de SMR-bindende partners, een logische stap was aan te tonen dat de geïdentificeerde cellulaire bindende partners zijn belangrijk voor de biologische functie 18. De standaardprocedure om dit te bereiken is het knockdown eiwitniveaus met doeleiwit-specifieke miRNA en siRNA en vervolgens assay het effect op de biologische functie. We voerden miRNA knockdown, die translatie van het doelwit-mRNA remt waardoor productie van dit doel, in dit geval een SMR-bindend eiwit. Deze vermindering van het doeleiwit is een indirect effect, en heeft eventueel een vertraagd effect op de biologische functie het doelgericht eiwit speelt een rol in Daarom hebben we ook de minder voorkomende antilichaam remming techniek gebruikt om te bepalen of direct verstoren van de activiteit vanhet doeleiwit beperkte of geen biologische functie. In deze werkwijze worden antilichamen opgewekt tegen het doelwit eiwit getransfecteerd in de cel met behulp Chariot Reagent en rechtstreeks met het doeleiwit of afzonderen uit de plaats van de functie, of de relevante bindende domein blokkeren. Remming van het doelwit eiwit via deze procedure rechtstreeks verstoort zijn functie, en kan RNA knockdown procedures aan te vullen met verdere bevestiging van het belang van het doelwit eiwit naar de biologische functie.
Terwijl Chariot Reagens effectief in het leveren van peptiden en eiwitten in cellen, een proces is tijdrovend en beperkt de aard van de dierproeven, bijvoorbeeld langdurige of herhaalde blootstelling en in vivo dierstudies die kunnen worden uitgevoerd. Daarom hebben we een cel-penetrerende peptide (CPP) die toegevoegd is aan de SMRwt peptide (SMRwt-CPP) 18 een peptide die kunnen worden overgenomen door cellen passief producerenuit het kweekmedium. Deze versie was even werkzaam als de eerste bij het remmen exNef secretie.
Het bewijs uit de gepubliceerde experimenten toont het vermogen van kleine peptiden die specifieke functionele motieven voor de functie van het eiwit van volledige lengte antagoniseren door competitieve remming, en de eiwitten die deze motieven binden te isoleren. Men zou verwachten dat deze technieken moet nuttig in vele experimentele protocollen. Zij moeten ook effectief in engineering nieuwe peptide remmers van vele cellulaire processen, een functie die kan verder worden verbeterd door binding aan CPP sequenties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I. Het gebruik van korte peptiden in Biological Analysis
I.1. Mapping Biologisch Functionele Motieven gebruiken Peptiden
- Behandelen cellen met Nef scanning peptiden
- Schaffen een set van peptiden scannen het gebied van belang. Voor onze experimenten 20-meer peptiden met 10 aminozuren overlappen, die de gehele HIV-1 Nef-eiwit (205 aa), werden verkregen van de AIDS Reagent Program. De peptiden zijn afzonderlijk als volgt bepaald:
- Voeg 10 ng / ml peptide aan het celkweekmedium.
- Voeg 10 ml kweekmedium per plaat op celculturen Jurkat.
- Incubeer kweken gedurende 24 uur bij 37 ° C.
- Terminale deoxynucleotidyltransferase-gemedieerde dUTP biotine Nick End Labeling (TUNEL) assay van apoptose
- Was de cellen met 1X PBS en vast gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met 4% paraformaldehyde in 1X PBS, pH 7,4.
- Was met 1X PBS, en doorlaatbaar met 0,1% Triton X-100 gedurende 10min bij kamertemperatuur.
- Spoel de cellen tweemaal met 1X PBS.
- Telling gekleurde cellen door epifluorescentie op een computergestuurde microscopiesysteem.
I.2. Concurrerende remming Analysis middels Peptides
- Co-transfectie van peptiden met behulp van de Chariot Protein Delivery Reagent Kit
- Per transfectie reactiemengsel verdund 1 ug wtNef GFP-plasmide-DNA en 100 ng van ofwel wildtype peptiden afgeleid van het SMR domein of peptiden met alanine-vervanging van afzonderlijke aminozuren in de SMR motief, tot een eindvolume van 100 pl met 1X PBS.
- Verdun 6 pi van een 1/10 verdunning van Chariot reagens tot een uiteindelijk volume van 100 pi met steriel water en combineren met de verdunde DNA-peptide mix.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten om de vorming van de Chariot / DNA-peptide complex toestaan.
