Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att isolera undergrupper av föregångare B-celler från navelsträngsblod. En tillräcklig mängd och kvalitet av nukleinsyror kan extraheras från cellerna och användes i efterföljande analyser som utnyttjar DNA eller RNA.
Abstract
Navelsträngsblod är starkt anrikat för hematopoetiska progenitorceller vid olika stadier lineage engagemang. Vi har utvecklat ett protokoll för isolering föregångare B-celler vid fyra olika stadier av differentiering. Eftersom gener uttrycks och epigenetiska förändringar inträffar i ett vävnadsspecifikt sätt, är det viktigt att skilja mellan vävnader och celltyper, för att kunna identifiera förändringar i genomet och epigenomet som kan leda till utveckling av sjukdomen. Denna metod kan anpassas till alla typer av celler som finns i navelsträngsblod vid något stadium av differentiering.
Denna metod innefattar 4 huvudsteg. Först, är mononukleära celler separerades genom densitetscentrifugering. Det andra, är B-celler anrikas med biotin konjugerade antikroppar som känner igen och avlägsna icke B-celler från de mononukleära cellerna. Tredje B-cellerna är fluorescensmärkta med cellytprotein antikroppar specifika för enskilda stegav B-cell-utveckling. Slutligen är de fluorescensmärkta cellerna sorteras och enskilda populationer utvinnes. De utvunna cellerna är av tillräcklig kvantitet och kvalitet för att användas i nedströms nukleinsyraanalyser.
Introduction
För att identifiera avvikelser som finns i sjukdom, är det mycket viktigt att vi använder friska vävnader eller celler som motsvarar vävnaden eller celltypen drabbats av sjukdomen. Ett skäl till detta är att epigenetisk variation bland vävnadstyper ansvarar för att reglera genexpression och är avgörande för cellulär differentiering under normal mänsklig utveckling 1,2. Ett andra skäl är att avvikande vävnadsspecifik genreglering kan få ödesdigra konsekvenser för normal utveckling och är känt för att bidra till en mängd sjukdomstillstånd inklusive cancer. Därför kräver en bättre förståelse av en sjukdom som involverar hematopoietiska celler kunskap om friska hematopoetiska celler.
Utvecklingen av hematopoietiska celler i benmärgen fortskrider genom en systematisk ordning av händelser som kännetecknas av förändringar i uttrycket av cellytmarkörer 3. Studier som omfattar vuxna deltagare harvisat att benmärg innehåller vanligtvis ett lågt antal föregångare B-celler 4,5, medan studier med pediatriska deltagare har visat att andelen föregångare B-celler är relativt hög hos personer mindre än 5 år 6. Navelsträngsblod används som en källa för hematopoietiska stamceller för behandling av blod sjukdomar och maligniteter, är lätt tillgänglig via banker navelsträngsblod och anrikas för omogen B-och T-celler 7 vilka är målcellerna för flera störningar inkluderande leukemi och lymfom.
Prekursor B-celler i benmärgen har omfattande phenotyped 8,9 och kan definieras genom närvaron av specifika cellytemarkörer som kan användas för att sortera dessa celler till distinkta undergrupper. Normala B-cell differentiering fortskrider genom en serie steg i benmärgen börjar med de tidigaste pro-B-celler och kulminerar i omogna eller naiva B-celler. EnligtVan ZELM och kollegor 10, är pro-B-celler kännetecknas av förekomsten av CD34 och i övergången till etapp 2 (Pre-BI) CD19 förvärvas. Steg 3 (Pre-BII) celler inte längre uttrycker CD34 och börja uttrycka cytoplasmisk IgM. Slutligen är ett kännetecken för steg 4 (omogen B-celler) uttrycket av yt-IgM. Den sortering som beskrivs i denna protokoll beskrevs först av Caldwell och kollegor 6 och inkluderar användningen av endast 3 cellytemarkörer som kraftigt reducerar komplexiteten och kostnaden för att utföra experiment cellsortering. I sitt arbete har en relation mellan CD45 och de olika stadierna i B-celldifferentiering etablerad. De observerade att B-celler i benmärgen uppvisar varierande nivåer av expression av CD45. Specifikt motsvarade celler som uttryckte höga nivåer av CD45 till celler som uttryckte yt-IgM (omogna B-celler), motsvarade de som uttryckte en mellanliggande nivå av CD45 till celler som uttryckte cytoplasmic IgM (före-BII-celler), och de som uttryckte låga nivåer av CD45 motsvarade celler som inte uttrycker cytoplasmatiskt IgM (före-BI celler). Detta protokoll använder den strategi som utvecklats av Caldwell och kollegor 6 för att isolera undergrupper av prekursor-B-celler från navelsträngsblod (figur 1), som kan användas i nedströms analyser kräver hög kvalitet syror nukleinsyror såsom metylerade CpG ö återvinning analys (MIRA ) 11 och kvantitativa realtids-PCR-analyser. Metoden utnyttjar en initial separation med magnetiska pärlor för att utarma alla icke-B-celler från navelsträngsblod och kräver färgning med endast 3 antikroppar (CD34, CD19 och CD45). De celler som återvinns representerar 4 stadier av B-celldifferentiering: 1) CD34 +, CD19 + (sen pro-B och tidig pre-BI), 2) CD34 -, CD19 +, CD45 låg (sen före BI); 3) CD34 -, CD19 +, CD45 Med (före-BII), och 4) CD34 -, CD19 +, CD45 hög (omogna B-celler).
