Summary
نحن هنا وصف بروتوكول للعزل مجموعات فرعية من الخلايا B-السلائف من دم الحبل السري. يمكن استخراجها كمية كافية ونوعية الأحماض النووية من الخلايا المستخدمة في المقايسات واللاحقة الاستفادة من DNA أو RNA.
Abstract
والتخصيب دم الحبل السري عن خلايا المكونة للدم السلف في مختلف مراحل التزام النسب. قمنا بتطوير بروتوكول للعزل خلايا B-السلائف في أربع مراحل مختلفة من التمايز. لأن يتم التعبير عن الجينات وتحدث تعديلات جينية على نحو الأنسجة محددة، فمن الأهمية بمكان التمييز بين الأنسجة وأنواع الخلايا من أجل أن تكون قادرة على تحديد التغيرات في الجينوم وepigenome التي قد تؤدي إلى تطوير المرض. ويمكن تكييف هذه الطريقة إلى أي نوع من الخلايا في الوقت الحاضر دم الحبل السري في أي مرحلة من التمايز.
هذه الطريقة تشمل 4 خطوات رئيسية. أولا، يتم فصل الخلايا بواسطة الطرد المركزي وحيدات النوى الكثافة. الثانية، هي المخصب B-الخلايا باستخدام الأجسام المضادة مترافق البيوتين التي تعترف وإزالة الخلايا غير B-من الخلايا وحيدات النوى. وfluorescently المسمى الثالث خلايا B مع الأجسام المضادة الخلايا بروتين السطح النوعي لمراحل الفرديةمن B-الخلية التنمية. وأخيرا، يتم فرز الخلايا fluorescently المسمى ويتم استرداد السكان الفردية. الخلايا هي تعافى من كمية ونوعية كافية لاستخدامها في فحوصات الحمض النووي المصب.
Introduction
من أجل تحديد الانحرافات التي تكون موجودة في مرض، فمن الأهمية بمكان أن نستخدم خلايا الأنسجة السليمة أو التي تتوافق مع نوع الأنسجة أو الخلايا المتضررة من هذا المرض. وأحد أسباب ذلك هو أن الاختلاف بين أنواع الأنسجة جينية مسؤولة عن تنظيم التعبير الجيني وأمر حاسم بالنسبة لتمايز الخلايا العادية خلال 1،2 التنمية البشرية. والسبب الثاني هو أن الأنسجة الشاذة تنظيم جين معين قد يكون له عواقب وخيمة على التطور الطبيعي وكما هو معروف للمساهمة في العديد من الحالات المرضية بما فيها السرطان. لذلك، فهم أفضل للمرض الذي ينطوي على الخلايا المكونة للدم يتطلب معرفة الخلايا المكونة للدم صحية.
تطوير الخلايا المكونة للدم في نخاع العظم من خلال عائدات أمر منهجي للأحداث التي تتميز التغييرات في التعبير عن وضع العلامات سطح الخلية 3. الدراسات التي تنطوي على المشاركين الكبار لهاتبين أن نخاع العظام يحتوي عادة على عدد قليل من خلايا السلائف B-4،5، في حين دراسة شملت الأطفال المشاركين أظهرت أن نسبة السلائف الخلايا B-مرتفعة نسبيا في الأفراد أقل من 5 سنوات من العمر 6. يتم استخدام دم الحبل السري كمصدر للخلايا الجذعية المكونة للدم في علاج اضطرابات الدم والأورام الخبيثة ذات الصلة، في متناول الجميع عن طريق البنوك دم الحبل السري وغير المخصب لخلايا غير ناضجة وB T 7 التي هي الخلايا المستهدفة من اضطرابات متعددة بما في ذلك سرطان الدم و اللمفومات.