- Pellet 3 x 10 5 Jurkat cellen door centrifugatie bij 600 xg gedurende 5 minuten.
- Twee keer wassen cellen met 1X PBS, en opnieuw in suspensie in de Chariot / DNA-peptide complex.
- Voeg 400 ul serumvrij RPMI 1640 medium om de suspensie en incubeer de cellen in kweekplaten bij 37 ° C gedurende 2 uur.
- Voeg 1 ml vers RPMI 1640 medium dat 10% FBS aan elke plaat en incubeer de cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C.
- Oogst cellen en bepaal transfectie-efficiëntie door fluorescentie microscopie.
- Nef-GFP secretie fluorescerende plaat lezer assay van peptide remming
- Verzamel de cel-vrije media uit de geoogste cellen geconditioneerde, en breng 100 ul aan de individuele putjes van een 96-well zwarte microtiterplaat.
- Maatregel GFP-fluorescentie in de media op een Tecan GENEios fluorimeter met excitatie golflengte 485 nm en emissie golflengte van 515 nm in relatieve fluorescentie-eenheden.
- Het niveau van GFP-fluorescentie in de controlegroep (media uit cellen gecotransfecteerd met Nef-GFP en een gecodeerd peptide) En 100%.
- Vergelijken met het niveau van GFP-fluorescentie in de media van cellen die gecotransfecteerd met verschillende SMR peptiden veranderingen in Nef-GFP secretie bepalen.
I.3. Isoleren Motif Binding Partners behulp Peptiden als Bait
- Co-immunoprecipitatie met SMR peptiden
- Jurkat cellen groeien in RPMI 1640 medium dat 10% FBS bij 37 ° C in een T-75 weefselkweekkolf en pellet cellen door centrifugeren bij 1000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Bepaal de transfectie-efficiëntie, door het plaatsen van de plaat onder een fluorescentiemicroscoop, foto's maken, en vervolgens de telling van de totale en de gelabelde cellen en bepaal het percentage gelabelde cellen.
- Resuspendeer de cel pellet in 1 ml 1X PBS, en overbrengen naar een 1,5 ml Eppendorf buis. Microcentrifuge bij 1000 xg gedurende 1 minuut. Resuspendeer de pellet in 1 ml α-FLAG Lysisbuffer door zachte pipetteren. Lysis buffer: Mix 50 mM Tris • HCl pH 7,4, 150 mM natrium-chloride [NaCl], 1 mM EDTA en 1% Triton X-100, met 1 mM fenylmethylsulfonylfluoride [PMSF], en 10 ul / ml Protease Inhibitor Cocktail voor gebruik met zoogdiercellen en weefselextracten [PIC, Sigma]. Voeg onmiddellijk voor gebruik.
- Differentiële microcentrifuge de suspensies op 2000 g gedurende 5 minuten en bij 13.000 xg gedurende 10 min om pellet celafval en DNA, respectievelijk. Verzamel de bovenstaande vloeistof (hierna de "lysaat").
- Voeg 1 mg lysaat eiwit en 1 ug van hetzij de SMRwt of SMRmut peptide 20 pl anti-FLAG M2 affiniteit gel (hierna "hars", Sigma). Merk op dat zowel SMRwt en SMRmut hier gebruikt hebben een FLAG tagsequentie ingebed in de peptiden. Breng het mengsel aan een eindvolume van 1 ml in Co-IP-buffer (α-FLAG Lysisbuffer minus PMSF en PIC). Incubeer het mengsel bij 4 ° C gedurende de nacht met end-over-end rotatie. Als negatieve controle, incubeer het lysaat met de hars in de afwezigheid van hetzij peptide.
