Summary
Aquí se describe un protocolo para aislar los subconjuntos de precursor de células B de sangre del cordón umbilical. Una cantidad suficiente y calidad de los ácidos nucleicos se pueden extraer de las células y utilizarse en ensayos subsiguientes utilizando ADN o ARN.
Abstract
Sangre del cordón umbilical es altamente enriquecida en células progenitoras hematopoyéticas en diferentes etapas del linaje de compromiso. Hemos desarrollado un protocolo para el aislamiento de precursor de células B en cuatro etapas diferentes de diferenciación. Debido a que los genes se expresan y modificaciones epigenéticas ocurrir en una manera específica de tejido, que es vital para discriminar entre tejidos y tipos de células con el fin de ser capaz de identificar alteraciones en el genoma y el epigenoma que puede conducir al desarrollo de la enfermedad. Este método puede ser adaptado a cualquier tipo de célula presente en la sangre del cordón umbilical en cualquier etapa de diferenciación.
Este método comprende 4 etapas principales. Primero, las células mononucleares se separan por centrifugación de densidad. En segundo lugar, las células B se enriquecen usando biotina conjugado con anticuerpos que reconocen y eliminar los no células B de las células mononucleares. Terceros las células B están marcadas fluorescentemente con anticuerpos proteína de superficie celular específicos para las etapas individualesde desarrollo de células B. Finalmente, las células marcadas fluorescentemente se ordenan y poblaciones individuales se recuperan. Las células recuperadas son de cantidad y calidad suficiente para ser utilizada en posteriores ensayos de ácidos nucleicos.
Introduction
Con el fin de identificar aberraciones que están presentes en la enfermedad, es de vital importancia que utilizamos tejidos sanos o células que se corresponden con el tipo de tejido o célula afectada por la enfermedad. Una razón para esto es que la variación epigenética entre tipos de tejidos es responsable de regular la expresión génica y es crítica para la diferenciación celular durante el desarrollo normal de 1,2 humana. Una segunda razón es que la regulación aberrante de genes específicos de tejido pueden tener consecuencias nefastas sobre el desarrollo normal y se sabe que contribuyen a una multitud de estados de enfermedad, incluyendo el cáncer. Por lo tanto, una mejor comprensión de una enfermedad que implica a las células hematopoyéticas requiere el conocimiento de las células hematopoyéticas sanas.
El desarrollo de las células hematopoyéticas en la médula ósea procede a través de una orden sistemático de los eventos que se caracterizan por cambios en la expresión de marcadores de superficie celular 3. Estudios con participantes adultos tienendemostrado que la médula ósea contiene generalmente un bajo número de precursor de células B 4,5; mientras que los estudios con participantes pediátricos han demostrado que el porcentaje de precursor de células B es relativamente alta en los individuos de menos de 5 años de edad 6. Sangre de cordón umbilical se utiliza como una fuente de células madre hematopoyéticas en el tratamiento de trastornos relacionados con la sangre y tumores malignos, está fácilmente disponible a través de los bancos de sangre de cordón y está enriquecida en B y las células T inmaduras 7 que son las células diana de múltiples trastornos, incluyendo la leucemia y los linfomas.