Protocol
1. Isolering av mononukleära celler från navelsträngsblod
- Förbered EDTA-PBS-buffert-tillsätt 5 ml bovint serumalbumin (BSA) stamlösning till 95 ml sköljning buffert (1:20 spädning). Avgasa bufferten och hålla bufferten på is VIKTIGT:. Underlåtenhet att avgasa bufferten kan resultera i mindre än optimala resultat vid isolering CD19 + B-celler eftersom bubblor kan blockera isoleringen kolumnen.
- Bered 50 ml koniska rör för densitetsgradientcentrifugering. Bestäm antalet rör som behövs för bearbetning av navelsträngsblod (1 tub kan bearbeta 8 ml blod) och tillsätt 15 ml Ficoll-Paque PLUS till varje rör.
- Späd 8 ml navelsträngsblod med 24 ml DPBS (1X) och försiktigt skikt den utspädda blandningen navelsträngsblod ovanpå Ficoll-Paque PLUS i vardera av de 50 ml koniska rör. Blanda inte blodet och Ficoll-Paque PLUS VIKTIGT:. För att undvika blandning av navelsträngsblod och Ficoll-Paque PLUS håller röret i 45 graders vinkel ochskikt blod blandningen långsamt.
- Centrifugera vid 400 xg under 40 minuter vid 20 ° C. Mononukleära celler (MNC) ligger kvar på plasma-Ficoll-Paque PLUS gränssnitt medan granulocyter och erytrocyter sediment till följd av högre densitet vid det osmotiska trycket av Ficoll-Paque PLUS. Label syv 5 ml rundbottnad rör som ska användas i del 3 med prov-ID, datum och följande:
| Tube | Etikett | Syfte |
| 1 | Ofärgade | Ofärgade celler för normalisering under flödescytometri |
| 2 | 7AAD | För att bestämma viabilitet under flödescytometri |
| 3 | + + + | Innehåller de celler som ska sorteras |
| 4 | 34 + | Att samla CD34 + / CD19 +(Sent pro-B - tidig pre-BI)-celler |
| 5 | 45 låg | Att samla CD34 - / CD19 + / CD45 låg (pre-BI) celler |
| 6 | 45 Med | Att samla CD34 - / CD19 + / CD45 MED (pre-BII) celler |
| 7 | 45 hög | Att samla CD34 - / CD19 + / CD45 hög (omogna B) celler |
Coat rören 4, 5, 6 och 7 med 2% FBS och placera alla rör på is.
- Aspirera övre plasmaskiktet försiktigt och undvika kontakt med det mononukleära cellskiktet. Med användning av en 10 ml glaspipett, försiktigt överföra mononukleära cellskiktet till en ny 50 ml koniskt rör. Kombinera de mononukleära cellerna från tre rören tillsammans till en enda 50 ml rör.
- Fyll röret med PBS, blanda försiktigt och centrifugera vid 300 xg under 10 min vid20 ° C. Försiktigt aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten. Upprepa 1x. Efter den första tvätten, resuspendera pelletarna och överför till en enda 50 ml koniskt rör.