- Pellet de hars door microcentrifugatie bij 5000 - 8000 g gedurende 30 sec. Laat hars te regelen voor 2 minuten voordat het monster en vervolgens het supernatans aspireren. Verwijder de bovenstaande vloeistof met een smal-end pipet tip of een Hamilton injectiespuit, zorg dat er geen hars dragen. Narrow-end pipet tips kunnen worden gemaakt met behulp van een tang om de opening van een plastic pipet tip knijpen totdat het gedeeltelijk gesloten is. Was de hars vier maal met 500 ui wasbuffer (50 mM Tris • HCl pH 7,4, en 150 mM NaCl). Elueer de gebonden cellulaire eiwitten met 15 ug van 3X FLAG peptide (Sigma) in 50 ui wasbuffer en geïncubeerd op rocker / schudder gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Concentreer de eluaten met aceton precipitatie, gevolgd door koken in Laemmli monsterbuffer (Bio-Rad). Scheid de eiwitten door SDS-PAGE op een 4-20% Tris-HCl Criterion prefab gel (Bio-Rad). Vlekken op de gel met Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad). Opmerking: voor massaspectrometrie identificatie experimenten (
- Co-immunoprecipitatie met Nef-GFP-eiwit
- Meng 50 pl Proteïne G Dynabeads magnetische beads (Invitrogen) met 2 ug monoklonaal anti-GFP in 1 ml 1X PBS met 0,02% Tween 20 (PBS-T). Incubeer het mengsel end-over-end rotatie in een 1,5 ml Eppendorf buis gedurende 1 uur bij 4 ° C.
- Scheid de parels van de buffer door het plaatsen van de buis op een 1,5-ml MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (Promega Corp, Madison, WI) waardoor magnetische pulldown gevolgd door verwijdering van het supernatant. Was de anti-GFP beklede korrels met 1 ml PBS-T vervolgens voorzichtig pipetteren.
- Lyse Nef-GFP getransfecteerde Jurkatcellen met 1 ml 1X RIPA + buffer door zachte pipetteren en incubatie gedurende 15 min op ijs. RIPA buffer +: 10X RIPA Lysis Buffer, pH 7,4 [Millipore, Bedford, MA] 1:10 verdund in steriel water, 0,02% natriumazide [Sigma], en 0,1% natriumdodecylsulfaat [SDS], met 1 mM PMSF en 10 gl / ml PIC toegevoegd onmiddellijk vóór gebruik.
- Pellet de celresten door microcentrifugatie bij 2000 xg gedurende 10 minuten. Verzamel de bovenstaande vloeistof (hierna de "lysaat").
- Voeg 1 mg lysaat eiwit aan het anti-GFP beklede parels Breng het uiteindelijke volume met 1 x RIPA-buffer + 1 ml, en incuberen van het mengsel met end-over-end rotatie gedurende 1 uur bij 4 ° C. Opmerking: Voor peptide competitie studies, 1 mg lysaat eiwit worden vooraf geïncubeerd met 2 ug SMRwt of SMRmut peptide in 1 ml RIPA + 1X buffer, alvorens te worden toegevoegd aan de anti-GFP beklede parels.
- Was de korrels door resuspensie in 1 ml wasbuffer (50 mM Tris • HCl pH 7,4, 150 mM NaCl en 0,1% Tween 20). Incubeer met end-over-end rotatie gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Scheid de kralen from het wassen met behulp van de magnetische scheiding Stand. Was de kralen een tweede en derde keer met wassen buffers die 250 mM en 300 mM NaCl, respectievelijk.
- Resuspendeer de kralen in 200 ul PBS, breng het mengsel op een schone buis en scheid de parels van de was op de magnetische standaard. Kook de beads in 50 pl Laemmli monsterbuffer 5 min bij 95 ° C, laat het mengsel afkoelen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en plaats het mengsel op de magnetische standaard voor de scheiding en verzamel de bovenstaande vloeistoffen ("eluaten") .
- Scheid de eiwitten van het eluaat door SDS-PAGE op een 8-16% Tris-HCl Criterion prefab gel.
- Massaspectrometrie
- Accijnzen de eiwitbanden belangstelling van Coomassie-gekleurde gels.
- Verminder de monsters in 10 mM 1,4-dithiothreitol (DTT) gedurende 45 min bij 37 ° C.
- Alkyleren de monsters in 55 mM joodacetamide gedurende 45 minuten bij 25 ° C.
- Verteren de monsters overnacht met sequencing leerjaar trypsin (Promega) bij 37 ° C.
- Ontzouten het monster peptiden met C-18 ZipTip (Millipore). Meng het monster peptiden met alfa-CHC Matrix (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), en spotten ze op een MTP doelframe III (Bruker Daltonics Inc, Billerica, MA).
- Voer tandem matrix-assisted laser desorptie / ionisatie tijd van de vlucht (MALDI-TOF/TOF) massaspectrometrie-analyse met een Bruker Daltonics ultraflex III TOF / TOF.