Precursor de células B en la médula ósea han sido ampliamente phenotyped 8,9 y puede ser definido por la presencia de marcadores específicos de la superficie celular que se pueden utilizar para clasificar estas células en subconjuntos distintos. Normales de células B. Con la diferenciación a través de una serie de etapas en la médula ósea a partir de los primeros pro-células B y culminando en inmaduros o ingenuo células B. Conformevan a Zelm y colegas 10, pro-células B se caracterizan por la presencia de CD34 y en la transición a la etapa 2 (Pre-BI) CD19 se adquirieron. Células de la etapa 3 (Pre-BII) ya no expresan CD34 y comienzan a expresar IgM citoplásmica. Finalmente, una característica definitoria de la etapa 4 (inmadura de células B) es la expresión de IgM de superficie. La estrategia de clasificación se describe en este protocolo fue descrito por primera vez por Caldwell y colegas 6 e incluye el uso de sólo 3 marcadores de superficie celular que reduce considerablemente la complejidad y el coste de la realización de experimentos de clasificación de células. En su trabajo, una relación entre CD45 y las etapas de diferenciación de células B se estableció. Ellos observaron que las células B en la médula ósea mostrar niveles variables de expresión de CD45. Específicamente, las células que expresaron altos niveles de CD45 correspondieron a células que expresan IgM de superficie (células B inmaduras), aquellos que expresan un nivel intermedio de CD45 correspondieron a células que expresaron cytoplasmic IgM (pre-BII células), y las que expresan bajos niveles de CD45 correspondieron a células que no expresan IgM citoplásmica (pre-BI células). Este protocolo utiliza la estrategia desarrollada por Caldwell y colegas 6 para aislar los subconjuntos de precursor de células B de sangre del cordón umbilical (Figura 1) que pueden ser utilizados en ensayos de aguas abajo que requieren alta calidad de ácidos nucleicos tales como el ensayo isla CpG metilado-recuperación (MIRA ) 11 y cuantitativos ensayos de PCR en tiempo real. El método emplea una separación inicial usando perlas magnéticas para agotar todas las células no-B de sangre del cordón umbilical y requiere sólo la tinción con anticuerpos 3 (CD34, CD19 y CD45). Las células que se recuperan representan 4 estadios de diferenciación de células B: 1) CD34 +, CD19 + (tarde) pro-B y principios de pre-BI, 2) CD34 -, CD19 +, CD45 baja (finales de pre-BI); 3) CD34 -; CD19 +; CD45 med (pre-BII), y 4) CD34 -; CD19 +; CD45 alta (células B inmaduras).
Protocol
1. Aislamiento de células mononucleares de sangre de cordón umbilical
- Preparar el tampón PBS-EDTA-añadir 5 ml de albúmina de suero bovino (BSA) solución madre a 95 ml de tampón de lavado (1:20 dilución). Desgasificar el tampón y mantener el búfer en hielo IMPORTANTE:. Si no se desgasificar el tampón puede resultar en resultados menos que óptimos cuando se aísla CD19 + células B porque las burbujas puede bloquear la columna de aislamiento.
- Preparar tubos cónicos de 50 ml por centrifugación en gradiente de densidad. Determinar el número de tubos necesarios para el procesamiento de la sangre del cordón umbilical (1 tubo puede procesar 8 ml de sangre) y añadir 15 ml de Ficoll-Paque PLUS a cada tubo.
- Diluir 8 ml de sangre de cordón con 24 ml de DPBS (1x) y cuidadosamente la capa de la mezcla diluida de sangre de cordón en la parte superior de la Ficoll-Paque PLUS en cada uno de los tubos de 50 ml cónicos. No mezcle la sangre y Ficoll-Paque PLUS IMPORTANTE:. Para evitar la mezcla de la sangre del cordón umbilical y PLUS Ficoll-Paque, sostenga el tubo en un ángulo de 45 grados ycapa de la mezcla de sangre lentamente.