- Försiktigt resuspendera cellpelleten i 200 | il PBS. Ta 1 pl av cellsuspensionen, lägga till 1 ml PBS i en 1,5 ml mikrocentrifugrör och ställ åt sidan för att räkna (räkna celler efter att placera 50 ml cellsuspension i centrifugen). Fyll röret med PBS och centrifugera vid 200 xg under 15 min för att avlägsna blodplättar. Avlägsna supernatanten helt utan att störa cellpelleten.
2. Modifierad B-celler Isolering från mononukleära celler Använda MACS Separation
- Resuspendera pelleten från steg 1,7 med 160 pl kall (4 ° C) EDTA-PBS-buffert.
- Tillsätt 40 | il B-KLL biotinantikroppar cocktail. Pipettera att blanda väl och inkubera under 10 minuter vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna - tillsätt 1 ml kall (4 ° C) EDTA-PBS-buffert per 10 miljoner celler (cell Number bestäms i steg 1,7) och centrifugera vid 300 xg under 10 minuter. Aspirera supernatanten fullständigt och sedan resuspendera cellpelleten i 320 pl kall (4 ° C) EDTA-PBS-buffert.
- Lägg 80 il anti-biotin mikropärlor, blanda väl och inkubera under 15 minuter vid 4 ° C.
- Tvätta cellerna - tillsätt 1 ml kall (4 ° C) EDTA-PBS-buffert per 10 miljoner celler och centrifugera vid 300 xg under 10 minuter. Resuspendera upp till 100 miljoner celler i 500 pl kall (4 ° C) EDTA-PBS-buffert. Skala buffertvolym efter cell nummer.
- Förbered MACS Kolumner och Mac Separatorer under centrifugering (steg 2,5). Placera en LS-kolonn i magnetfältet av MACS separatorn, tillsätt 3 ml kall (4 ° C) EDTA-PBS-buffert på kolonnen och låt bufferten att droppa genom kolonnen. Använd en behållare för att fånga flödet genom. Kassera flödet genom.
- Placera en 50 ml koniskt rör under kolumnen och pipettera cellsuspensionen på kolonnen. Låt de omärkta cellerna att droppa rakt igenomh kolonnen och in i 50 ml koniska rör. VIKTIGT: Dessa är de celler som kommer att användas för antikroppar märkning och cellsortering. Kasta inte flödet genom. Att återställa alla cellerna från steg 2,5, tillsätt ytterligare 1 ml kall (4 ° C) EDTA-PBS-buffert till väggarna hos det koniska röret. Blanda försiktigt och pipettera den återstående cellsuspensionen på kolonnen. Upprepa 1x. Gå vidare till steg 2,8 med de omärkta cellerna samlas i den koniska röret efter att ha passerat genom kolonnen.
- Fyll koniska rör innehållande omärkta celler med PBS och centrifugera vid 300 xg under 10 minuter. Ta försiktigt bort supernatanten utan att störa cellpelleten. Tillsätt 200 pl EDTA-PBS-buffert och försiktigt återsuspendera cellerna.
3. Antikropp Märkning och förberedelse för cellsortering
- Aspirera 1 pl av cellsuspensionen och plats i röret märkt "ofärgade" (steg 1,4). Lägg 500 pl EDTA-PBS-buffert och lagra röret på is.
- Lägg 20il av varje antikropp (CD19, CD34 och CD45) per miljon celler i den återstående cellsuspensionen. Blanda väl och placera röret i mörker under 30 min vid RT. CD antikroppar är ljuskänsliga, kompletta steg 2-4 med lamporna avstängda.
- Efter 30 minuters inkubation med antikroppar, aspirera 40 ul av cellsuspensionen och placera den i röret märkt "7AAD". Tillsätt 1 ml PBS i röret och centrifugera vid 500 x g under 2 min. Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 100 pl bindningsbuffert. Lägg 7 il 7AAD (7-Aminoactinomycin D) och inkubera i mörker under 10 min vid RT. Under 10 minuters inkubation komplett steg 3,4.
- Lägg PBS till toppen av röret som innehåller de återstående celler märkta med CD-antikroppar. Centrifugera röret vid 500 x g under 3 min. Avlägsna supernatanten, tillsätt 500 pl EDTA-PBS-buffert och resuspendera cellpelleten. Överför hela volymen av cellsuspensionen i röret märkt "+ + +". För att få tillbaka alla cellsuspensionen endd ytterligare 1 ml EDTA-PBS-buffert till 50 ml koniska rör och överföring i röret märkt "+ + +".