- Vergelijk de MS / MS-gegevens aan de NCBI niet-redundante en Swiss-Prot databases met behulp van de Mascot algoritme ( www.matrixscience.com ).
- Immunoblot analyse
- Scheid de eiwitmonsters door SDS-PAGE op 4-20% of 8-16% Tris-HCl Criterion voorgegoten gels (Bio-Rad). Breng de banden elektroforetisch naar een nitrocellulose membraan.
- Was het membraan in Tris gebufferde zoutoplossing (TBS, Bio-Rad) gedurende 5 minuten. Blok met 5% magere melk in TTBS (TBS met 0,1% Tween 20) gedurende 1 uur door schudden bij kamertemperatuur.
- Verwerk de membraan immunoblotting met een specifiek primair antilichaam in 5% magere melk met schudden bij 4 ° C overnacht. Wassen in TTBS gedurende 20 min gevolgd door een secundair HRP geconjugeerd IgG (H + L) antilichaam in 5% magere melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Was in TTBS voor 30-60 minuten.
- Detecteren de eiwitbanden door Western blotting luminol reagens (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA). Expose de filter aan fotografische film. Opmerking: In sommige experimenten werd een stripping reagens gebruikt voor het membraan (Pierce, Rockford, IL) gevolgd door hybridisatie met een verschillende primaire en secundaire antilichaam te strippen.
- Scan de X-ray films in Adobe Photoshop 5.0.2. Voer densitometrie analyse met behulp van ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
II. Gebruik van antilichaam Remming in Functional Analysis
II.1. Co-transfectie van Antibodies met de Chariot Protein Delivery Reagent Kit
- Per transfectie reactiemengsel verdund 1 ug wtNef GFP-plasmide-DNA en 1 pg van hetzij anti-mortalin antilichaam of anti-α-tubuline antilichaam, tot een eindvolume van 100 pl met 1X PBS. Opmerking: Er is eerder gevonden dat co-transfectie van het anti-α-tubuline antilichaam geen detecteerbaar effect op exNef secretie, en dus dient als een effectieve negatieve controle in deze experimenten.
- Verdunnen 6 gl onverdund Chariot reagens tot een uiteindelijk volume van 100 pi met steriel water en combineren met de verdunde DNA-antilichaam mix.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten om de vorming van de Chariot / DNA-antilichaam complex toestaan.
- Pellet 3 x 10 5 Jurkat cellen door centrifugatie bij 600 xg gedurende 5 minuten.
- Twee keer wassen cellen met 1X PBS, en opnieuw in suspensie in de Chariot / DNA-antilichaam-complex.
- Voeg 400 ul serumvrij RPMI 1640 medium om de suspensie en incubeer de cellen in kweekplaten bij 37 ° C gedurende 2 uur.
- Voeg 1 ml vers RPMI 1640 medium dat 10% FBS aan elke plaat en incubeer de cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C.
II.2. Nef-GFP Afscheiding Fluorescent Plate Reader Assay van Antibody Remming
- Verzamel de cel-vrije media uit de geoogste cellen geconditioneerde, en breng 100 ul aan de individuele putjes van een 96-well zwarte microtiterplaat.
- Maatregel GFP-fluorescentie in de media op een Tecan GENEios fluorimeter met excitatie golflengte 485 nm en emissie golflengte van 515 nm in relatieve fluorescentie-eenheden.
- Het niveau van GFP-fluorescentie in de controlegroep (media uit cellen gecotransfecteerd met Nef-GFP en anti-α-tubuline antilichaam) en 100%.
- Vergelijken met het niveau van GFP-fluorescentie in de media van cellen die gecotransfecteerd met anti-mortalin antilichaam aan veranderingen in Nef-GFP secretie bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mapping Biologisch Functionele Motieven behulp Peptiden. Twee regio's werden geïdentificeerd op Nef eiwitten die apoptose te induceren. Peptide-driven apoptose werd waargenomen (Figuur 2) begin met peptide N50 (aa30-50), met een piek op N60 (AA40-60) en de N70 (aa50-70), en afnemende tot achtergrondniveau op peptide N100 (aa80-100). De belangrijkste Motief 1 (M1) piek gecentreerd op aa50-60 induceert> 80% van de apoptotische niveaus van de volledige lengte Nef proteïne. Een tweede, kleinere apoptotische piek werd waargenomen verspreid peptiden N180 (AA160-180) en de N190 (aa170-190). Deze minor Motif 2 (M2) piek gecentreerd op aa170-180, induceert ~ 30% van de niveaus van apoptotische volledige lengte proteïne Nef 16.