تم السلائف الخلايا B-في نخاع العظام phenotyped على نطاق واسع و8،9 يمكن تعريف عن وجود علامات محددة سطح الخلية التي يمكن استخدامها لفرز هذه الخلايا إلى مجموعات فرعية متميزة. حصيلة طبيعية تمايز الخلايا B-من خلال سلسلة من المراحل في نخاع العظام بدءا من الخلايا الموالية أقرب-B وبلغت ذروتها في غير ناضجة أو السذاجة خلايا B. وفقالZelm فان وزملاؤه 10، وتتميز الخلايا الموالية-B من خلال وجود CD34 والانتقال إلى المرحلة 2 (ما قبل BI) ويتم الحصول CD19. المرحلة 3 (ما قبل BII) الخلايا لم تعد صريح CD34 وتبدأ في التعبير عن الغلوبولين المناعي حشوية. وأخيرا، السمة المميزة للمرحلة 4 (غير ناضجة الخلايا البائية) هو تعبير عن الغلوبولين المناعي السطحية. وكان أول وصف الاستراتيجية الفرز المبينة في هذا البروتوكول من قبل كالدويل وزملاؤه 6 و يشمل استخدام سوى 3 علامات سطح الخلية مما يقلل كثيرا من تعقيد وتكلفة إجراء التجارب الفرز الخلية. في عملهم، وقد تم تأسيسها وجود علاقة بين CD45 ومراحل تمايز الخلايا B-. ولاحظ الباحثون أن الخلايا B-في نخاع العظم عرض مستويات متفاوتة من التعبير عن CD45. تقابل تلك التي أعربت عن المستوى المتوسط من CD45 على وجه التحديد، والخلايا التي عبرت عن مستويات عالية من CD45 تتوافق مع الخلايا التي أعرب الغلوبولين المناعي السطحية (غير ناضجة الخلايا البائية)، إلى الخلايا التي أعرب cytoplتقابل asmic الغلوبولين المناعي (الخلايا ما قبل BII)، وتلك التي أعرب انخفاض مستويات CD45 إلى الخلايا التي لم يبد الغلوبولين المناعي حشوية (BI قبل الخلايا). هذا البروتوكول يستخدم استراتيجية التي وضعتها كالدويل وزملاؤه 6 إلى عزل مجموعات فرعية من الخلايا B-السلائف من دم الحبل السري (الشكل 1) والتي يمكن استخدامها في فحوصات عالية المصب تتطلب نوعية الأحماض النووية مثل مقايسة الجزيرة الانتعاش ميثليته-الدليل السياسي الشامل (MIRA ) 11 والكمية في الوقت الحقيقي PCR المقايسات. الأسلوب يعمل على فصل الأولية باستخدام الخرز المغناطيسي في استنزاف كل الخلايا غير B من دم الحبل السري، ويتطلب سوى 3 تلطيخ مع الأجسام المضادة (CD34، CD19 CD45 و). الخلايا التي يتم استردادها يمثل 4 مراحل تمايز الخلايا B-: 1) CD34 +؛ CD19 + (الراحل) الموالية-B وأوائل قبل BI؛ 2) CD34 -؛ CD19 +؛ CD45 منخفضة (أواخر ما قبل BI)؛ 3) CD34 -؛ CD19 +؛ CD45 ميد (قبل BII)؛ و 4) CD34 -؛ CD19 +؛ CD45 عالية (غير ناضجة الخلايا B-).
Protocol
1. عزل خلايا وحيدات النوى من دم الحبل السري
- إعداد EDTA-PBS العازلة، إضافة 5 مل مصل الألبومين البقري محلول (BSA) لمل العازلة الشطف 95 (1:20 التخفيف). ديغا المخزن المؤقت والحفاظ على الجليد المخزن المؤقت IMPORTANT: عدم ديغا المخزن المؤقت قد يؤدي في أقل من النتائج المثلى عندما عزل CD19 + خلايا B-لأن فقاعات قد تمنع العمود العزلة.
- تجهيز 50 مل المخروطية أنابيب الطرد المركزي لالتدرج الكثافة. تحديد عدد الأنابيب اللازمة لمعالجة دم الحبل السري (1 أنبوب يمكن عملية 8 ملليتر دم) وإضافة 15 مل من Ficoll-PLUS Paque لكل أنبوب.
- تمييع 8 مل من دم الحبل السري مع DPBS مل 24 (1X) وطبقة بعناية دم الحبل السري المخفف الخليط على أعلى PLUS Ficoll-Paque في كل من أنابيب مخروطية 50 مل. لا تخلط الدم وPLUS Ficoll-Paque IMPORTANT: لتجنب اختلاط دم الحبل السري وPLUS Ficoll-Paque، أمسك أنبوب بزاوية 45 درجة وطبقة الخليط الدم ببطء.
- أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة 20 º والخلايا وحيدات النوى (MNC) لا تزال في البلازما Ficoll-PLUS Paque اجهة حين المحببة والرواسب الكريات الحمراء بسبب ارتفاع الكثافة في الضغط التناضحي من Ficoll-PLUS Paque. التسمية 7 5 مل جولة القاع أنابيب لاستخدامها في الجزء 3 مع التاريخ عينة، ID وما يلي:
| أنبوب | ملصق | غرض |
| 1 | طاهر | غير ملوثين الخلايا للتطبيع خلال التدفق الخلوي |
| 2 | 7AAD | لتحديد الجدوى خلال التدفق الخلوي |
| 3 | + + + | يحتوي على الخلايا التي ستحفظ |
| 4 | 34 + | لجمع CD34 + / CD19 +(أواخر الموالية-B - في وقت مبكر قبل BI) الخلايا |
| 5 | منخفض 45 | لجمع CD34 - / + CD19 / CD45 منخفضة (ما قبل BI) الخلايا |
| 6 | 45 ميد | لجمع CD34 - / + CD19 / CD45 ميد (قبل BII) الخلايا |
| 7 | عالية 45 | لجمع CD34 - / + CD19 / CD45 عالية (غير ناضجة B) الخلايا |
معطف أنابيب 4 و 5 و 6 و 7 مع FBS 2٪ وإخضاع جميع الأنابيب على الجليد.
