Een vergelijkende benadering van het Landschap van gastheer-pathogeen eiwit-eiwit interacties karakteriseren

Summary

Dit artikel richt zich op de identificatie van hoog-vertrouwen interactie datasets tussen gastheer en pathogeen-eiwitten met behulp van een combinatie van twee orthogonale methoden: gist twee-hybride, gevolgd door een high-throughput interactie test bij zoogdiercellen genaamd HT-GPCA.

Abstract

Aanzienlijke inspanningen werden verzameld om grootschalige uitgebreide eiwit-eiwit interactie netwerk kaarten te genereren. Dit is een randvoorwaarde om de pathogeen-gastheer relaties begrijpen en werd hoofdzakelijk uitgevoerd door genetische screenings in gist twee-hybride systemen. De recente verbetering van eiwit-eiwit interacties detectie door een Gaussia luciferase-gebaseerde fragment complementatie test biedt nu de mogelijkheid om integratieve vergelijkende interactomic benaderingen nodig ontwikkelen om rigoureus interactieprofielen van eiwitten te vergelijken van verschillende pathogene stam varianten tegen een gemeenschappelijke set van cellulaire factoren.

Dit document richt zich specifiek op het nut van het combineren van twee orthogonale methoden om eiwit-eiwit interactie datasets te genereren: gist twee-hybride (Y2H) en een nieuwe test, high-throughput Gaussia princeps eiwit complementeringsbepaling (HT-GPCA) uitgevoerd in zoogdiercellen.

nt '> Een grootschalige identificatie van cellulaire partners van een pathogeen eiwit wordt uitgevoerd door voortplanting gebaseerd gist twee-hybride screening van cDNA-bibliotheken die meerdere pathogenen stamvarianten. Een subgroep van interactie partners geselecteerd op een veel vertrouwen statistische scoring verder gevalideerd in zoogdiercellen paarsgewijze interacties met het geheel van pathogene varianten eiwitten met HT-GPCA. Deze combinatie van twee complementaire methoden verbetert de robuustheid van de interactie dataset, en kan de prestatie van een strenge vergelijkende interactieanalyse. die vergelijking interactomics vormen een betrouwbare en krachtige strategie te ontcijferen elke pathogeen-gastheer wisselwerkingen.

Introduction

De toenemende hoeveelheid gegevens verzameld om eiwit-eiwit interacties kaarten genereren opent perspectieven om verder te begrijpen pathogeen infecties. Als globale begrip van pathogeen infecties begint te ontstaan, het biedt toegang tot het bereik van de verstoringen veroorzaakt door ziekteverwekkers eiwitten bij het ​​aansluiten van het menselijk proteoom ^1. Het biedt daarmee een manier om te begrijpen hoe pathogenen manipuleren van de gastheercel machinerie. Met name de afbeelding van verscheidene virale en gastheer interactienetwerken gebleken dat virale eiwitten voorkeur samen eiwitten die sterk verbonden in het cellulaire netwerk (hubs), of die essentieel zijn voor vele paden in een netwerk (bottlenecks eiwitten) ^2-4 targeten. Deze interacties kunnen virussen op belangrijke cellulaire processen te manipuleren, dat is instrumenteel om te repliceren en te produceren infectieus nageslacht. Vergelijkende interacties mapping werden onlangs uitgevoerd op verwante virussen met het doel om informatie met betrekking totpathogenese ^4. Bovendien hebben studies van de gastheer-pathogenen interacties landschap uitgebreid naar vele ziekteverwekkers ^5. De gerichte cel identificatie factoren geeft inzicht in de strategieën die door ziekteverwekkers om cellen te infecteren en maakt de ontdekking van potentiële pathogene markers.