- Centrifugar a 400 xg durante 40 min a 20 ° C. Las células mononucleares (MNC) se mantendrá en el plasma-Ficoll-Paque PLUS interfaz mientras que los granulocitos y eritrocitos de sedimentos debido a la mayor densidad a la presión osmótica de Ficoll-Paque PLUS. Etiqueta siete 5 ml de fondo redondo tubos para ser utilizados en la Parte 3 con el ID de la muestra, la fecha y la siguiente:
| Tubo | Etiqueta | Propósito |
| 1 | Sin teñir | Células no teñidas para la normalización durante la citometría de flujo |
| 2 | 7AAD | Para determinar la viabilidad durante citometría de flujo |
| 3 | + + + | Contiene las células que se según |
| 4 | 34 + | Para recoger CD34 + / CD19 +(Fines de pro-B - principios de pre-BI), las células |
| 5 | Bajo 45 | Para recoger CD34 - / CD19 + / CD45 bajo (pre-BI), las células |
| 6 | 45 med | Para recoger CD34 - / CD19 + / CD45 Med (pre-BII) las células |
| 7 | 45 de alto | Para recoger CD34 - / CD19 + / CD45 alto (B) células inmaduras |
Escudo tubos 4, 5, 6, y 7 con FBS al 2% y colocar todos los tubos en hielo.
- Aspirar la capa superior de plasma cuidadosamente y evitar el contacto con la capa de células mononucleares. Usando una pipeta de 10 ml de vidrio, transferir cuidadosamente la capa de células mononucleares a un nuevo tubo cónico de 50 ml. Combinar las células mononucleares de tres tubos juntos en un tubo de 50 ml único.
- Llenar el tubo con PBS, mezclar suavemente y centrifugar a 300 xg durante 10 min a20 ° C. Aspirar con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. Repita 1x. Después del primer lavado, resuspender los gránulos y transferir a un tubo de 50 ml único cónica.
- Suavemente resuspender el sedimento celular en 200 ul de PBS. Eliminar 1 l de la suspensión de células, añadir a 1 ml de PBS en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y dejar de lado para contar (contar las células después de la colocación de la suspensión 50 ml de células en la centrífuga). Llenar el tubo con PBS y centrifugar a 200 xg durante 15 min para eliminar las plaquetas. Eliminar el sobrenadante completamente sin alterar el sedimento celular.
2. Modificado células B Aislamiento de células mononucleares utilizando separación MACS
- Resuspender el precipitado de la etapa 160 con 1,7 l frío (4 ° C) con EDTA tampón PBS.
- Añadir 40 l B-CLL cóctel de anticuerpos con biotina. Pipeta para mezclar bien e incubar durante 10 min a 4 ° C.
- Lavar las células - añade 1 ml frío (4 ° C) con EDTA tampón PBS por 10 millones de células (células numbre determinado en el paso 1,7) y se centrifuga a 300 xg durante 10 min. Aspirar el sobrenadante completamente y luego volver a suspender el sedimento celular en 320 l frío (4 ° C) con EDTA tampón PBS.
- Añadir 80 mu l anti-biotina MicroBeads, se mezcla bien y se incuba durante 15 min a 4 ° C.
- Lavar las células - añadir 1 ml frío (4 ° C) con EDTA tampón PBS por 10 millones de células y se centrifugan a 300 xg durante 10 min. Resuspender hasta 100 millones de células en 500 l de frío (4 º C) con EDTA tampón PBS. Volumen de tampón de escala de acuerdo con el número de células.
- Preparar columnas MACS y separadores MACS durante la centrifugación (Paso 2.5). Colocar una columna de LS en el campo magnético del separador MACS, añadir 3 ml de frío (4 º C) con EDTA tampón PBS en la columna y permitir que el tampón a gotear a través de la columna. Use un receptáculo para coger el flujo a través. Desechar el flujo a través.
- Colocar un tubo cónico de 50 ml debajo de la columna y pipetear la suspensión celular en la columna. Permita que las células no marcadas a gotear through de la columna y en el tubo cónico de 50 ml. IMPORTANTE: Estas son las células que se utilizarán para el etiquetado de anticuerpos y de células de clasificación. No deseche el flujo a través. Para recuperar todas las células de la etapa 2,5, agregar un adicional de 1 ml de frío (4 º C) con EDTA tampón PBS a las paredes del tubo cónico. Mezclar suavemente y pipetear la suspensión celular restante en la columna. Repita 1x. Continúe en el paso 2,8 usando las células no marcadas recogidos en el tubo cónico después de pasar a través de la columna.