- نضح طبقة البلازما العلوي بعناية وتجنب الاتصال مع طبقة الخلايا وحيدات النوى. باستخدام ماصة الزجاج 10 مل، نقل بعناية طبقة الخلايا وحيدات النوى إلى أنبوب مخروطي جديدة 50 مل. الجمع بين الخلايا وحيدات النوى من ثلاثة أنابيب معا في أنبوب واحد 50 مل.
- ملء الأنبوب مع PBS، مزيج بلطف وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في20 ° C. نضح بعناية طاف دون الإخلال بيليه الخلية. كرر 1X. بعد غسل الأولى، إعادة تعليق الكريات ونقل إلى أنبوب 50 مل المخروطية واحد.
- إعادة تعليق بيليه الخلية بلطف في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. إزالة 1 ميكرولتر من التعليق الخلية، إضافة إلى 1 مل من برنامج تلفزيوني في أنبوب مل 1.5 و ميكروسنتريفوج جانبا لحساب (عد الخلايا بعد وضع الخلية 50 مل معلق في أجهزة الطرد المركزي). ملء الأنبوب مع PBS وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 15 دقيقة لإزالة الصفائح الدموية. إزالة طاف تماما من دون إزعاج بيليه الخلية.
2. تعديل B-زنزانة انفرادية من خلايا وحيدات النوى التي تستخدم أجهزة ماكينتوش الفصل
- إعادة تعليق بيليه من الخطوة 1.7 مع 160 ميكرولتر الباردة (4 ° C) EDTA-PBS العازلة.
- اضافة 40 ميكرولتر الأجسام المضادة البيوتين B-CLL كوكتيل. ماصة لتخلط جيدا واحتضان لمدة 10 دقيقة في C. ° 4
- غسل الخلايا - إضافة 1 مل الباردة (4 ° C) EDTA-PBS العازلة بنسبة 10 مليون خلية (خلية نوmber تحديدها في الخطوة 1.7) وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. نضح طاف تماما ثم إعادة تعليق بيليه الخلية في 320 ميكرولتر الباردة (4 ° C) EDTA-PBS العازلة.
- إضافة 80 ميكرولتر مكافحة البيوتين MicroBeads، تخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في C. ° 4
- غسل الخلايا - إضافة 1 مل الباردة (4 ° C) EDTA-PBS العازلة بنسبة 10 مليون خلية وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. إعادة تعليق ما يصل إلى 100 مليون خلية في 500 ميكرولتر من البرد (4 ° C) EDTA-PBS العازلة. مقياس حجم المخزن المؤقت وفقا لعدد الخلايا.
- إعداد MACS الأعمدة وفواصل MACS خلال الطرد المركزي (الخطوة 2.5). وضع عمود LS في المجال المغناطيسي للفاصل MACS أضف 3 مل من البرد (4 ° C) EDTA-PBS عازلة على العمود والسماح المخزن المؤقت لبالتنقيط من خلال العمود. استخدام وعاء للقبض على التدفق من خلال. تجاهل التدفق من خلال.
- وضع أنبوب 50 مل المخروطية أسفل عمود وماصة للتعليق على خلية العمود. السماح للخلايا الخالي من الملصقات لمارا بالتنقيطح العمود وفي أنبوب 50 مل المخروطية. IMPORTANT: هذه هي الخلايا التي سيتم استخدامها لوضع العلامات والفرز الأجسام المضادة الخلايا. لا تجاهل التدفق من خلال. لاسترداد كافة الخلايا من الخطوة 2.5، إضافة إضافية 1 مل من البرد (4 ° C) EDTA-PBS عازلة على جدران الأنبوب المخروطية. المزيج بلطف وماصة للتعليق الخلية المتبقية على العمود. كرر 1X. انتقل إلى الخطوة 2.8 باستخدام خلايا غير المسماة التي تم جمعها في أنبوب مخروطي بعد يمر من خلال العمود.