Concurrerende remming Analysis middels peptiden. In figuur 3, peptiden met een intacte SMR remde exNef secretie. Dit gold ongeacht of het motief is gelegen aan de N-terminus (Wildtype-1) of middelste (wildtype-2) van het peptide, of werd gedupliceerd in het peptide (wildtype-3). Alternatief alanine-substitutie van een aminozuur van het motief, ongeacht de positie of het nummer motief in het peptide, opgeheven van het peptide functie 18. Een 11 aminozuur gecodeerde versie van Nef de apoptotische Motief 1 (SM1), eerder beschreven 14 en verkregen van Sigma Genosys, werd gebruikt als een negatieve controle en had geen effect op exNef secretie. Zie tabel 1 voor een overzicht van de peptide sequenties.
Isoleren Motif Binding Partners behulp Peptiden als aas. Figuur 4A toont de co-immunoprecipitatie van vier eiwitten door de SMRwt peptide (60, 65, 75, en 250 kDa). De negatieve controle SMRmut peptide heeft deze eiwitten vangen en deze eiwitten geen niet-specifieke interactie met de affiniteit hars in de afwezigheid van peptide, wat suggereert dat de co-immuno-geprecipiteerde eiwitten werden interactiespecifiek de SMR motieven van de SMRwt peptide. Deze eiwitten werden vervolgens geïdentificeerd door MALDI-TOF massaspectrometrie achter elkaar (zie figuur 4B voor een representatieve steekproef), en geverifieerd door immunoblotanalyse 18.
Gebruik van antilichaam Remming in Functional Analysis. Remming met anti-mortalin antilichaam afgeschaft exNef uitscheiding (Figuur 5). Dit bevestigde dat een intacte Nef / mortalin interactie is vereist voor exNef secretie. Bovendien suggereert sterk dat het mechanisme waardoor de SMRwt peptide remt exNef secretie door verstoring van de interactie door directe competitie voor mortalin 18.
Tabel 1. Panel van SMR peptiden ontwikkeld en getest voor hun effect op Nef geïnduceerde exNef secretie. Deze table werd oorspronkelijk gepubliceerd in Shelton et al., JVI., 2012 18. In vorige studies, alanine-vervanging van enkele aminozuren van de SMR motief aanzienlijk verminderd of opgeheven, Nef geïnduceerde secretie 18. Virus geïsoleerd uit een langdurige nonprogressor uitgedrukt een variant van Nef met een isoleucine in plaats van V66;. Een van de weinige gerapporteerde variaties in het sterk geconserveerde SMR motief 20 Klik hier om een grotere tafel te bekijken .
Figuur 1. Effecten van Nef exosomes over belangrijke immuun celtypes. Dit model toont exNef vrijkomen uit geïnfecteerde cellen, en het is voorspelde effecten op monocytcellen en lymfatische cellen die zou leiden tot aidspathogenese. AICD, activering geïnduceerde celdood. I. geïnfecteerde cel releases virus, normaal exosomes en exNef. exNef activeert ongeactiveerde, niet-geïnfecteerde monocyten (B). De activering van monocyten (C) leidt tot veranderingen in genexpressie leiden tot verhogingen van de inflammatoire toestand en resulteren in activatie en uitputting van CD4 + en CD8 + T-cellen. II. Geïnfecteerde cel releases virus, normale exosomes en exNef. exNef activeert ongeactiveerde, niet-geïnfecteerde lymfocyten (D). De geactiveerde lymfocyten (E) ondergaan genexpressie veranderingen die resulteren in AICD resulteert in een gladde spiercellen (F). hier grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Peptide scanning analyse van het HIV-1 Nef proteïne van apoptotische motief (s). Een set van 20-meer peptiden met elk 10 aminozuur overlap, verspreid over de 205 aminozuren van het KNFS Nef proteïne werd verkregen van de AIDS Reagent Program en gebruikte in kaart brengen van de Nef apoptotische domeinen. Dit cijfer werd oorspronkelijk gepubliceerd in Huang et al.., JVI, 2004 13. De Y-as geeft percentage cellen die TUNEL worden gemerkt en de X-as geeft de behandelingsgroep. Volledige Nef eiwit [Nef], onbehandelde cellen [UT], of de peptiden te beginnen met aa1-20 [N20], en eindigend met AA190-205 [N205]. Error bars geven de standaardfout van metingen, en de resultaten zijn een verzameling van tenminste 3 onafhankelijke experimenten. De toppen van apoptose zijn aangeduid met Motief 1 en Motif 2.
