Summary
Цитомегаловирус человека (ЦМВ) инфекции новорожденных представляет собой важный причиной умственной отсталости, но молекулярные события, приведшие к индуцированной вирусом патогенеза остаются малоизученными. Для исследования динамики мозговой инфекции, мы адаптировали целого животного
Abstract
Цитомегаловирус человека (ЦМВ или ВГЧ-5) является опасным для жизни возбудителя в ослабленным иммунитетом лиц. При врожденной или неонатальной инфекции, вирус может заразить и размножаться в развивающемся мозге, которые могут вызывать серьезные неврологические нарушения, вплоть до глухоты и умственной отсталости. Несмотря на потенциальную тяжесть симптомов, терапевтические возможности ограничены отсутствием вакцины и отсутствие конкретного противовирусной терапии. Кроме того, точное описание молекулярных событий, происходящих во время инфекции центральной нервной системы (ЦНС) до сих пор отсутствует, так как наблюдения основном вытекают из вскрытия инфицированных детей. Нескольких животных моделях, таких как макаки резус CMV, были разработаны и стал важным вкладом в патогенезе ЦМВ в ЦНС. Однако, несмотря на эволюционную близость с людьми, эта модель была ограничена внутричерепного процедуру прививки использовали для инфицирования животных и минусыistently вызывают инфекции ЦНС. Кроме того, этические соображения способствовали разработке альтернативных моделей, среди которых неонатальной инфекции новорожденных мышей с мышью цитомегаловирус (MCMV) в последнее время привело к значительному прогрессу. Например, сообщалось, что внутрибрюшинной инъекции MCMV к линии BALB / C новорожденных приводит к инфекции нейроны и глиальные клетки в определенных областях головного мозга. Эти результаты говорят о том, что экспериментальные прививки мышей может резюмировать дефицита индуцированные ЦМВ инфекции у детей. Тем не менее, динамический анализ MCMV инфекции новорожденных трудно выполнить, потому что классическая методология требует жертву значительное количество животных в различные моменты времени для анализа вирусной нагрузки и / или связанных с иммунитетом параметров. Чтобы обойти это узкое и дать возможность дальнейших исследований редких мутантных животных, мы использовали в естественных изображений технология для выполнения временной ход анализа вирал распространение в мозге после инъекции периферийных рекомбинантного MCMV выражения люциферазы в C57BL / 6 новорожденных.
Introduction
Цитомегаловируса человека (HCMV/HHV-5) является членом β-герпесвирусов семьи. ЦМВ является весьма распространенной, условно-патогенным микроорганизмом, который обычно приобретенные в раннем возрасте так и в бессимптомной 1. Как и все вирусы герпеса, ЦМВ сохраняется в течение всей жизни хозяина, чья иммунная система жестко контролирует репликацию вируса. Эпизоды реактивации вирусов в основном происходят у ослабленных лиц, таких как пересадка пациентов, получающих препараты для предотвращения отторжения трансплантата 2. У взрослых HCMV также была связана с глиобластомы 3. Кроме того, ЦМВ является известный патоген для новорожденных с незрелым иммунитетом 4-6. Первичная инфекция у развивающегося плода или новорожденного может иметь серьезные последствия. ЦМВ инфекция является наиболее распространенной инфекционной причиной врожденных дефектов рождения и детских расстройств в развитых странах. Считается, что частота неонатальной инфекции ЦМВ влияет на 0,5-1% OF всех живорожденных среди которых 5-10% будут страдать от тяжелых симптомов, таких как микроцефалия или гипоплазии мозжечка. Кроме того, 10% ВИЧ-инфицированных детей с субклинической вирусная инфекция будет развиваться позже sequellae ведущие к умственной отсталости, потеря слуха, дефекты зрения или захват и эпилепсии 7,8.