- ملء الأنبوب المخروطية التي تحتوي على خلايا غير المسماة مع PBS الطرد المركزي في 300 وXG لمدة 10 دقيقة. إزالة بعناية طاف دون الإخلال بيليه الخلية. أضف 200 ميكرولتر من EDTA-PBS و resuspend العازلة بلطف الخلايا.
3. وصفها إعداد الأجسام المضادة والفرز الخلية
- نضح 1 ميكرولتر من التعليق الخلية ومكان في أنبوب المسمى "غير ملوثين" (الخطوة 1.4). إضافة 500 ميكرولتر العازلة EDTA-PBS وتخزين أنبوب على الجليد.
- إضافة 20ميكرولتر من كل الأجسام المضادة (CD19، CD34 CD45 و) لكل مليون خلايا في خلية التعليق المتبقية. تخلط جيدا ووضع أنبوب في الظلام لمدة 30 دقيقة في RT. الأجسام المضادة CD خفيفة حساسة، أكمل الخطوات 2-4 مع أضواء إيقاف.
- بعد 30 دقيقة من الحضانة مع الأجسام المضادة، نضح 40 ميكرولتر من التعليق الخلية ووضعه في أنبوب يسمى "7AAD". إضافة 1 مل PBS في أنبوب الطرد المركزي في 500 وx ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف و resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من العازلة ملزمة. إضافة 7 ميكرولتر من 7AAD (7-D Aminoactinomycin) واحتضان في الظلام لمدة 10 دقيقة في RT. خلال الخطوة دقيقة كاملة الحضانة 10 3.4.
- إضافة PBS إلى الأعلى من الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا المتبقية التي تحمل الأجسام المضادة CD. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب في 500 x ج لمدة 3 دقائق. إزالة طاف، إضافة 500 ميكرولتر العازلة EDTA-PBS و resuspend بيليه الخلية. نقل وحدة التخزين بالكامل لتعليق الخلية في أنبوب يسمى "+ + +". لاسترداد جميع لتعليق خليةي ي إضافي 1 مل EDTA-PBS عازلة للأنبوب 50 مل المخروطية ونقل في أنبوب يسمى "+ + +".
- بعد مرور فترة الحضانة (الخطوة 3.3)، إضافة 300 ميكرولتر العازلة ملزمة في أنبوب 7AAD. و"غير ملوثين"، "7AAD" و "+ + +". عينات و "34 +"، "45 منخفضة"، "ميد 45" و"45 عالية" مستعدون للأنابيب التدفق الخلوي
4. فرز الخلايا باستخدام تدفق عداد الكريات XDP MoFlo
- انشاء MoFlo للفرز: محاذاة الليزر؛ استقرار تيار الحبرية، وتحديد تأخير الهبوط.
- إعداد الضوابط واحدة تعويض اللون باستخدام الماوس إينفيتروجن ABC حبة مجموعة (أو ما شابه) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تشغيل عناصر تحكم لون واحد، وتعديل الفولتية من القنوات مضان لفصل الأمثل للسكان الإيجابية والسلبية. تعيين معاملات التعويض وتطبيق بروتوكول لتعويض المعلمة المجموعة. إعادة تأسيس معاملات التعويض في كل مرة يتم الحصول على الكثير من الأجسام المضادة الجديدة.
- إنشاء بروتوكول المؤامرات بما في ذلك كما هو مبين في الشكل 2.
- تشغيل العينة غير ملوثين، على الجهد وكسب مبعثر إلى الأمام والجانب، وتحديد السكان مضان السلبية. لأن الانتعاش DNA هو الهدف من هذا القبيل، يجب تعيين عتبة منخفضة (1٪ ≤) بحيث DNA التي تحتوي على الحطام لا تلوث عينات استردادها. * تأكد من أن النظام يعمل الهباء الإخلاء في جميع الأوقات التي تعيش يتم تشغيل الخلايا البشرية على MoFlo.
- تشغيل قسامة صغيرة من العينة + + + (50000 الأحداث ~) لضبط استراتيجية النابضة (الشكل 2). لأن الخلايا B-الأسلاف لا مبعثر مماثل إلى أن تنضج الخلايا B-، وbackgate CD19 + ungated / CD34 + السكان على المؤامرة ضد SSC FSC لضمان البوابة اللمفاويات يشمل المحتملة برو-B الخلايا. من هذه العينة أيضا تعيين السكان السلبية لمضان 7AAD.
- تشغيل العينة لتحديد الجدوى 7AAD العينة. خلايا النوع فقط من عينة مع بقاء عالية فيومنذ البداية (≥ 95٪) والخلايا الميتة وصمة عار وبشكل عشوائي قد تلوث السكان الفرز.