Figuur 3. SMRwt peptide remt exNef. Peptiden dieeen of meer wildtype Nef SMR sequentiemotieven remde de afscheiding van exNef, terwijl alanine-vervanging van een animo zuur van deze regio sterk de effectiviteit van het peptide verlaagd. Dit cijfer werd oorspronkelijk gepubliceerd in Shelton et al.., JVI, 2012 15. Kweekmedia van Jurkat T-cellen gecotransfecteerd met Nef-GFP clone en diverse SMR peptiden werden getest op secretie exNef. De hoeveelheid GFP fluorescentie gemeten gelijk aan de hoeveelheid exNef-GFP in de extracellulaire media. Statistische significantie werd bepaald met behulp van een ongepaarde t-test. Het effect op exNef secretie van verschillende peptiden werd vergeleken met dat van een willekeurig gecodeerde peptide control (SM1, * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001).
Figuur 4. De SMRwt peptide interageert specifiek met gastheercel eiwitten, waaronder mor talin. (A) Eiwitten van Jurkat T-cellen werden geco-immunoprecipitatie met ofwel de SMRwt of SMRmut peptiden met anti-FLAG M2 antilichaam-gekoppelde affiniteit hars. Merk op dat zowel SMRwt en SMRmut hier gebruikt hebben een FLAG tagsequentie ingebed in de peptiden. Dit cijfer werd oorspronkelijk gepubliceerd in Shelton et al.., JVI, 201215. Deze procedure werd herhaald in afwezigheid van hetzij peptide als controle voor niet-specifieke interacties met de affiniteit hars. De Coomassie Blue gekleurde gel wordt afgebeeld eiwitten met molecuulgewichten van 60, 65, 75 en 250 kDa (pijlpunten) getrokken door SMRwt die niet door de SMRmut peptide of zonder peptide werden getrokken. (B) Het 75-kDa band werd uit de gel, gedigereerd met trypsine en geanalyseerd door MALDI-TOF massaspectrometrie. De MS / MS Ion zoeken identificeerde de 75-kDa als mortalin. Pijlen geven de sequenties van de overeenkomstige peptiden.large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken
Figuur 5. Mortalin antilichaam blokkeert remming exosome secretie. Extracellulaire kweekmedia van Jurkat cellen gecotransfecteerd met Nef-GFP klonen en antilichamen tegen ofwel mortalin of α-tubuline, werden getest op secretie exNef. In vergelijking met het effect van een antilichaam tegen een eiwit niet bij exNef secretie (α-tubuline), verstoring van mortalin activiteit door het antilichaam tot een volledige opheffing van exNef secretie. Statistische significantie werd bepaald met ongepaarde t-test waarbij exNef secretie in aanwezigheid van de mortalin antilichaam tegen de α-tubuline antilichaam (*** p <0,001). Dit cijfer werd oorspronkelijk gepubliceerd in Shelton et al., JVI., 2012 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inzicht in de mechanismen die ten grondslag liggen aan het vermogen van Nef's te manipuleren de exosomaal mensenhandel route zal nuttig zijn in engineering nieuwe remmers van exNef secretie. Remming van exNef secretie moet de CD4 T-cel depletie en CIA die rijden HIV / AIDS pathogenese afnemen. Naar dit doel, hebben we een aantal nieuwe reagentia en methoden die liet ons toe om de genetica van exNef secretie te analyseren, en beginnen om de cellulaire eiwitten die betrokken bepalen ontwikkeld. Deze benadering heeft ook geleid tot de ontwikkeling van de eerste remmer rechtstreeks ingrijpen exNef secretie, de SMRwt peptide.