В отличие от других человеческих вирусов герпеса, таких как простого герпеса 1 (HSV-1/HHV-1), которые могут быть привиты на мышах по различным маршрутам впрыска 9, цитомегаловирус репликации конкретных видов. Эта особенность сильно затруднено исследований патогенеза HCMV, которые выполняются в различных моделях на животных (мыши, крысы, морской свинки, макака-резуса) и их соответствующие подлинной узла-CMVs. Все CMVs проявляют значительное сходство в размерах генома и организации, тропизм к тканям и регуляции экспрессии генов. Они также вызывают такой же патологии в принимающих их стран. Несмотря геномного разнообразия бытьмежду HCMV и мышь цитомегаловирус (MCMV) (50% от ORF, присутствующих в человеческий вирус определены в мышиной CMV), мышиной модели недавно доказал, что предпочтительно, в основном потому, что мутантные штаммы могут быть протестированы на их способность контролировать вирусную Репликация в естественных условиях. Это привело к генетической экран, который включен оценки количества генов мыши, высказанные на взрослой стадии, которые составляют "resistome" этого вируса 10. В целом, это означает, что MCMV-инфицированных мышей представляют собой привлекательную модель для изучения хост-вирус взаимодействия у взрослых. Разведка врожденной инфекции CMV является более сложным, так как различия в плацентарных организации слой между человеком и мышей ухудшают матери к плоду передачи вирусной инфекции у мышей. В последнее время непосредственного впрыска MCMV в плаценте в день 12,5 беременности позволило инфекции мозга новорожденных мышей, которые привели к нарушением слуха 11. Однако, большинство яnvestigations теперь использовать внутрибрюшинного введения 4-20 HR-старые новорожденных обеспечить системное вирусное распространение потенциально ведет к гематогенной инфекции мозга, модель, которая является более актуальным, чем внутричерепные инъекции. Этот протокол важным вкладом в патогенезе CMV и, в частности, было показано, что MCMV инфекции результатов новорожденных в репликации вируса в нейрональных и глиальных клеток, расположенных в воспалительных очагов, которые проникли с мононуклеарными клетками, как макрофагами 12. В этом докладе также описан изменены морфогенез мозжечка сопровождается снижением гранулированный пролиферацию и миграцию нейронов и индукции нескольких интерферон-стимулированных генов. Существенную роль CD8 + Т-клеток для контроля MCMV в центральной нервной системе также сообщалось той же группой 13. Важным аспектом, который следует учитывать при анализе патологического эффекта микроб динамики заражаютиона. В случае MCMV, это особенно важно для изучения и количественной оценки прогрессирования вирусного распространение в развивающемся мозге, чтобы понять и предвидеть величину будущих нейробиологическое травм. Традиционно, количественное прогрессирование инфекции требуется регулярное жертву инфицированных животных титра возбудителя в тканях, таких как мозг, которые в противном случае недоступны. Этот тип протокола теперь оспорены необходимым улучшение благополучия животных и 3Rs (Сокращение, уточнить, заменить) принципы 14. Использование в естественных условиях технологии визуализации может позволить резкое сокращение числа животных, которые необходимы в естественных условиях эксперименты инфекции. Здесь мы приводим и описывают временной ход анализа вирусной распространение в мозге после внутрибрюшинного MCMV-Luc инъекции мышь новорожденных. Используя ту же самую животных, мы отслеживать и контролировать в естественных местах интенсивного VIRAL репликации во время 2-недельного периода.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка вирусную суспензию
- Получен штамм Смита MCMV выражения люциферазы (MCMV-Люк 15) из лаборатории Ульриха Koszninowski автора. В этой рекомбинантной люциферазы ген встраивают в ie2 локус генома MCMV.
- Для усиления MCMV-Люк, заразить мышиный стромы костного мозга клеточной линии (M2-10B4, АТСС CRL-1972) с MCMV на разных множественности заражения (МВД, от 0,001 до 1) 16. Для этого добавьте вируса культивируемых клеток в бессывороточной среде при 37 ° С. После одного часа, удалить супернатант и заменить его DMEM с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка (FCS). Пять дней спустя, не урожай культуральной среды и магазин аликвоты при -80 ° С до дальнейшего использования.
- Титрование вирусной суспензии по тесту с посевом.
- Разделение 3T3 клетки (АТСС # CRL-1658), в 24-луночный планшет при 40000 клеток / лунку в 1 мл DMEM с добавлением 10% FCS, содержащей пенициллин (200 МЕ / мл) и steptomycin (200 мг / мл) И инкубируют 24 ч при 37 ° С.
- Подготовка серийных разведений (10 -1 до 10 -8) аликвоты MCMV суспензии в среде DMEM и заражают клетки-мишени (3T3) с 200 мкл разведений после удаления клеточной культуральной среде. Инкубируют 1 час при 37 ° С. Добавить 1 мл Top среде Игла (DMEM 3% FCS, 2% (об / об), гентамицин, 200 МЕ / мл пенициллина, 200 мг / мл стрептомицина, 8 г / л карбоксиметилцеллюлоза) и инкубируют 5 дней при 37 ° С.