- إعداد القرارات نوع لجمع 4 السكان: CD19 + / CD34 +؛ CD19 + / CD34 - / CD45 منخفضة؛ CD19 + / CD34 - / CD45 ميد، وCD19 + / CD34 - / CD45 عالية. وتشمل الخلايا اللمفاوية وبوابات التمييز في القرارات صدرة نوع من جميع السكان.
- لمنع قباقيب في الطرف الفرز والتصفية + + + عينة من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر مباشرة قبل الفرز وإعادة فلترة إن وجدت التجميع يحدث في العينة أثناء الفرز.
- فرز الخلايا في أنابيب جمع (الخطوة 1.4) المغلفة مع FBS 2٪ في برنامج تلفزيوني في حامل أنبوب تبريد أو الجليد معبأة.
- مباشرة بعد اكتمال الفرز، استخراج DNA.
Representative Results
بين عينة الاختلاف يلعب دورا في نجاح هذا النوع الخلية (الجدول 1). العينات مع معدلات نجاح جيدة لديهم مستويات منخفضة من الحطام تلويث (الشكل 3A) والعينات مع معدلات النجاح الفقراء لديهم مستويات عالية من تلوث الحطام (الشكل 3B). يمكن أن الاختلاف بين عينة تسيطر إلى حد ما إذا تم جمع العينة دم الحبل السري في غضون 24 ساعة من الشحن (O / N الأولوية الأولى).
وتدفق الخلايا مصنفة من كل مجموعة فرعية B-الخلية هي السلائف من كمية ونوعية كافية لأداء العزلة الحمض النووي. الحمض النووي معزولة هي ذات جودة عالية، ويمكن استخدامها في التحليلات المصب. نحن نستخدم بشكل روتيني في هذا DNA MIRA 11 إلى إثراء للDNA ميثليته (الشكل 4).
| بيانات دم الحبل السري مرفق | الفقراء ترتيب | |
| العمل مع حجم الدم تخثر (ML) | 110 | 104 |
| خلايا الدم البيضاء [10 3 / ملمتر] | 8.68 | 11،19 |
| الخلايا الليمفاوية [10 3 / ملمتر] | 3.88 | 3.76 |
| اللمفاويات (٪) | 44،70 | 33،6 |
| خلايا الدم الحمراء [10 6 / ميكرولتر] | 3.65 | 3.05 |
| في المنزل البيانات | ||
| عدد الخلايا بعد Ficoll-Paque | 206 M | 309 M |
| عدد الخلايا بعد الانفصال MACS | 22 م | 16.5 متر |
| إجمالي عدد الأحداث (MoFlo XDP) | 30،57 M | 19،97 M |
| الجدوى (٪) | 98،00 | 98،00 |
| الخلايا الليمفاوية في بوابة (٪) 17،00 | 50،00 | |
| CD19 + / CD34 + | ||
| إجمالي عدد الخليوي | 10959 | 48316 |
| ٪ إجمالي الأحداث | 0.04 | 0.24 |
| كفاءة | 88٪ | 88٪ |
| CD19 + / CD34 - / CD45 منخفضة | ||
| إجمالي عدد الخليوي | 16619 | 26941 |
| ٪ إجمالي الأحداث | 0.05 | 0.13 |
| كفاءة | 89٪ | 87٪ |
| CD19 + / CD34 - / CD45 ميد | ||
| إجمالي عدد الخليوي | 469745 | 507540 |
| ٪ إجمالي الأحداث | 1.54 | 2.54 |
| كفاءة | 89٪ | 89٪ |
| CD19 + / CD34 - / CD45 عالية | ||
| إجمالي عدد الخليوي | 1896062 | 2047142 |
| ٪ إجمالي الأحداث | 6.2 | 10،25 |
| كفاءة | 91٪ | 90٪ |
الجدول 1. ممثل إحصاءات النوع الخلية. الصفوف 1-5 هي التهم التي يقدمها مرفق الحبل الدم. الصفوف المتبقية هي البيانات التي تم جمعها في مختبرنا. الواردة من النوع الفقراء مستويات عالية من الحطام ونسبة منخفضة من الخلايا في البوابة اللمفاويات.