De gist twee-hybride systeem is de meest populaire methode om binaire interacties vast omdat genetische screening is een efficiënt en gevoelig hulpmiddel voor high-throughput kaart brengen van eiwit-eiwit interacties. De hier voorgestelde aanpak verbetert verder individuele Y2H screenings door beoordeling van een eiwit van meerdere pathogenen stamvarianten, waardoor toegang tot een vergelijkend overzicht van pathogeen-gastheer eiwit-eiwit interacties. Bovendien is een belangrijke beperking van gist twee-hybride screening ligt in een hoog percentage vals-negatieve, aangezien herstelt ongeveer 20% van de totale interacties ^6. Dit betekent dat interactie gedetecteerd met slechts een subset van pathogens varianten zouden zijn ontsnapt detectie met de anderen. Daarom worden de individuele partners die uit alle twee-hybride screening verder uitgedaagd voor interactie met het complete assortiment van stammen bestudeerd, verstrekking van vergelijkende interactie datasets. Aangezien werd aangetoond dat het combineren van verschillende methodologieën sterk verhoogt de robuustheid van eiwit-eiwit interacties datasets ^7, wordt deze validatie uitgevoerd in zoogdiercellen door een nieuw ontwikkelde eiwit fragment complementatie bepaling genoemd HT-GPCA ^8. Deze cel-gebaseerde systeem kan de detectie van eiwit interacties door complementatie van de Gaussia princeps gesplitst luciferase en is ontworpen compatibel met een hoog-formaat zijn. Dankzij de luminescentie gebaseerde technologie en lage achtergrondruis in vergelijking met andere fluorescentie-gebaseerde test, HT-GPCA toont een opvallend hoge gevoeligheid.

Kortom, deze benadering vormt een efficiëntehulpmiddel om een ​​uitgebreide kaart brengen van gastheer-pathogeen wisselwerkingen, die de eerste stap naar een wereldwijd begrip van de gastheercel kapen vertegenwoordigt genereren.