- Llenar el tubo cónico que contenía las células no marcadas con PBS y centrifugar a 300 xg durante 10 min. Retirar con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento celular. Añadir 200 l de EDTA-tampón PBS y suavemente resuspender las células.
3. Anticuerpo etiquetado y preparación para la clasificación de células
- Aspirar 1 l de la suspensión celular y el lugar en el tubo con la etiqueta "sin mancha" (paso 1,4). Añadir 500 l de EDTA tampón PBS y almacenar el tubo en hielo.
- Añadir 20l de cada anticuerpo (CD19, CD34 y CD45) por millón de células en la suspensión celular restante. Mezclar bien y colocar el tubo en la oscuridad durante 30 min a TA. Anticuerpos CD son ligeros pasos delicados, completos 2-4 con las luces apagadas.
- Después de 30 min de incubación con anticuerpos, aspire 40 l de la suspensión celular y colocarlo en el tubo etiquetado "7AAD". Añadir 1 ml de PBS en el tubo y centrifugar a 500 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante y resuspender las células en 100 l de tampón de unión. Añadir 7 l de 7AAD (7-Aminoactinomycin D) e incubar en la oscuridad durante 10 min a TA. Durante la etapa de 10 min de incubación completa 3,4.
- Añadir PBS a la parte superior del tubo que contiene las células que quedan marcadas con anticuerpos CD. Centrifugar el tubo a 500 xg durante 3 min. Eliminar el sobrenadante, añadir 500 l de EDTA tampón PBS y resuspender el botón celular. Transferir todo el volumen de la suspensión de células en el tubo etiquetado "+ + +". Para recuperar la totalidad de la suspensión de células add un adicional de 1 ml de EDTA tampón PBS al tubo cónico de 50 ml y la transferencia en el tubo marcado como "+ + +".
- Después de la incubación (paso 3.3), añadir 300 l de tampón de unión en el tubo 7AAD. El "sin mancha", "7AAD" y "+ + +" muestras y el "34 +", "45 bajo", "med 45" y "45" tubos altos están listos para citometría de flujo.
4. Clasificación de células Utilizando el citómetro de flujo MoFlo XDP
- Set-up MoFlo para la clasificación: Alineación láser, chorro de gotitas estabilizar, determinar retraso gota.
- Preparar los controles individuales de compensación de color utilizando Invitrogen AbC ratón talón kit (o similar) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ejecutar los controles de un solo color, ajustando las tensiones de canales de fluorescencia para la separación óptima de las poblaciones positivas y negativas. Establecer y aplicar los coeficientes de compensación parámetro compensa con el protocolo de recogida. Volver a establecer coeficientes de compensación cada vez que se obtiene un nuevo lote de anticuerpos.
- Crear protocolo incluyendo parcelas como se muestra en la Figura 2.
- Ejecutar muestra sin teñir, ajuste de voltaje y ganancia de dispersión frontal y lateral, e identificar las poblaciones negativas de fluorescencia. Debido a que la recuperación de ADN es el objetivo de la clase, el umbral debe establecerse bajo (≤ 1%), de modo que el ADN que contiene desechos no contamine las muestras recuperadas. * Asegúrese de que el sistema de evacuación de aerosol se está ejecutando en todo momento que viven las células humanas se están ejecutando en el MoFlo.
- Ejecutar una pequeña alícuota de los + + + muestra (~ 50.000 eventos) para establecer la estrategia de puerta (Figura 2). Debido a que las células B progenitoras no dispersar de forma idéntica a las células B maduras, sin sincronización backgate el CD19 + / CD34 + población en el complot vs SSC FSC para asegurar la puerta de linfocitos incluye posibles células pro-B. De esta muestra también se establece la población fluorescencia negativa para 7AAD.