- Efter inkubation (steg 3,3), tillsätt 300 ul bindningsbuffert i 7AAD rör. Den "ofärgade", "7AAD" och "+ + +" prover och "34 +", "45 låg", "45 med" och "45" höga rören är redo för flödescytometri.
4. Cellsortering Med MoFlo XDP flödescytometer
- Set-up MoFlo för sortering: Rikta lasrar, stabilisera droppar ström, bestämma släpp fördröjning.
- Förbered enstaka kontroller färgkompensation med Invitrogen AbC Mouse pärla kit (eller liknande) enligt tillverkarens instruktioner. Kör enfärgade kontroller justera spänningar fluorescens kanaler för optimal separation av positiva och negativa populationer. Ställ ersättning koefficienter och tillämpa kompenseras parameter till samlingen protokollet. Återupprätta ersättning koefficienter varje gång en ny mycket antikroppar erhålls.
- Skapa protokoll inklusive tomter såsom visas i figur 2.
- Kör ofärgade prov, ställa spänning och vinst för framåt och sidospridning och identifiera negativa fluorescens populationer. Eftersom DNA-återhämtning är målet av den typ, bör tröskelvärdet sättas lågt (≤ 1%), så att DNA-innehållande partiklar inte förorenar de återvunna proven. * Se till att Aerosol evakueringssystem körs hela tiden som lever mänskliga celler drivs på MoFlo.
- Kör en liten alikvot av + + + prov (~ 50.000 händelser) för att ställa gating strategi (Figur 2). Eftersom B-cell stamceller inte sprida identiskt med mogna B-celler, backgate den ungated CD19 + / CD34 +-populationen på SSC vs FSC tomt att säkerställa lymfocytinramningen inkluderar potentiella pro-B-celler. Från detta prov också ställa in negativa fluorescens befolkningen 7AAD.
- Kör 7AAD provet för att bestämma provets livskraft. Endast Sortera celler från ett prov med hög lönsamhet påbörjan (≥ 95%) som döda celler färgar urskillningslöst och kan förorena sortera populationer.
- Ställ in sortera beslut att samla fyra populationer: CD19 + / CD34 +, CD19 + / CD34 - / CD45 låg, CD19 + / CD34 - / CD45 Med, och CD19 + / CD34 - / CD45 hög. Inkludera lymfocyt och dublett grindar diskriminering i sorteringen beslut alla populationer.
- För att förhindra träskor i sortering spetsen, filter + + + prov genom en 40 um cellfilter omedelbart före sortering och åter-filter om någon aggregering sker i prov under sortering.
- Sortera cellerna i uppsamlingsrör (steg 1,4) belagda med 2% FBS i PBS i en kyld eller is-packade slanghållare.
- Omedelbart efter sortering avslutad, extrahera DNA.
Representative Results
Mellan prov variation spelar en roll i framgången för cellens sort (tabell 1). Proverna med god framgång priser har låga nivåer av förorenande skräp (Figur 3A) och proverna med dåliga svarsfrekvensen har höga halter av förorenande skräp (Figur 3B). Mellan prov variation kan något kontrolleras om sladden blodprov samlades inom 24 timmar av transport (O / N första prioritet).
Flödet sorterade cellerna från varje prekursor B-celler delmängd är av tillräcklig kvantitet och kvalitet för att utföra nukleinsyra isolering. Den DNA som isolerats är av hög kvalitet och kan användas i efterföljande analyser. Vi använder rutinmässigt detta DNA i MIRA 11 att anrika för metylerat DNA (Figur 4).