- Закрепить клетки путем добавления 200 мкл 10%-ного формальдегида (разведение формальдегида с водой должно быть сделано в химическом колпаком, чтобы токсичные ингаляции) в каждую лунку, и инкубацию 6 ч при комнатной температуре. Удалить культуральной среды + фиксатор с помощью пипетки, и добавляют 200 мкл раствора окрашивания клетки (1% кристаллическим фиолетовым (вес / объем) в 20%-ном этаноле). Перед употреблением развести 1 блок на 9 частей Milli-Q воды. Выдержите 2 мин при комнатной температуре, мыть пластины 3-4x, погрузив его в воду, дайте высохнуть и подсчитать количество бляшек в бинокль.
<li> Развести MCMV-Люк в DMEM с получением 50 блоков PFU в 50 мкл и выйти на лед до последующего использования. Использование высоких вирусных посевного вызывает летальность до достижения новорожденным 2-3 недельного возраста. По нашему опыту, 500 блоков PFU вызывают летальности у каждого новорожденного от 5 до 7 дней после инъекции.
2. Инъекции новорожденных
- Когда новорожденные (от 4 до 20 ч-старых мышей) доступны, манипулировать мусора и фекалий клетку с перчатки перед обработкой тщательно щенков, чтобы избежать загрязнения с «чужих» запахов, которые хотели бы подчеркнуть, матери и вызвать отказ от щенков .
- Выполнение внутрибрюшинной инъекции с использованием инсулиновый шприц (29 г), как показано на фиг.1А. Держите новорожденных при коже спины. С брюшной стороне, вводим иглу под переднюю ногу и аккуратно прижмите его подкожно достичь брюшной полости (немного под пупком). Мы в настоящее время вводят 1% метиленового синего разводят в DPBS и контролировать выживания рractice метод перед выполнением вирусных инфекций. С Метиленовый синий отчетливо видна в процессе инъекции, рекомендуется выполнить это "обучение" инъекция сначала, чтобы гарантировать своевременную доставку вирусной суспензии в внутрибрюшинная полости.
- Устранить мелкие капли крови, которые могут возникнуть, и поместить новорожденного обратно в клетку.
3. Прижизненного изображения
- На 7 день обрабатывать новорожденных с той же предостерегает как уже упоминалось ранее. Введите внутрибрюшинно смесью анестетиков (4 мг / мл кетамина, 0,8 мг / мл ксилазина) и люциферин (0,15 мг / г массы тела) в 50 мкл каждого животного. Средний вес тела животных 1-2 г и доза животных анестезирующие средства на это: кетамин 40 мг, ксилазина 8 мкг Подождите 12-15 минут, пока люциферин не достигнет своего максимума излучения. Это должно быть определено заранее и зависит от поставщика люциферином и системы формирования изображения использованы.
- В то время как щенки anesthetiзет, пометить их для последующей идентификации и урожай небольшой кусок ткани, которые затем могут быть использованы для будущего генотипирования если мутантных животных используются.
- Поместите щенков в системе формирования изображения и выполнять приобретение света, излучаемого на весь организм. Семь дней после заражения, вирус реплицируется в многочисленные копии в органах-мишенях, таких как печень, почки, легкие и слюнных желез, поэтому продолжительность воздействия должны быть короткими. В нашем случае, мы выполняем приобретении от 10 до 20 сек (рис. 1В). Платформа в приобретении камеры устройство обработки изображений должен быть нагрет, чтобы избежать чрезмерного охлаждения температуры тела животных под наркозом. Кроме того, это полезно для получения изображения с низким разрешением нескольких животных в течение одного раунда приобретения, а затем двигаться вверх платформу ближе к объектив камеры для того, чтобы сосредоточиться на одной частью конкретного животного или изолированный орган после вскрытия. Программное обеспечение должно включать быстрые измененияпараметров (время экспозиции, расстояние образец / объектива, чувствительность), количественная оценка определенных регионах интересов и будущего экспорта Снимки изображений.
- Для получения светового сигнала от головы только, охватывают тело новорожденных лежащий сбоку с толстым, темно бумаги, который будет маскировать фотонов, излучаемых на уровне органов, где высокий уровень вирусной репликации (печени, легких, слюнных желез) и выполнять Приобретение от 5 до 10 мин (рис. 1в). Выполнение приобретение противоположной стороне животного в тех же условиях.
- Вновь щенков в клетку и поместить нагревательную лампу на вершине, чтобы избежать чрезмерного охлаждения под наркозом новорожденных. Регулярный мониторинг пост-анестетик восстановления. С указанной дозы, анестезии в настоящее время длится 30 мин.