- Ejecutar el ejemplo 7AAD para determinar la viabilidad de la muestra. Sólo las células de ordenación a partir de una muestra con alta viabilidad en laprincipio (≥ 95%) como células muertas se tiñen de manera indiscriminada y puede contaminar las poblaciones de ordenación.
- Configure las decisiones de ordenación para recoger cuatro poblaciones: CD19 + / CD34 +, CD19 + / CD34 - / CD45 baja; CD19 + / CD34 - / CD45 med, y CD19 + / CD34 - / CD45 alto. Incluya los linfocitos y las puertas doblete discriminación en las decisiones de ordenación de todas las poblaciones.
- Para evitar obstrucciones en la punta de la clasificación, el filtro + + + muestra a través de un filtro de 40 micras celda inmediatamente antes de la selección y volver a filtrar si cualquier agregación se produce en la muestra durante la clase.
- Ordenar las células en tubos de recogida (paso 1,4) recubiertas con FBS al 2% en PBS en un soporte de tubo enfriada o hielo compactadas.
- Inmediatamente después de la especie se ha completado, extraer el ADN.
Representative Results
Entre muestra de variación desempeña un papel en el éxito de la especie celular (Tabla 1). Las muestras con buenas tasas de éxito tienen bajos niveles de contaminación de desechos (Figura 3A) y las muestras con escaso éxito tienen altos niveles de contaminación de desechos (Figura 3B). Entre la muestra variación puede ser algo controlado si la muestra de sangre del cordón umbilical se recogió dentro de las 24 horas de embarque (O / N prioritario).
Las células de flujo según de cada precursor de células B son subconjunto de cantidad y calidad suficientes para realizar aislamientos de ácido nucleico. El ADN aislado es de alta calidad y pueden ser utilizados en los análisis. En forma rutinaria utilizar este ADN en MIRA 11 para enriquecer el ADN metilado (Figura 4).
| Cable de datos de las instalaciones de sangre | Ordenar Malo | |
| Sangre con anticoagulante Volumen de trabajo (ml) | 110 | 104 |
| Glóbulos blancos [10 3 / l] | 8,68 | 11,19 |
| Los linfocitos [10 3 / l] | 3,88 | 3,76 |
| Linfocitos (%) | 44,70 | 33,6 |
| Glóbulos rojos [10 6 / l] | 3,65 | 3,05 |
| En casa de Datos | ||
| Móvil Número después de Ficoll-Paque | 206 M | 309 M |
| Número de células después de la separación MACS | 22 M | 16,5 M |
| Eventos Count Total (MoFlo XDP) | 30,57 M | 19,97 M |
| Viabilidad (%) | 98,00 | 98,00 |
| Las células de puerta de linfocitos (%) 17,00 | 50,00 | |
| CD19 + / CD34 + | ||
| Número total de células | 10959 | 48316 |
| % Del Total de eventos | 0,04 | 0,24 |
| Eficiencia | 88% | 88% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 bajo | ||
| Número total de células | 16619 | 26941 |
| % Del Total de eventos | 0,05 | 0,13 |
| Eficiencia | 89% | 87% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 med | ||
| Número total de células | 469745 | 507540 |
| % Del Total de eventos | 1,54 | 2,54 |
| Eficiencia | 89% | 89% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 alto | ||
| Número total de células | 1896062 | 2047142 |
| % Del Total de eventos | 6,2 | 10,25 |
| Eficiencia | 91% | 90% |
Tabla 1. Representante estadísticas de clasificación celular. Filas 1-5 son cuentas que ofrece el centro de sangre del cordón umbilical. Las filas restantes son datos recogidos en nuestro laboratorio. El tipo pobre contenía altos niveles de residuos y un bajo porcentaje de células en la puerta de linfocitos.