Een belangrijke conclusie van ons werk is dat specifieke korte peptiden afgeleid van motieven in full-length eiwitten, in dit geval HIV-1 Nef, niet alleen hun biologische functie behouden, maar ook competitief de werking van het eiwit van volledige lengte remmen. Omdat deze peptiden behouden hun biologische functie, kunnen ze worden gebruikt om de functionele domeinen te identificerenin het eiwit van volledige lengte. Twee dingen nodig: het genereren van peptiden die het eiwit van belang, of de gehele lengte of een deel van het eiwit scannen gedacht dat de functionele domein bevat, en een test voor het testen van de biologische functie in kwestie. Omdat we ontbrak informatie waarmee we verfijnen het zoeken naar apoptose-inducerende motieven op specifieke gebieden van Nef, gebruikten we een set van peptiden scannen de gehele lengte. Terwijl dit proces eenvoudiger gemaakt door Nef's relatief kleine omvang, hebben we deze benadering toegepast om grotere (> 75 kDa) eiwitten. Een gevestigde assay voor het meten van apoptose (TUNEL) werd toegepast om peptiden behoud van de biologische functie van belang vast in casu Nef geïnduceerde apoptose van CD4 T-cellen. Interessant is dat de latere analyse in het oorspronkelijke document blijkt dat de geïdentificeerde apoptotische peptiden behield> 80% van de biologische activiteit van het volledige lengte proteïne Nef en competitief geremd CXCR4 bindingvan zijn natuurlijke ligand SDF-1α.
Ook een kort peptide dat de SMR motief van Nef behield zijn biologische vermogen tot interactie met cellulaire eiwitten die betrokken zijn bij exNef secretie. Echter, in dit geval het behoud van de activiteit niet tot mimicry van een Nef functie, zoals het geval is met inductie van apoptose was, maar in plaats daarvan leidde tot remming. Omdat de SMRwt peptide effectief gebonden de SMR-bindingsplaatsen van deze cellulaire eiwitten, het verstoorde hun interacties met Nef, en bijgevolg verhinderd Nef's secretie in exosomes. Zoals de Nef motief van belang was bekend uit eerdere genetische mapping studies, waren we in staat om peptide ontwikkeling beperken tot variaties van de SMR. In plaats van het identificeren van nieuwe functionele motieven, gebruikten we deze peptiden, en een eerder ontwikkelde fluorescentie-gebaseerde test voor het meten van exNef secretie, om aan te tonen dat de rol van de SMR in exNef secretie direct werd gekoppeld aan de specifieke primaire sequentie.
HIV-1, Human Protein Interaction database bevat meer dan 60 cellulaire eiwitten die direct interageren met Nef en misschien wel 200 die direct of indirect 19 interactie. Door het op de sequentie van onze aas eiwit aan het motief van belang dat we vermeden te sorteren door de tientallen eiwitten die zouden zijn mede immunologisch de volledige lengte Nef proteïne. De meeste van deze eiwitten, en specifiek voor Nef, zou niet bindingspartners voor Nef de SMR, en aldus achtergrond / ruis vormen. Een conservatieve berekening dat we de ruis verminderd met 15x (60/4). In wezen onze aanpak effectief verhoogde de signaal-ruisverhouding met achtergrondruis minimaliseert door off-site of in ons geval off-bindende motief, waardoor we identify eiwitten die specifiek binden aan het SMR. Het is echter mogelijk dat met deze methode, hebben we niet alle SMR-bindende cellulaire proteïnen, in het bijzonder die die interactie vereisen zowel de SMR en een tweede motief Nef binden, of waarvan binding afhankelijk is van secundaire vangen of tertiaire structuur.
Mortalin, een cellulair eiwit co-immuungeprecipiteerd door de SMRwt peptide, werd aangetoond dat vereist is voor exNef secretie door miRNA knockdown en antilichaam remming. De eerste is een gevestigde techniek die vermindert of elimineert de expressie van de beoogde eiwit. Daarentegen is antilichaam remming laat eiwitexpressie verlagen maar fysiek interactie inhibeert de beoogde eiwit met andere eiwitten. We gebruikten deze tweede methode om het belang van de Nef-mortalin interactie voor exNef secretie demonstreren. Antilichaam remming is straight-forward werkwijze die een werkwijze voor het inbrengen van het antilichaam nodigin de cel en een assay voor het testen van het effect op de biologische functie in kwestie. We gebruikten de Chariot Protein Delivery Reagent naar shuttle anti-mortalin antilichamen in de cel, en de genoemde fluorescentie-gebaseerde test om veranderingen in exNef secretie te meten. Zoals de meeste antilichamen gebaseerde procedures, wordt de effectiviteit van antilichaam remming beperkt door de affiniteit en specificiteit van het antilichaam voor de beoogde eiwit.