| Navelsträngsblod Facility Data | Dålig Sortera | |
| Arbeta Blodvolym med antikoagulantia (ml) | 110 | 104 |
| Vita blodkroppar [10 3 / ul] | 8,68 | 11,19 |
| Lymfocyter [10 3 / il] | 3,88 | 3,76 |
| Lymfocyt (%) | 44,70 | 33,6 |
| Röda blodkroppar [10 6 / ul] | 3,65 | 3,05 |
| Interna data | ||
| Cell nummer efter Ficoll-Paque | 206 M | 309 M |
| Cell nummer efter MACS Separation | 22 M | 16,5 M |
| Totalt Evenemang Count (MoFlo XDP) | 30,57 M | 19,97 M |
| Lönsamhet (%) | 98,00 | 98,00 |
| Celler i lymfocytinramningen (%) 17,00 | 50,00 | |
| CD19 + / CD34 + | ||
| Totalt cellantal | 10.959 | 48.316 |
| % Av totala händelser | 0,04 | 0,24 |
| Effektivitet | 88% | 88% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 låg | ||
| Totalt cellantal | 16.619 | 26.941 |
| % Av totala händelser | 0,05 | 0,13 |
| Effektivitet | 89% | 87% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 Med | ||
| Totalt cellantal | 469.745 | 507.540 |
| % Av totala händelser | 1,54 | 2,54 |
| Effektivitet | 89% | 89% |
| CD19 + / CD34 - / CD45 hög | ||
| Totalt cellantal | 1896062 | 2047142 |
| % Av totala händelser | 6,2 | 10,25 |
| Effektivitet | 91% | 90% |
Tabell 1. Representativa cell sortera statistik. Rader 1-5 är räkningar som tillhandahålls av navelsträngsblod anläggningen. De återstående raderna är data som samlas in i vårt laboratorium. Den dåliga slag innehöll höga halter av skräp och en låg andel av celler i lymfocytinramningen.
Figure 1. Flödesschema över processen. Navelsträngsblod bearbetas och mononukleära celler isoleras med användning av Ficoll-Paque plus. Ett ytterligare tvättsteg inkluderas för att avlägsna kontaminerande blodplättar. B-celler isoleras från mononukleära celler med användning av MACS humana B-cell-isoleringskit (B-KLL). Detta steg använder biotin-konjugerade monoklonala antikroppar (CD2, CD4, CD11b, CD36, anti-IgE och CD235a) för att avlägsna alla icke-B-celler. De utvunna B-celler märks med CD19-APC, CD34-PE och CD45-FITC antikroppar därefter sorteras med användning av MoFlo XDP flödescytometern att återvinna prekursor B-cell-underuppsättningar: CD19 + / CD34 +, CD19 + / CD34 - / CD45 låg , CD19 + / CD34 - / CD45 Med, och CD19 + / CD34 - / CD45 hög.
Figur 2. Gating strategi för att identifiera och sortera popdes strax. Röda pilar indikerar grinden som tillämpas på efterföljande tomt. R4, R5, R6 och R7 grindar indikerar sorterade populationer. A) Framåt mot sidospridning diagram som visar anrikat lymfocytpopulationen. R1, lymfocytinramningen. B) höjd kontra bredd framåt spridningsdiagram för identifiering enskilda celler kontra dubbletter. R2, enda cell Gate. C) CD19-APC-positiva celler delas in i CD34-PE negativa och positiva populationer. R3, CD19 + / CD34 - gate, R4, CD19 + / CD34 + grind anger önskad typ befolkningen d) CD19 + / CD34 - celler delas in i tre något olika CD45-FITC populationer.. R5 och R6, CD19 + / CD34 - / CD45 låg och CD19 + / CD34 - / CD45 MEd populationer, respektive. R7, på grund av höga cellantal i CD19 + / CD34 - / CD45 stor befolkning omfattar denna typ grind endasten del av befolkningen. Alla celler i denna population behöver inte samlas in för nedströms analys.
Figur 3. A) Låga nivåer av förorenande skräp efter kolumn anrikning. R1, lymfocytinramningen. B) Höga halter av förorenande skräp efter kolumn anrikning.
Figur 4. Anrikning av metylerat DNA från delmängder av prekursor B-celler. A) sonikerat DNA isolerat från prekursor B-cell-underuppsättningar är av hög kvalitet. För att konstruera biblioteket DNA sonikeras till ett genomsnitt av 200-600 bp. Bana 1: Promega 100 bp stege (katalog # G2101), Bana 2: Totalt DNA isolerades från CD19 + / CD34 +-celler, Spår 3: Totalt DNA isolerades från CD19 + - / CD45 låga celler, Spår 4: 100 ng DNA isolerat från CD19 + / CD34 - / CD45 MED celler, Spår 5: 100 ng DNA isolerat från CD19 + / CD34 - CD45 / hög celler. DNA sonikerades med användning av Diagenode Bioruptor på High för totalt 9 min (30 s PÅ, 30 sek AV). DNA kolonn renades och visualiseras på en 1% agarosgel med SYBR grön nukleinsyra gel färgning. B) Efter MIRA med ActivMotif MethylCollector Ultra sats, PCR med SLC25A37 (1-6) och APC1 (7-12) utförs för att bekräfta anrikning av metylerat DNA. 1 & 7: sonikerat genomisk DNA (ingen MIRA), 2 & 8: MIRA-CD19 + / CD34 + DNA, 3 & 9: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 låg DNA, 4 & 10: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 Med DNA, 5 & 11: MIRA -CD19 + / CD34 - / CD45 hög DNA, 6 & 12: Vatten kontroll. Högre förstärkning av SLC25A37 bekräftar anrikning av metylerat DNAi undergrupper av prekursor B-celler.