Figure 1. Diagrama de flujo del procedimiento. Sangre del cordón umbilical se procesa y las células mononucleares se aíslan usando Ficoll-Paque Plus. Una etapa adicional de lavado se incluye para eliminar las plaquetas contaminantes. Las células B se aíslan de las células mononucleares utilizando la MACS de células B humanas kit de aislamiento (B-CLL). Este paso se utiliza biotina-conjugado con anticuerpos monoclonales (CD2, CD4, CD11b, CD36, anti-IgE y CD235a) para eliminar todas las células no-B. Los recuperadas células B son etiquetados con CD19-APC, CD34-PE y anticuerpos CD45-FITC a continuación, ordenados usando el citómetro de flujo MoFlo XDP para recuperar precursores de células B subconjuntos: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 baja , CD19 + / CD34 - / CD45 med, y CD19 + / CD34 - / CD45 alto.
Figura 2. Gating estrategia para identificar y clasificar poppoblaciones. Las flechas rojas indican la puerta que se aplica a la trama subsiguiente. Puertas R4, R5, R6 y R7 indican poblaciones ordenadas. A) Avanzar vs trama lado de dispersión que muestra la población de linfocitos enriquecido. Puerta R1, linfocitos. B) Altura vs ancho del gráfico de dispersión hacia adelante para identificar células individuales en comparación con dobletes. R2, puerta única célula. C) CD19-APC células positivas se dividen en poblaciones de CD34-PE negativos y positivos. R3, CD19 + / CD34 - puerta, R4, CD19 + / CD34 + puerta indicando población deseada tipo d) CD19 + / CD34 - las células se dividen en tres un tanto distintas CD45-FITC poblaciones.. R5 y R6, CD19 + / CD34 - / CD45 y CD19 baja + / CD34 - / CD45 poblaciones med, respectivamente. R7, por el número de células altas en el CD19 + / CD34 - / CD45 población, esta puerta especie abarca sólouna parte de la población. Todas las células de esta población no necesitan ser recogidos para los análisis.
Figura 3. A) Los bajos niveles de contaminación de los desechos después del enriquecimiento columna. R1, puerta de linfocitos. B) Los altos niveles de contaminación de los desechos después del enriquecimiento columna.
Figura 4. Enriquecimiento de ADN metilado de los subgrupos de células B precursoras. Un ADN) Sonicated aislado de precursores de células B de subconjuntos es de alta calidad. Para la construcción de ADN de biblioteca se somete a sonicación a una media de 200-600 pb. Carril 1: escalera de 100 pb Promega (catálogo # G2101); Carril 2: ADN total aislado de CD19 + / CD34 + células; Línea 3: El ADN total aislado de CD19 + - / células CD45 bajos; Carril 4: 100 ng de ADN aislado a partir de CD19 + / CD34 - / CD45 células Med; Carril 5: 100 ng de ADN aislado a partir de CD19 + / CD34 - CD45 / células de alta. ADN se sometió a ultrasonidos utilizando el Bioruptor Diagenode en alta para un total de 9 min (30 seg ON; 30 seg OFF). ADN fue purificado en columna y se visualizaron en un gel de agarosa 1% con SYBR verde gel de ácido nucleico mancha. B) Después de MIRA utilizando el ActivMotif MethylCollector Ultra kit, PCR con SLC25A37 (1-6) y CAp1 (7-12) se realiza para confirmar enriquecimiento de ADN metilado. 1 y 7: DNA genómico sonicated (no MIRA), 2 y 8: MIRA-CD19 + / CD34 + DNA, 3 y 9: MIRA-CD19 + / CD34 - DNA / CD45 bajo, 4 y 10: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 med ADN; 5 & 11: MIRA -CD19 + / CD34 - / CD45 ADN de alto, 6 y 12: El control del agua. Mayor amplificación de SLC25A37 confirma el enriquecimiento de ADN metiladoen los subconjuntos de células B precursoras.