Protocol

1. Gist twee-hybride Screenings

1. Maak de volgende gewenste oplossingen:
   1. Volledige Synthetische Drop Out (SD): los 26,7 g minimale SD basis met glucose in 1 L water. Voeg 2 g aminozuurmengsel als volgt bereid: 2 g adenine hemisulfaat, 2 g Arginine HCl, 2 g Histidine HCl, 2 g Isoleucine, Leucine 4 g, 2 g Lysine HCl, 2 g methionine, fenylalanine 3 g, 2 g L -Serine, 2 gram L-Threonine, 3 g tryptofaan, 2 g Tyrosine, 1,2 g Uracil, 9 g Valine.
   2. Selectieve Drop Out SD-L/-W/-H: SD bevatten alle essentiële aminozuren, behalve die welke in deze (-L:-Leucine;-W:-tryptofaan;-H:-histidine).
   3. YPGLU: voor 1 L, gewicht 10 g gistextract, 10 g Bacto pepton en 20 g glucose. Compleet met 25 g Bacto agar voor vaste media.
   4. YCM: Zelfde als YPGLU, maar pH op 4,5.
2. Paring en het verspreiden
   1. Gebruik ingevroren aliquots van pre-transformatieed giststam Y187 (mating type α) die een cDNA bibliotheek gekloneerd in pACT2. Controleer levensvatbaarheid van de cellen door plateren seriële verdunningen op SD-L platen.
   2. Kloon van de ziekteverwekker ORF in pGBKT7 vector, en transformeren de recombinant plasmide met behulp van een standaard procedure in AH109 giststam (type paring a).
   3. Spread pGBKT7-getransformeerde AH109 gist op SD-W platen. Incubeer minstens twee dagen 30 ° C in een bevochtigde incubator. Platen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C totdat de twee-hybride screening.
   4. Gebruik 3-aminotriazool (3-AT), een competitieve remmer van het enzym HIS3, het potentieel zelf-transactivatie van het HIS3-reportergen tegen de pathogenen eiwitten. Voer een auto-activatie test door bepaling van de concentratie van 3-AT, die de groei van pGBKT7-getransformeerde gist voorkomt op SD-W/-H platen.
   5. Zaad 30 ml SD-W met enkele kolonies van pGBKT7-getransformeerde AH109. Incubeer 30 uur bij 30 ° C met rotatie.
   6. Zaad 200 ml SD-W met 30 mlde AH109 culturen. Incubeer bij draaiing over 20 uur bij 30 ° C.
   7. Incubeer ontdooid cDNA-getransformeerde Y187 in 20 ml YPGLU, incubeer 10 min bij 30 ° C met rotatie.
   8. Centrifugeer een volume van pGBKT7-getransformeerde AH109 cultuur overeenkomend met het aantal levensvatbare gistcellen Y187 gedurende 5 min bij 3500 rpm bij 20 ° C. Zuig het supernatant en resuspendeer pellet in 10 ml YPGLU.
   9. Meng de geresuspendeerde AH109 gist met Y187 bevattende bibliotheek. Overbrengen in een 50 ml buis. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 3500 rpm bij 20 ° C, zuig supernatant (breekbaar pellet).
   10. Resuspendeer pellet in YPGLU een totaal van 1,5 ml te krijgen.
   11. Spread gist op 3 YCM-Agar platen van 150 mm, 0,5 ml / plaat. Incubeer 4,5 uur bij 30 ° C.
   12. Verzamel gedekt gist uit YCM platen door schrapen met een hark glas in 10 ml SD-L/-W/-H. Spoel de platen twee keer met 5 ml SD-L/-W/-H medium en het zwembad.
   13. Centrifugeer 5 minuten bij 3500 rpm, 20° C. Gooi supernatant en resuspendeer de gist pellet in 5 ml SD-L/-W/-H medium.
   14. Verspreid gedekt gist op tot 10 platen (0,5 ml / plaat) van SD-L/-W/-H Agar aangevuld met de juiste concentratie van 3-aminotriazool (3-AT) bepaald in de auto-activatie test. Incubeer bij 30 ° C in een vochtige atmosfeer gedurende 6-10 dagen.
   15. Bepaal de diploïde (2n) tarief om paring efficiëntie te evalueren door het verspreiden van 250 ul van seriële verdunningen (10 ^-4 tot 10 ^-6) van de gedekt gistsuspensie op SD-L/-W platen. Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende twee dagen. Rekenen kolonies gegroeid op SD-L/-W, en afleiden van de totale diploïde aantal aanwezig in het oorspronkelijke volume van paarde gist. Meld deze diploïde aantal levensvatbare bibliotheek-bevattende gist nummer om de diploïde berekenen. Het moet variëren rond 10-25%.
   16. 6-10 dagen na incubatie bij 30 ° C, kies gedekt gistkolonies in verse SD-L/-W/-H + 3-AT platen. [Tip: Om de gist in een schema van 8stegen van 12 wells reproduceren van een plaat met 96 putjes zodat het gemakkelijker daarna voor sequentiebepaling] is. Laat gist kolonies groeien gedurende 4-5 dagen bij 30 ° C in een vochtige atmosfeer.
3. Screening van his3 positieve klonen door PCR en sequencing
   Het doel is om PCR amplificeren van het ORF in de pACT2 vectoren van gist kolonies gekweekt op selectieve platen SD-L/-H/-W.
   1. Zet een 96 wells PCR-plaat op het ijs.
   2. Om gistcellen lyseren voeg 50 ul per putje van een Zymolase 20T oplossing (2,5 mg / ml in 10 mM HEPES buffer pH 7.7).
   3. Voorzichtig resuspendeer een kolonie per putje.
   4. Incubeer 15 min bij 37 ° C en 15 min bij 95 ° C.
   5. Zet de plaat terug op het ijs. Voeg 50 ul van gedistilleerd water per put. Meng goed door en neer te pipetteren.
   6. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 3500 rpm en 4 ° C.
   7. PCR amplificeren 10 ul van een insert met primers hybridiseren weerszijden van de ORF afgeleid van cDNA in pACT2 vectoren detecteren. Het protocol is gIven voor amplificatie van 96 gelyseerde gistkolonies met de ExTaq polymerase. Bereid het volgende mengsel: 525 pl 10X ExTaq buffer, 420 pl dNTP mix (2,5 mM), 10,5 ui Forward Primer (1 ug / ul), 10,5 pl Reverse Primer (1 ug / ul), 31,5 pl ExTaq (5 U / pl ) en 3202,5 ​​ui H ₂ 0. Verdeel 40 ul van het mengsel per putje in een 96 wells PCR-plaat. Voeg 10 ul van gelyseerde gist per putje. Voer amplificatie als volgt: 94 ° C gedurende 3 min, vervolgens 35 cycli bij 94 ° C gedurende 30 seconden, 60 ° C gedurende 1 min, 72 ° C gedurende 4 min, en eindigt met 72 ° C gedurende 7 minuten. Run 3 ui van de PCR producten op een 1,2% agarose gel om PCR-positieve klonen gedetecteerd. Merk op dat het gebruik van pre-cast 96 goed agarosegelen wordt aanbevolen.
      [Tip: plaat kan bij -20 ° C gedurende enkele maanden worden opgeslagen en hergebruikt voor nieuwe PCR]
   8. Sequentie van de PCR geamplificeerde fragmenten geïsoleerd van HIS3 positieve klonen. Voer een BLAST analyse om cellulaire ORF identificeren. Lage vertrouwen afstemmingen (E waarde &gt; 10 ^-10, identiteit <80%, peptide lengte <20 aminozuren) worden afgevoerd, evenals frameshifted en voortijdig stopcodon bevatten sequenties.