Discussion
Den faktor som har störst inverkan på framgången av protokollet är förekomsten av förorenande skräp. Om begäran blod från en navelsträngsblod bank är det viktigt att ha blod transporteras så snart efter provtagning som möjligt. Dessutom prover som är klassificerade som lymfocytos innehåller högre antal lymfocyter, men inte dessa prover inte har tillräckligt många föregångare B-celler och bör inte användas. För att öka sannolikheten för att erhålla tillräckligt antal av celler för varje prekursor undergrupper rekommenderar vi börjar med minst 85 ml navelsträngsblod.
Det är viktigt att notera att till skillnad från vuxna perifert blod separationer vid fraktionering navelsträngsblod det mononukleära skiktet ofta är förorenad med röda blodkroppar 12. Detta protokoll innehåller en extra tvätt för att avlägsna förorenande blodplättar. Protokoll som beskriver mononukleära separationer från navelsträngsblod föreslår bland annat en lys steg to ta bort oönskade röda blodkroppar. Vi rekommenderar inte det här steget eftersom det ger kontaminerande skräp och har en negativ inverkan på framgången av cellen Sortera.
För att minska antalet celler som måste särskiljas genom flödescytometri är det nödvändigt att utföra en B-cell-anrikning före cellsortering. Protokollet från Miltenyi Biotec, som åtföljer B-cell Isolation Kit (B-KLL), har optimerats för perifert blod och rekommenderar användning av 10 pl B-KLL biotinantikroppar cocktail per 10 miljoner celler. Detta steg använder antikroppar mot CD2 (T-celler, NK-celler), CD4 (T-celler), CD11b (granulocyter, monocyter, makrofager), CD16 (NK-celler, makrofager, mastceller), CD36 (trombocyter), CD235a (erytroida celler) att utarma icke-B-celler från navelsträngsblod. Det är viktigt att använda satsen som beskrivs och inte B-cell-isoleringskit II eftersom den tidigare satsen innehåller en antikropp mot CD43 som är närvarande på pro-B-celler. Under vår optimization av detta protokoll, fann vi att sammanlagt 40 ul B-KLL biotinantikroppar cocktail är tillräcklig för att ge ett positivt resultat cell sort. Dessutom fann vi att använda så lite som 5 | il mer av B-CLL biotinantikroppar cocktail hade negativa effekter på cellens sort. Därför rekommenderar vi att använda 40 ul B-KLL biotinantikroppar cocktail för den totala mononukleära celler tal mellan 175 till 250.000.000. Om börjar med lägre eller högre antal celler kan det vara nödvändigt att skala reagensen därefter.
Det finns många motstridiga publikationer som beskriver de markörer som kan användas för att särskilja sub-populationer av B-celler. Merparten av skillnaden kan förklaras av det faktum att differentiering är en pågående process och att närvaron eller frånvaron av cellytemarkörer sker på gradvis sätt i stället för i en allt eller inget sätt. I detta protokoll CD34 - / CD19 + och intensiteten nivån av CD45 + (låg, medel, hög) uttryck för att skilja förväg BI, pre-BII och omogna B-celler med en ökning av CD45 uttryck som motsvarar utvecklingen av differentiering 6. Pro-B-celler har beskrivits av vissa vara CD19 + / CD34 + 13, medan andra har visat att pro-B-celler är CD19 - / CD34 + och pre-BI celler är CD19 + / CD34 + 9,10. Baserat på dessa skillnader har vi utsett de CD19 + / CD34 + celler som sen pro-B-celler / tidig pre-BI celler. Det är viktigt att notera att denna strategi har utvecklats för att isolera undergrupper av prekursor-B-celler som motsvarar de celler som påverkas av sjukdomen akut lymfoblastisk leukemi. Det finns dock flera sortering strategier som kan användas beroende på cellens subtypen av intresse.