فيقوإعادة 1. تتم معالجة الرسم البياني الداخلي. ودم الحبل السري والخلايا وحيدات النوى معزولة باستخدام Ficoll-paque زائد. يتم تضمين خطوة غسيل إضافية لإزالة الصفائح الدموية تلويث. يتم عزل الخلايا البائية من خلايا وحيدات النوى باستخدام عدة MACS الإنسان العزلة B خلايا (B-CLL). هذه الخطوة يستخدم البيوتين، مترافق الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (CD2، CD4، CD11b، CD36، نظام مضاد للIgE وCD235a) لإزالة جميع الخلايا غير B. وصفت واسترداد خلايا B-APC-CD19 مع، PE-CD34 CD45 والأجسام المضادة، ثم تم الفرز FITC باستخدام تدفق عداد الكريات XDP MoFlo لاسترداد السلائف الخلية B-مجموعات فرعية: CD19 + / CD34 +؛ CD19 + / CD34 - / CD45 منخفضة ؛ CD19 + / CD34 - / CD45 ميد، وCD19 + / CD34 - / CD45 عالية.
الشكل 2. استراتيجية النابضة لتحديد وفرز البوبulations. الأسهم الحمراء تشير إلى البوابة التي يتم تطبيقها على المؤامرة اللاحقة. R4، R5، R6 R7 وبوابات تشير السكان فرزها. أ) إلى الأمام مقابل الجانب مؤامرة مبعثر يظهر المخصب السكان اللمفاويات. R1، بوابة اللمفاويات. ب) الارتفاع مقابل عرض مؤامرة مبعثر إلى الأمام لتحديد خلايا مفردة مقابل الحلل. R2، بوابة خلية واحدة. ج) CD19-APC إيجابية الخلايا تقع في السكان CD34-PE السلبية والإيجابية. R3، CD19 + / CD34 - بوابة؛ R4، CD19 + / CD34 + بوابة تشير إلى سكان الفرز المطلوب د) CD19 + / CD34 - الخلايا تنقسم إلى ثلاث CD45-FITC السكان متميزة إلى حد ما. وR5 R6، CD19 + / CD34 - / CD45 CD19 + منخفضة و/ CD34 - / CD45 السكان ميد، على التوالي. R7، وذلك بسبب ارتفاع أعداد الخلايا في CD19 + / CD34 - / CD45 السكانية العالية، وهذا النوع يشمل فقط بوابةجزء من السكان. جميع خلايا هذه الفئة من السكان لا تحتاج إلى أن تجمع لتحاليل المصب.
الشكل 3 أ) انخفاض مستويات تلوث الحطام بعد تخصيب العمود. R1، بوابة اللمفاويات. ب) مستويات عالية من تلوث الحطام بعد تخصيب العمود.
الشكل 4. إثراء DNA ميثليته من مجموعات فرعية من الخلايا B-السلائف أ DNA) Sonicated معزولة عن مجموعات فرعية B-الخلية السلائف هي ذات جودة عالية. لDNA بناء المكتبة sonicated إلى ما متوسطه 200-600 سنة مضت. حارة 1: Promega سلم BP 100 (كتالوج # G2101)؛ لين 2: DNA إجمالي معزولة عن CD19 + / CD34 + الخلايا؛ لين 3: DNA إجمالي معزولة عن CD19 + - / CD45 الخلايا منخفضة؛ لين 4: 100 نانوغرام DNA معزولة عن CD19 + / CD34 - / CD45 الخلايا المتوسطية؛ لين 5: 100 نانوغرام DNA معزولة عن CD19 + / CD34 - / CD45 الخلايا عالية. وsonicated DNA باستخدام Bioruptor Diagenode على ارتفاع ليصبح المجموع 9 دقائق (30 ثانية على؛ 30 ثانية OFF). يتم تنفيذ DNA كان العمود تنقية وتصور على هلام الاغاروز 1٪ مع SYBR الأخضر هلام الحمض النووي وصمة عار. ب) بعد MIRA باستخدام ActivMotif MethylCollector الترا عدة، PCR مع SLC25A37 (1-6) وAPC1 (7-12) لتأكيد إثراء DNA ميثليته. 1 & 7: Sonicated الحمض النووي الجيني (لا MIRA)، 2 و 8: MIRA-CD19 + / CD34 + DNA؛ 3 و 9: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 DNA منخفضة؛ 4 و 10: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 ميد DNA و 5 و 11: MIRA -CD19 + / CD34 - / CD45 DNA عالية؛ 6 و 12: التحكم في المياه. أعلى التضخيم من SLC25A37 يؤكد تخصيب DNA ميثليتهفي مجموعات فرعية من الخلايا B-السلائف.