2. Matrix gebouw voor HT-GPCA

HT-GPCA een zoogdiercel gebaseerde test waarbij zowel pathogeen en gastheer eiwit transiënt tot expressie worden gefuseerd met complementaire fragmenten van de gesplitste Gaussia princeps luciferase. Na interactie van de partners, wordt dit enzym opgelost waardoor de mate van de enzymatische activiteit. De interactie intensiteit wordt dus afgeleid uit een genormaliseerde luminescentie Ratio (zie hieronder en figuur 1)

4. Selectie gastheercel partners
   1. Selecteer eiwitten die meer dan drie keer de Y2H screenings voor verdere bevestiging in zoogdiercellen worden geïdentificeerd om de dataset vertrouwen ⁹ toenemen.
   2. Voeg bekende interactie partners van de ziekteverwekker eiwitten als positive controles.
5. Overschrijven naar HT-GPCA compatibel vectoren
   1. Klonen elk pathogeen eiwit ORF in een pSPICA-N2 vector te ziekteverwekker proteïnen met aminozuren 110-185 van het gehumaniseerde Gaussia princeps luciferase gefuseerd bij de N-terminus (GL2-pathogeen eiwitfusies) genereren.
   2. PCR amplificeren cellulair eiwit ORF rechtstreeks van de Y2H positieve klonen of andere hulpmiddelen ORF (Human ORFeoom http://horfdb.dfci.harvard.edu/ ) en deze overbrengen naar pSPICA-N1 vectoren proteïnen gefuseerd aan de N-terminus met het genereren de aminozuren 18-109 van gehumaniseerd Gaussia princeps luciferase (GL1-host eiwitfusies).
      [Tip: Voor grootschalige klonen, wordt het Gateway kloneringssysteem aanbevolen. In dat geval is voor PCR amplificatie, gebruikt primers ontworpen Gateway compatibele sites bevatten].
   3. Sequence alle expressievectoren. Sequenties van de pSPICA-N1 en N2-pSPICAis te vinden in referentie 8.

Merk op dat plasmideconstructen kan worden omgekeerd, dwz pathogenen eiwitten in pSPICA-N1 en gastheer eiwit in pSPICA-N2.

3. High-Throughput Gaussia princeps Luciferase-Based Protein Complementatie Assay (HT-GPCA)

6. Cell Transfectie
   1. Seed 293T cellen bij 350.000 cellen / ml van DMEM met 10% foetaal runderserum (FBS) zonder antibioticum. Verdeel 100 ul / putje in steriele witte cultuur platen. Neem niet meer dan 10 platen in een enkel experiment. Laat cellen groeien gedurende 24 uur bij 37 ° C met 5% _CO2.
      [Tip:. Aangezien pSPICA plasmiden bevatten een SV40, het gebruik van 293T cellen maakt het repliceren in getransfecteerde cellen en dus leidt tot overexpressie van de twee fragmenten luciferase]
   2. De volgende dag, transfecteren cellen met elke geschikte transfectie protocol. Merk op dat voor bepaalde transfectiereagentia, de number van cellen gezaaid kan worden aangepast. Gebruik 100 ng per putje van zowel de pathogeen en gastheer ORF plasmideconstructen. Co-transfecteren 10 ng per putje van een van CMV-Firefly luciferase plasmide te normaliseren voor transfectie-efficiëntie. Elk punt wordt in triplo getest.
      [Tip:. DNA mengsels kan de dag voor transfectie uitgevoerd en bewaard bij -20 ° C met lijmafdichtingen]
   3. Overdracht transfectiemengsel aan de platen van gekweekte 293T cellen. Let op de DNA schud zachtjes zetten op de cellen, zoals 293T niet sterk hechtend en gemakkelijk los van de bodem van de put. Incubeer in een celkweek incubator gedurende 24-30 uur bij 37 ° C met 5% _CO2.