Een belangrijk doel van het HIV-onderzoek is de ontwikkeling van nieuwe therapieën en de identificatie van potentiële doelwitten voor therapie. De hier beschreven leverage specifieke korte peptiden, die hun biologische functie behouden en kunnen competitief de werking van full-length eiwitten remmen, dat proces te versnellen. Hoewel de beschreven experimenten waren gericht op het begrijpen van een belangrijke HIV functie moet de technieken voor het bestuderen van eiwit-eiwit interacties en de ontwikkeling van peptide-gebaseerde wordenremmers op diverse gebieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH / NIGMS / MBRS (Grant 58.268), NIH / NCRR / RCMI (Grant G12-RR03034), Georgië Research Alliance financiering subsidie GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA subsidie F31AI091484, Emory CFAR subsidie P30 A1050409. Dit onderzoek werd uitgevoerd in een faciliteit gebouwd met steun van Research Facilities Verbetering Grant # C06 RR18386 van NIH / NCRR. De Jurkat-cellen, de set van 20 HIV-1 Nef peptiden, evenals het konijn anti-HIV-1 Nef antiserum werden verkregen van het NIH AIDS Research en Reference Reagent Program, (Rockville, MD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20mer peptide set with 10 amino acid overlap | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 4641 | |
| TUNEL Assay | Roche | 11 684 809 910 | |
| Chariot Protein Delivery Reagent | Active Motif | 30100 | |
| Tecan GENEios fluorimeter | (Tecan Group, Switzerland) | ||
| 96-well black microtiter plate | Corning | 3792 | |
| anti-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Invitrogen | 100.03D | |
| MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) | Promega Corp., Madison, WI | Z5332 | |
| C-18 ZipTip | Millipore | ZTC18S096 | C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution |
| MALDI TOF/TOF | Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF |
References
- Forsman, A., Weiss, R. A. Why is HIV a pathogen? Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).
- Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S.
- Smith, S. M. The pathogenesis of HIV infection: Stupid may not be so dumb after all. Retrovirology. 3 (1), 60 (2006).
- Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin. Exp. Immunol. 90 (3), 376-382 (1992).
- Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 6 (8), 904-912 (1993).
- Bofill, M., Mocroft, A., Lipman, M., Medina, E., Borthwick, N. J., Sabin, C. A., Timms, A., Winter, M., Baptista, L., Johnson, M. A., Lee, C. A., Phillips, A. N., Janossy, G. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10 (8), 827-834 (1996).
- Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 16 (2), 83-92 (1997).
- Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A.
- Roberts, L., Passmore, J. A., Williamson, C., Little, F., Bebell, L. M., Mlisana, K., Burgers, W. A., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24 (6), 819-831 (2010).
- Mueller, Y. M., Petrovas, C., Bojczuk, P. M., Dimitriou, I. D., Beer, B., Silvera, P., Villinger, F., Cairns, J. S., Gracely, E. J., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ t cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J. Virol. 79 (8), 4877-4885 (2005).
- Picker, L. J., Reed-Inderbitzin, E. F., Hagen, S. I., Edgar, J. B., Hansen, S. G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Lifson, J. D., Maino, V. C., Axthelm, M. K., Villinger, F. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J. Clin. Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Mueller, Y. M., Do, D. H., Altork, S. R., Artlett, C. M., Gracely, E. J., Katsetos, C. D., Legido, A., Villinger, F., Altman, J. D., Brown, C. R., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J. Immunol. 180 (1), 350-360 (2008).
- Ali, S. A., Huang, M. B., Campbell, P. E., Roth, W. W., Campbell, T., Khan, M., Newman, G., Powell, F., Powell, M. D., Bond, V. C. Genetic Characterization of HIV Type 1 Nef-Induced Vesicle Secretion. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 26 (2), 173-192 (2010).
- Raymond, A. D., Campbell-Sims, T. C., Khan, M., Lang, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS. 27 (2), 167-178 (2011).
- James, C. O., Huang, M. -B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. J. Virol. 78 (6), 3099-3109 (2004).
- Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. J. Virol. 78 (20), 11084-11096 (2004).
- Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides. Curr. Biol. 8 (7), 369-376 (1998).
- Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef's interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release. J. Virol. 86 (1), 406-419 (2012).
- Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24 (12), 1497-1502 (2008).
- Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo. J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).