Discussion
El factor con mayor impacto en el éxito del protocolo es la presencia de contaminación de los desechos. Si se solicita la sangre de un banco de sangre del cordón umbilical es importante tener la sangre enviada tan pronto después de la recogida como sea posible. Además, las muestras que se clasifican como linfocitosis contienen un mayor número de linfocitos, sin embargo, estas muestras no tienen un número suficiente de células B precursoras y no debe ser utilizado. Para aumentar la probabilidad de obtener un número suficiente de células para cada uno de los subconjuntos de precursores Recomendamos comenzar con al menos 85 ml de sangre del cordón umbilical.
Es importante señalar que a diferencia de las separaciones de sangre periférica de adultos, cuando fraccionamiento de la sangre del cordón umbilical de la capa mononuclear menudo está contaminada con células rojas de la sangre 12. Este protocolo incluye una etapa de lavado adicional para eliminar las plaquetas contaminantes. Protocolos que describen las separaciones mononucleares de sangre de cordón sugiere incluir una etapa de lisis to eliminar los glóbulos rojos no deseados. No recomendamos este paso, ya que produce residuos contaminantes y tiene un impacto negativo en el éxito de la especie celular.
Con el fin de reducir el número de células que tienen que ser distinguidos por citometría de flujo es necesario para llevar a cabo un enriquecimiento de células B antes de la clasificación de células. El protocolo proporcionado por Miltenyi Biotec, que acompaña el kit de aislamiento de células B (B-CLL), ha sido optimizado para la sangre periférica y recomienda el uso de 10 l B-CLL cóctel de anticuerpos biotina por 10 millones de células. Este paso utiliza anticuerpos contra CD2 (células T, células NK), células CD4 (células T), CD11b (granulocitos monocitos;; macrófagos), CD16 (células NK; macrófagos, mastocitos), CD36 (plaquetas), CD235a (células eritroides) para agotar las células no-B de la sangre del cordón umbilical. Es importante usar el kit descrito y no el de células B kit de aislamiento II debido a que el kit anterior contiene un anticuerpo contra CD43 que está presente en células pro-B. Durante nuestra optimización de este protocolo, se encontró que un total de 40 l de B-CLL cóctel de anticuerpos con biotina es suficiente para producir un resultado positivo tipo celular. Además se encontró que el uso de tan poco como 5 l más del cóctel de anticuerpos B-CLL biotina tuvieron efectos adversos en el tipo celular. Por lo tanto, es muy recomendable con 40 l de B-CLL cóctel de anticuerpos con biotina para el total de número de células mononucleares de entre 175-250 million. Si se comienza con números menores o mayores de las células puede ser necesario para escalar los reactivos en consecuencia.
Hay numerosas publicaciones que describen las conflictivas marcadores que pueden ser utilizados para distinguir subpoblaciones de células B. La mayor parte de la discrepancia puede ser explicada por el hecho de que la diferenciación es un proceso continuo y que la presencia o ausencia de marcadores de superficie celular se produce de manera gradual en lugar de en forma de todo o nada. En este protocolo CD34 - / CD19 + y el nivel de intensidad de CD45 + (expresión bajo, medio, alto) fue utilizada para distinguir pre-BI, pre-BII e inmadura de células B con un aumento en el nivel de CD45 expresión correspondiente a la progresión de la diferenciación 6. Pro-células B han sido descritos por algunos como CD19 + / CD34 + 13 mientras que otros han demostrado que células pro-B son CD19 - / CD34 + y pre-BI células son CD19 + / CD34 + 9,10. Sobre la base de estas discrepancias se han designado las CD19 + / CD34 + células como fines pro-células B / principios de células pre-BI. Es importante señalar que esta estrategia se desarrolló para aislar los subconjuntos de precursor de células B que corresponden a las células afectadas por la enfermedad de la leucemia linfoblástica aguda. Sin embargo, existen múltiples estrategias de clasificación que se pueden emplear dependiendo del subtipo de células de interés.