7. Cellysis en Gaussia luciferase dosering
   1. Was de cellen met PBS (100 ul / putje). Voeg 40 ul 1X lysisbuffer Renilla. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder roeren.
   2. Bespaart 10 ul van cellysaten in een andere witte plate voor daaropvolgende dosering van het Firefly luciferase activiteit. Bewaar bij 4 ° C of alternatief bij -20 ° C met afdichting.
   3. Meet de Gaussia activiteit op de resterende 30 pl cellysaten door toevoegen van 100 pl Renilla luciferase assay reagens en tellen luminescentie gedurende 10 seconden met een luminometer. Dosering van een 96 wells plaat duurt ongeveer een half uur. Voeren meting met verse cel extracten sinds bevriezing of langdurige opslag interactie-gemedieerde Gaussia activiteit kunnen beïnvloeden.

8. Meting van Firefly activiteit
   1. Meet de Firefly activiteit van de opgeslagen 10 pl cellysaten door toevoeging van 50 pl firefly luciferase assay reagens en tellen luminescentie gedurende 10 sec. Dosering van een 96 wells plaat duurt ongeveer een half uur. [Tip: De dosering van Firefly luciferase kan worden uitgevoerd de dag na op bevroren lysaten.]

9. NLR Berekeningen
   Gaussia luciferaseactiviteit en Firefly luciferase activiteit een genormaliseerde luminescentie Gaussia waarde inachtneming transfectie-efficiëntie en de levensvatbaarheid van de cellen te verkrijgen. Bereken het gemiddelde van de drie herhalingen.
   1. Om de interactie te controleren, schatten een genormaliseerde luminescentie Ratio (NLR) voor elk pathogeen-gastheer paar. Hiertoe verdelen de genormaliseerde luminescentie Gaussia activiteit gedetecteerd in aanwezigheid van zowel pathogeen en gastheer eiwitten door de som van de activiteiten gemeten in controleputjes (figuur 1 aangepast van referentie 8). Het NLR cut-off waarde voor positieve interacties is geschat op ongeveer 3,5 ^8.

10. Data-analyse
    1. Voer hiërarchische clustering met de R statistiek pakket. Ten eerste, de groep van de NLR data in categorieën, bereken dan een interactie dendrogram met behulp van de volledige koppeling methode. Visualiseer ditdendrogram met JavaTreeView ^10. Bereken de afstand tussen de interactie dendrogram en fylogenetische boom met behulp van een Pearson correlatiecoëfficiënt.
    2. Om interactie netwerken genereren, selecteert u de positieve interacties van de HT-GPCA dataset en gebruik de Cytoscape software ^1. Pak de graden van de gastheer-en plot hun distributie toegang tot het netwerk lokale dynamiek. Host-pathogenen netwerken kunnen worden gelegd op de gastheer interactoom om een ​​beoordeling van de globale impact van de ziekteverwekker eiwitten in de gastheer cellulaire netwerk.
    3. Extract van de GO (Gene Ontology) termen in verband met de beoogde cellulaire factoren met de DAVID bioinformatica databank ¹² aan de functionele verrijking van de dataset te beoordelen.

Representative Results

Een grote kracht van HT-GPCA ligt in zijn hoge gevoeligheid, zoals blijkt uit de evaluatie van vals-positieve en fout-negatieve uitslagen voor de HPV-E2 eiwit in figuur 2 (aangepast uit referentie 13). Om de valse negatieve tarief te bepalen, werden bekende interacties van E2 van HPV16 beoordeeld door HT-GPCA (Figuur 2A). Vier van de 18 interacties werden niet hersteld (wat overeenkomt met een 22% vals negatieve tarief). De valse positieve interacties werden gemeten tot 5,8% met 12 HPV-E2-eiwitten tegen een willekeurige reeks van cellulaire eiwitten (Figuur 2B) zijn. Voorts is de sterke specificiteit van de werkwijze uit figuur 2C toont dat een enkele puntmutatie bekend mengen E2 binding aan de cel partner BRD4 vernietigt het NLR verhouding (Figuur 2C).

Deze grootschalige vergelijkende interactomic aanpak is onlangs met succes toegepast op drie vroege proeiwitten van het humaan papillomavirussen (HPV): E2, E6 en E7 afkomstig van verschillende genotypen vertegenwoordiger van de HPV natuurlijke diversiteit in tropismen en pathologieën ^13,14. Voor elk van de vroege eiwitten, hiërarchische clustering van de interactieprofielen meestal HPV recapituleert fylogenie, waaruit de robuustheid van de aanpak en de relevantie van interactie datasets (figuur 3 aangepast van referenties 13 en 14). Het kan worden gebruikt om specifieke interactieprofielen virus-gastheer correleren met pathologische eigenschappen, waardoor aan aanwijzingen van de betrokkenheid van virale eiwitten in pathogenese. Genotype-specifieke interacties kunnen worden geëxtraheerd, die potentieel overeenkomen met tropisme of pathogene biomarkers zoals getoond in figuur 4 voor het E6-eiwitten van HPV (figuur 4 aangepast van referentie 14).