Discussion
العامل الذي له أكبر الأثر على نجاح البروتوكول هو وجود تلوث الحطام. إذا طلب الدم من الحبل بنك الدم فمن المهم أن يكون الدم شحنها في أقرب وقت ممكن بعد جمع. وبالإضافة إلى ذلك، والعينات التي تصنف على أنها تحتوي على كثرة اللمفاويات أعداد أكبر من الخلايا الليمفاوية، ولكن هذه العينات لم يكن لديك عدد كاف من خلايا B-السلائف ويجب عدم استخدامها. لزيادة احتمال الحصول أعداد كافية من الخلايا لكل من مجموعات فرعية السلائف نوصي بدءا لا يقل عن 85 مل من دم الحبل السري.
من المهم أن نلاحظ أنه على عكس الكبار فصل الدم المحيطي، عندما تجزئة دم الحبل السري وغالبا ما تكون ملوثة وحيدات النوى مع طبقة خلايا الدم الحمراء 12. هذا البروتوكول يتضمن خطوة إضافية لإزالة غسيل الصفائح الدموية تلويث. البروتوكولات التي تصف فصل النوى من دم الحبل السري تشير بما في ذلك تحلل ر خطوةس إزالة الخلايا الحمراء غير المرغوب فيها. لا نوصي بهذه الخطوة لأنها تنتج الحطام وتلويث له تأثير سلبي على نجاح هذا النوع الخلية.
من أجل الحد من عدد الخلايا التي يجب أن تتميز التدفق الخلوي من الضروري إجراء تخصيب الخلية B-قبل الفرز الخلية. وقد تم تحسين البروتوكول التي تقدمها بيوتيك Miltenyi، الذي يصاحب كيت عزل الخلايا B-(B-CLL)، لالدموية المحيطية وتوصي باستخدام الأجسام المضادة البيوتين 10 ميكرولتر B-CLL كوكتيل بنسبة 10 مليون خلية. هذه الخطوة يستخدم الأجسام المضادة ضد CD2 (خلايا T وخلايا NK)، CD4 (الخلايا T)، CD11b (المحببة؛ حيدات؛ الضامة)، CD16 (خلايا NK؛ الضامة؛ الخلايا البدينة)، CD36 (الصفائح الدموية)، CD235a (خلايا محمر) في استنزاف غير B الخلايا من دم الحبل السري. من المهم أن استخدام عدة وصف وليس B-II زنزانة انفرادية بسبب عدة عدة يحتوي على الأجسام المضادة السابق ضد CD43 التي هي موجودة على الخلايا الموالية-B. خلال المرجع لديناtimization من هذا البروتوكول، وجدنا أن ما مجموعه 40 ميكرولتر من الكوكتيل B-CLL الأجسام المضادة البيوتين كافية لإنتاج نوع الخلايا نتيجة إيجابية. وبالإضافة إلى ذلك وجدنا أن استخدام اقل من 5 ميكرولتر أكثر من الكوكتيل B-CLL الأجسام المضادة البيوتين لها آثار سلبية على نوع الخلية. ولذلك، فإننا نوصي بشدة باستخدام 40 ميكرولتر من الكوكتيل B-CLL الأجسام المضادة البيوتين لمجموع أعداد الخلايا وحيدات النوى بين 175-250،000،000. إذا بدءا بأعداد أقل أو أعلى من الخلايا قد يكون من الضروري لقياس الكواشف وفقا لذلك.
هناك العديد من المنشورات متضاربة تصف العلامات التي يمكن أن تستخدم لتمييز المجموعات الفرعية من السكان من الخلايا B-. ويمكن تفسير معظم التفاوت من خلال حقيقة أن التمايز هو عملية مستمرة وأن وجود أو عدم وجود علامات سطح الخلية يحدث بطريقة تدريجية في بدلا منها بطريقة الكل أو لا شيء. في هذا البروتوكول CD34 - / + CD19 ومستوى شدة CD45 + (وقد استخدم منخفضة، متوسطة التعبير، وارتفاع) لتمييز ما قبل BI، قبل BII وغير ناضجة الخلايا B-مع زيادة في مستوى CD45 التعبير الموافق تطور التمايز 6. وقد وصفت الموالية للخلايا B البعض أن CD19 + / CD34 + 13 في حين أن آخرين قد أظهرت أن الخلايا الموالية-B هي CD19 - / + CD34 وقبل BI الخلايا CD19 + / CD34 + 9،10. على أساس هذه التناقضات عينت نحن CD19 + / CD34 + الخلايا كخلايا الموالية-B المرحوم / أوائل الخلايا ما قبل BI. من المهم أن نلاحظ أن وضعت هذه الاستراتيجية لعزل مجموعات فرعية من الخلايا B-السلائف التي تتوافق مع الخلايا المتضررة من مرض سرطان الدم الليمفاوي الحاد. ومع ذلك، هناك عدة استراتيجيات الفرز التي يمكن استخدامها تبعا لنوع فرعي من الخلية الفائدة.