Anticuerpo-fluorocromo combinaciones deben ser seleccionados en base a las capacidades del clasificador de células disponibles. Como génerosl norma, la más brillante de fluorocromo en su panel debe utilizarse para marcar el antígeno menos poblado y viceversa. En la detección de doble manchadas de población, especialmente a los eventos raros como estos, la discriminación doblete (Figura 2B) es una parte muy importante de la estrategia de activación periódica. Esto garantiza que los eventos doble positivas son células verdaderamente individuales teñidas con los anticuerpos y no simplemente dos de una sola manchadas células adheridas entre sí.
De alta velocidad, 4-way clasificación de células necesariamente crea un entorno controlado aerosol. Por lo tanto, la clasificación de células vivas humano debe realizarse con sumo cuidado. Publicado pautas de seguridad y descontaminación están disponibles y deben ser revisados y aplicados antes de la clase 14. La aprobación de los Comités Institucionales de Bioseguridad o sus equivalentes puede ser requerido antes de la clasificación. Para la descontaminación adecuada después de la clasificación, la lejía debe añadirse al recipiente de desechos a una concentración final de 10%. Similarly, todos los tubos de muestras, así como todas las superficies en el área inmediata debe ser completamente descontaminado con una solución de lejía recién preparada 10%.
En resumen, este protocolo proporciona una estrategia para la obtención de poblaciones raras de precursor de células B y puede ser modificado para aislar una población rara presente en la sangre del cordón incluyendo células madre hematopoyéticas y células T inmaduras. Recientemente, las células B inmaduras se han identificado en la sangre periférica de individuos con VIH avanzado 15. Por lo tanto, la utilidad de este método se extiende más allá del estudio de cánceres de la sangre. Por último, no se han realizado todavía aislamientos de ARN en las células de flujo según, sin embargo, este método debe ser adaptable con la salvedad de que durante la clasificación celular las células se deben ordenar directamente en trizol o un equivalente de solución de ARN compatible tal como RLT del kit RNeasy disponible a través de Qiagen.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (Instituto Nacional del Cáncer R00 CA132784) a KT
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| LS Column | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Multi Stand | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| B-Cell Isolation Kit (B CLL) | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-660 | |
| Fetal Bovine Serum | ATLANTA Biologicals | S11195 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | MIDSCI | SS1500 | |
| BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559763 | |
| DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19 | BD Biosciences | 555415 | |
| DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences | 560941 | |
| CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352058 | |
| BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| PuraFlow Sheath Fluid, 8X | Beckman Coulter | CY30230 | |
| FlowCheck Alignment beads | Beckman Coulter | 6605359 | |
| Ultra Rainbow Alignment beads | Spherotech | URFP-30-2 | |
| ViroSafe Aerosol Evacuation Filter | Beckman Coulter | ML01330 | |
| ABC Mouse bead kit | Invitrogen | A-10344 | |
| 40 μm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Fisher Scientific Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Microscope | |||
| accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-516 | |
| MoFlo XDP flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| Aerosol Evacuation Unit | Beckman Coulter |
References
- Song, F., et al. Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression. PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).
- Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells. Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).
- Brown, G., et al. The sequential determination model of hematopoiesis. Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).
- Clark, P., et al. Lymphocyte subsets in normal bone marrow. Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).
- Loken, M. R., et al. Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development. Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).
- Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. B-cell precursors in normal pediatric bone marrow. American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).
- Tucci, A., et al. Are cord blood B cells functionally mature? Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).
- Ghia, P., et al. Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci. J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).
- Noordzij, J. G., et al. Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children. Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).
- van Zelm, M. C., et al. Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression. J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).
- Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. The MIRA method for DNA methylation analysis. Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).
- Kanof, E. M., et al. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Suppl 19. 7.1.1-7.1.7 (1996).
- LeBien, T. W.
- Schmid, I., et al. International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells. Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).
- Malaspina, A., et al. Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7. PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).