Bovendien kan functionele inzichten ontstaan ​​uit dergelijke grootschalige analyses. Bijvoorbeeld, in de studie van interactomichet HPV E2-eiwitten, de functionele verrijking analyse leidde tot de identificatie van een prominente familie bestaande uit cellulaire transcriptiefactoren, in overeenstemming met de primaire rol van E2 als virale transcriptionele regulator. Het bleek ook een onverwachte functionele doelgerichtheid van het intracellulair verkeer machines, opent nieuwe perspectieven voor de rol van E2 in HPV pathogenese ^13.

Algemeen, de vergelijkende interatomische studies uitgevoerd met het HPV vroege eiwitten sterk verbeteren van het begrip van HPV pathogenese door het correleren van specifieke interacties profielen aan fenotypische verschillen.

Figuur 1. Identificatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van HT-GPCA. Zowel pathogeen en gastheer eiwitten worden gefuseerd aan een inactieve helft van de Gaussia princeps luciferase (GL2 en GL1 delen, respectievelijk). Wanneer de eiwitten interactie, wordt een luciferase activiteit veroorzaakt door de nabijheid van de beide helften van het enzym. Het gerestaureerde Gaussia luciferase activiteit wordt berekend uit een Genormaliseerde Ratio Luminescentie (NLR) zoals rechts getoond. Figuur aangepast van referentie 8. hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2. HT-GPCA kenmerken. (A) 18 interacties gewonnen uit de literatuur met betrekking tot de E2-eiwit van HPV16 en cellulaire eiwitten werden getest door HT-GPCA in te schatten van de vals-negatieve rente in verband met deze t echnique. De NLR-ratio wordt voorgesteld als een kleurverloop (warmte-kaart) met een schaal van zwart (geen interactie) naar blauw (sterke interactie) branden. Vier bekende interacties werden niet teruggevonden (rode pijlen) geven een ruwe schatting van de vals-negatieve percentage rond de 22%. (B) 12 HPV E2-eiwitten werden getest met 10 willekeurig gekozen cellulaire eiwitten, oftewel een priori negatieve interacties, om de vals-positieven van de HT-GPCA die gescoord ongeveer 5,8% vast. (C) De interactie tussen de BRD4 cellulaire eiwit en HPV16 of HPV18 E2-eiwitten bekend is afhankelijk van de aminozuren I73 en I77 respectievelijk. Wanneer deze aminozuren zijn gemuteerd, de HT-GPCA NLR daalt met een 5-time afname blijk van een hoge specificiteit voor het detecteren van interacties. Figuur aangepast van referentie 13. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

jove_content "fo: keep-together.within-page =" altijd ">
Figuur 3. Vergelijking tussen experimentele interactie gebaseerde dendrograms en HPV fylogenetische bomen. De fylogenie van HPV gebaseerd op de vroege eiwitten E2 (A), E6 (B) of E7 (C) sequenties worden weergegeven aan de linkerkant van elke grafiek. Interactie dendrograms werden verkregen door hiërarchische clustering van de interactie profielen van elk eiwit en zijn vertegenwoordigd aan de rechterkant. Een significant congruentie werd waargenomen tussen beide soorten boom, met gelijkaardige clustering van de pathologische types (gekleurde rechthoeken), waaruit blijkt dat de relevantie van de interactie datasets. Figuur aangepast van referenties 13 en 14. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijkenure.

Figuur 4. Schematische weergave van de E6 belangrijkste cellulaire doelwitten. Werden cellulaire doelwitten gesorteerd op basis van de interactie tussen intensiteit en gegroepeerd naar interactie HPV-type. Deze weergave kan de identificatie van biomerkers zoals FADD, die alleen samenwerkt met de E6-eiwitten van oncogene HPV. Dergelijke doelgerichte moeten cruciaal voor het carcinogene eigenschap van alle oncogene HPV zijn en derhalve een goede kandidaat om te worden gebruikt hetzij als een surrogaat marker voor HPV-infectie of als een therapeutisch doelwit. Figuur aangepast van referentie 14.