يجب أن يتم تحديد الأجسام المضادة ملون تألقي مجموعات على أساس قدرات فارز الخلية المتاحة. باعتبارها جنساوينبغي أن تستخدم ل القاعدة، ألمع ملون تألقي في لوحة لتسمية مستضد الأقل سكانا، والعكس بالعكس. في الكشف عن ضعف الملطخة السكان، وخاصة الأحداث النادرة مثل هذه، صدرة التمييز (الشكل 2B) هو جزء مهم من استراتيجية حيوية المعزولة. وهذا يضمن أن الأحداث الإيجابية انقر نقرا مزدوجا هي خلايا وحيدة حقا ملطخة كل الأجسام المضادة وليس مجرد اثنين واحد الملطخة الخلايا انضمت إلى بعضها البعض.
عالية السرعة، وطريقة الفرز 4-الخلية يخلق بالضرورة بيئة الهباء الجوي للرقابة. ولذلك، ينبغي أن يتم تنفيذ الحية الفرز الخلية البشرية بعناية كبيرة. نشرت السلامة وإزالة التلوث المبادئ التوجيهية متاحة وينبغي استعراض وتنفيذ هذا النوع قبل 14. قد تكون هناك حاجة موافقة من لجان السلامة الأحيائية المؤسسية أو ما يعادلها قبل الفرز. لإزالة التلوث المناسبة بعد الفرز، ينبغي إضافة التبييض إلى حاوية النفايات إلى تركيز النهائي من 10٪. SImilarly، ينبغي جميع أنابيب العينات وكذلك جميع الأسطح في المنطقة المجاورة تماما مع تطهير حل الطازجة التبييض 10٪.
وباختصار، يتيح هذا البروتوكول للحصول على استراتيجية السكان نادرة من السلائف الخلايا B-، ويمكن تعديله لعزل أية مجموعة من السكان نادرة موجودة في دم الحبل السري الخلايا الجذعية المكونة للدم بما في ذلك وغير ناضجة الخلايا التائية. مؤخرا، تم تحديد خلايا غير ناضجة B في الدم المحيطي من الأفراد مع فيروس نقص المناعة البشرية المتقدمة 15. ولذلك، فإن فائدة هذه الطريقة يمتد إلى أبعد من دراسة سرطان الدم. وأخيرا، فإننا لم نقم حتى الآن العزلة RNA على تدفق الخلايا مصنفة، ولكن هذا الأسلوب يجب أن تكون قابلة للتكيف مع التحذير من أن الخلية أثناء الفرز يجب أن يتم فرز الخلايا مباشرة في trizol أو حلا RNA مكافئ متوافق مثل RLT من عدة RNeasy من خلال QIAGEN.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NCI R00 CA132784) إلى KT
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| LS Column | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Multi Stand | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| B-Cell Isolation Kit (B CLL) | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-660 | |
| Fetal Bovine Serum | ATLANTA Biologicals | S11195 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | MIDSCI | SS1500 | |
| BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559763 | |
| DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19 | BD Biosciences | 555415 | |
| DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences | 560941 | |
| CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352058 | |
| BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| PuraFlow Sheath Fluid, 8X | Beckman Coulter | CY30230 | |
| FlowCheck Alignment beads | Beckman Coulter | 6605359 | |
| Ultra Rainbow Alignment beads | Spherotech | URFP-30-2 | |
| ViroSafe Aerosol Evacuation Filter | Beckman Coulter | ML01330 | |
| ABC Mouse bead kit | Invitrogen | A-10344 | |
| 40 μm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Fisher Scientific Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Microscope | |||
| accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-516 | |
| MoFlo XDP flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| Aerosol Evacuation Unit | Beckman Coulter |
References
- Song, F., et al. Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression. PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).
- Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells. Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).
- Brown, G., et al. The sequential determination model of hematopoiesis. Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).
- Clark, P., et al. Lymphocyte subsets in normal bone marrow. Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).
- Loken, M. R., et al. Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development. Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).
- Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. B-cell precursors in normal pediatric bone marrow. American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).
- Tucci, A., et al. Are cord blood B cells functionally mature? Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).
- Ghia, P., et al. Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci. J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).
- Noordzij, J. G., et al. Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children. Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).
- van Zelm, M. C., et al. Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression. J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).
- Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. The MIRA method for DNA methylation analysis. Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).
- Kanof, E. M., et al. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Suppl 19. 7.1.1-7.1.7 (1996).
- LeBien, T. W.
- Schmid, I., et al. International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells. Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).
- Malaspina, A., et al. Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7. PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).