Antikropp-fluorokroma kombinationer skall väljas baserat på kapaciteten hos den tillgängliga cellsorterare. Som en släktenL regel den ljusaste fluorokrom i din panel bör användas för att märka den minst befolkade antigen och vice versa. Att upptäcka dubbla färgade populationer, särskilt sällsynta händelser som dessa, är dubblett diskriminering (Figur 2B) en mycket viktig del i gating strategi. Detta säkerställer att dubbel-positiva händelser är verkligen enskilda celler färgade med båda antikropparna och inte bara två enda färgade celler vidhäftade till varandra.
Hög hastighet, 4-vägs cellsortering skapar med nödvändighet en kontrollerad aerosol miljö. Därför bör levande människa cellsortering utföras med stor försiktighet. Publicerade säkerhet och sanering riktlinjer finns tillgängliga och bör ses över och genomföras innan sorteringen 14. Godkännande från institutionella biosäkerhetskommittéer eller deras motsvarigheter kan krävas innan sortering. För korrekt sanering efter sortering bör blekmedel tillsättas till avfallsbehållaren till en slutlig koncentration av 10%. Similarly bör alla prover slangar samt alla ytor i närområdet rensas noga med en nyligen gjord 10% blekmedel.
Sammanfattningsvis ger detta protokoll en strategi för att få sällsynta populationer av prekursor B-celler och kan ändras för att isolera en sällsynt population som finns i navelsträngsblod, inklusive hematopoetiska stamceller och omogna T-celler. Nyligen har omogna B-celler har identifierats i det perifera blodet av individer med framskriden HIV-15. Därför sträcker sig användbarheten av denna metod bortom studiet av blodcancer. Slutligen har vi ännu inte utfört RNA isoleringar på de sorterade flödesceller, men bör denna metod kunna anpassas med förbehållet att under cellsortering cellerna ska sorteras direkt i TRIzol eller motsvarande RNA-kompatibel lösning som RLT från RNeasy satsen tillgängliga via Qiagen.
Disclosures
Författare har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NCI R00 CA132784) att KT
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (1X) | Gibco by Life Technologies | 14190-144 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| LS Column | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS Multi Stand | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MidiMACS Separator | MACS Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| B-Cell Isolation Kit (B CLL) | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-660 | |
| Fetal Bovine Serum | ATLANTA Biologicals | S11195 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 ml) | MIDSCI | SS1500 | |
| BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | BD Biosciences | 559763 | |
| DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19 | BD Biosciences | 555415 | |
| DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34 | BD Biosciences | 560941 | |
| CD45 FITC | BD Biosciences | 347463 | |
| autoMACS Rinsing Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-222 | |
| MACS BSA Stock Solution | MACS Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | BD Biosciences | 352058 | |
| BD Falcon 50 ml Tube | BD Biosciences | 352098 | |
| PuraFlow Sheath Fluid, 8X | Beckman Coulter | CY30230 | |
| FlowCheck Alignment beads | Beckman Coulter | 6605359 | |
| Ultra Rainbow Alignment beads | Spherotech | URFP-30-2 | |
| ViroSafe Aerosol Evacuation Filter | Beckman Coulter | ML01330 | |
| ABC Mouse bead kit | Invitrogen | A-10344 | |
| 40 μm cell strainer | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Fisher Scientific Hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Microscope | |||
| accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-516 | |
| MoFlo XDP flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| Aerosol Evacuation Unit | Beckman Coulter |
References
- Song, F., et al. Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression. PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).
- Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells. Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).
- Brown, G., et al. The sequential determination model of hematopoiesis. Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).
- Clark, P., et al. Lymphocyte subsets in normal bone marrow. Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).
- Loken, M. R., et al. Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development. Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).
- Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. B-cell precursors in normal pediatric bone marrow. American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).
- Tucci, A., et al. Are cord blood B cells functionally mature? Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).
- Ghia, P., et al. Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci. J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).
- Noordzij, J. G., et al. Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children. Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).
- van Zelm, M. C., et al. Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression. J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).
- Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. The MIRA method for DNA methylation analysis. Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).
- Kanof, E. M., et al. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Current Protocols in Immunology. , Suppl 19. 7.1.1-7.1.7 (1996).
- LeBien, T. W.
- Schmid, I., et al. International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells. Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).
- Malaspina, A., et al. Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7. PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).