Discussion

Onafhankelijk, gist-twee hybride en zoogdieren interactie assays, zoals GST pull-down, LUMIER of MAPPIT, hebben bewezen effectieve tools om eiwit-eiwit interacties te detecteren, maar worden beperkt door het hoge percentage van vals-positieve en vals-negatieve interacties die met deze technieken ^15. Bovendien is bewijs groeit dat combineren orthogonale methoden verhoogt de betrouwbaarheid van de verkregen interactie dataset ^7. De recente ontwikkeling van de HT-GPCA hier beschreven techniek is niet alleen een verbetering van de gevoeligheid van detectie binaire eiwit-eiwit interacties in zoogdiercellen, maar heeft ook de mogelijkheid om een ​​groot aantal interacties aan tegelijk aangeboden.

De hier beschreven strategie verbetert de dekking van de individuele Y2H screenings door indringende interacties van meerdere stamvarianten. Bovendien hertesten interacties met een orthogonale detectiemethode biedt strenge vergelijkende interactietie datasets, door het overwinnen van beperkingen en ontsnappen artefacten die inherent zijn aan de twee-hybride methode. Inderdaad, aangezien HT-GPCA plaatsvindt in zoogdiercellen, de post-translationele modificaties en natuurlijke subcellulaire lokalisatie van de eiwitten niet beïnvloed. Onze aanpak kan dus produceren in een stap interactie kaarten die zijn verbeterd ten opzichte van die voornamelijk gebaseerd op gist twee-hybride voor interactie sensing ^4.

Op dit moment, hoewel, raden wij voorzichtig bij trans-membraaneiwitten bestuderen, aangezien de detectie van interacties kan afhangen van de lokalisatie van de Gaussia fragmenten aan weerszijden van het membraan. In deze gevallen kan het nodig zijn de Gaussia fragmenten zekering in het C-terminale uiteinde van een of beide partners. Daarnaast zou de luciferase-expressie worden van talrijke parameters zoals transfectie-efficiëntie en celaantal. Daarom zouden we raden follvanwege de normalisering procedure beschreven in het gedeelte protocol om rekening te houden met experimentele variaties.

Door geordende arrays van ORF uit de toenemende collectie van de Human ORFeoom voorzien we een punt in de nabije toekomst waar HT-GPCA direct kunnen worden gebruikt als screeningsmethode. Dit moet eerst drastisch verbeteren van de screening dekking omdat elk eiwit paren dan zou getest worden, en ten tweede moet het de automatisering te vergemakkelijken. Er moet echter een meer drastische high throughput uitbreiding van deze assay worden ingesteld door de ontwikkeling van een in vitro assay HT-GPCA middels in vitro expressiesystemen gebaseerd op menselijke celextracten. Hierdoor zouden ook voor eiwit-eiwit interacties in een gecontroleerde biochemische omgeving controleren.

Tenslotte wordt verwacht dat toekomstige ontwikkelingen de visualisatie van-gemedieerde luminescentie in levende cellen verbeteren. In dat geval zou de HT-GPCA wordengebruikt om dynamische interacties te detecteren in de context van de toevoeging van geneesmiddelen of complexe remmers waardoor levende controle van de verstoring van de interactie.

In alle, vormt deze aanpak een efficiënte schets voor alle studies van pathogeen-gastheer interactie en we voelen dat vergelijkende interactoomanalyses een stevig kader kan bieden om microbe kaping van gastheercellen te begrijpen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast strains	Clontech
Minimal SD base	US biological	D9500
Amino acids	Sigma
3-amino-1,2,4-Triazole (3-AT)	Acros organics	264571000
Zymolase	Seikagaku	120491
DMEM	Gibco-Life Technologies	31966
Fetal bovine serum	BioWest	S1810
Phosphate buffer Saline (PBS)	Gibco-Life Technologies	14190
Penicillin-Streptomycin	Gibco-Life Technologies	15140
Trypsin-EDTA	Gibco-Life Technologies	25300
Renilla luciferase assay	Promega	E2820
White culture plate	Greiner Bio-One	655083
96-wellPCR plates	4titude	4t-i0730/C
Incubator (30 °C)	Memmert
Incubator (37 °C)	Heraeus
Luminometer	Berthold	Centro XS-LB 960