- Повторите ту же процедуру в дни 9, 11 и 14. В те дни, 11 и 14, изменить дозу анестетика (6 мг / мл кетамина, 1,2 мг / мл ксилазина).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Репрезентативного эксперимента показан на рисунке 1. После внутрибрюшинного введения 50 блоков PFU из MCMV-Luc (Панель А показывает аналогичную инъекцию выполнены с метиленовым синим, чтобы визуализировать маршрут подкожной иглы), новорожденные анестезировали и получены одновременно 0,3 мг субстрата люциферазы (люциферин, суппорт). Через пятнадцать минут животных помещали брюшной стороне в приобретении камеры IVIS 50 (В системе естественных изображений, суппорт) и света, излучаемого целого животного была захвачена в течение 10 сек экспозиции. Панель В показывает снимок изображения, снятые в дни 7, 9, 11 и 14 с программным обеспечением (живой образ 3.2, суппорт) предназначен для анализа. Изображения были откалиброваны с теми же настройками: Max излучения установлен на уровне 10 7 фотонов в секунду (р / с) и 10 мин при 6 р / с. От этих картин, кажется, что общий титр вируса во всем животным со временем уменьшается. Количественная оценка люминесценции выполняется с той же программное обеспечение подтверждает это наблюдение (не показано). Далее, мы рассмотрели все тело, кроме головы, в животное с густой, темной бумаги, который предотвращает фотонов, испускаемых органах, таких как легкие, печень, почки и слюнных желез быть обнаружены с помощью цифровой камеры. Это обеспечивает длительное воздействие (5 мин в нашем случае) и показывает дискретное пятно на уровне левого уха, интенсивность которого увеличивается от 7 день и на 14-й день (панель С). Сигнал также отображается в нижней челюсти и нос животного. Изображения были созданы с Максом в 2000 р / с и 100 мин при P / сек. Этот эксперимент проводили на той же самой животной между 0 и день 14, указывает, что развитие вирусной инфекции могут быть записаны и количественно с этой технологией, и что распространение MCMV в мозг может быть динамически наблюдается в естественных условиях.
1.jpg "/>
Рисунок 1. Время курса анализа представителя новорожденных мышей, экспериментально зараженных люминесцентные цитомегаловирус. А. Внутрибрюшинной метиленового синего инъекции у новорожденных. Увеличенное изображение (справа) показывает путь подкожной инъекции на грудную клетку. В. В естественных изображений одного и того же новорожденного из 7-й день на 14 день после MCMV-Luc инъекции. Люминесценции от целого анестезированных животных визуализируется на люциферин инъекций и 10 сек экспозиции. С. люминесценции головы (левая сторона) одного и того же животного в день от 7 до 14. Закалка фотоны от остальной части тела с темной бумага обеспечивает более длительную экспозицию (5 мин).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование технологии в естественных изображений для мониторинга MCMV-Люк распространение в новорожденных мышей, мы смогли наблюдать распространение вируса в мозг мутантных животных, в отличие от дикого типа. Далее вскрытие животного и бывший естественных изображений мозга подтвердили наличие люминесцентного вируса в центральную нервную систему. Кроме того, мы также провели иммуногистохимии (не показано) на тонких срезах мозга с антителом, специфичным для MCMV E1 ранних белков и отметил, что действительно, MCMV присутствует в той же области, как те, в которых было обнаружено свечение, что указывает, что макроскопические визуализации света, излучаемого целом, живые анестезированных животных фактически отражает характеристики вирусная инфекция, которая происходит в естественных условиях.
Такой анализ широко используется для взрослых животных, например для контроля роста опухоли при имплантации люминесцентных клеток. В нашем случае, задача заключалась в использовании Neonaтес, для которого газообразный анестезии изофлураном доставлены в животное внутри камеры приобретение было невозможно по техническим причинам. Поэтому мы были вынуждены использовать кетамин / ксилазина инъекции, и мы адаптировали дозу на небольшой размер новорожденных. Мы также занимается щенков тщательно, чтобы избежать риска отторжения их матерью. Следуя рекомендациям, и дозы, описанные здесь, и которые имеют решающее значение для безопасной манипуляции и исход из щенков, анестезии новорожденных становится альтернативой жизнеспособный вариант, который позволяет длительные периоды неподвижности, необходимых для выполнения в естественных изображений.
Кроме того, поскольку люминесценции уровень может быть определена количественно с соответствующим программным обеспечением, мы показали, что развитие инфекции в течение 2-недельного периода характеризуется снижением вирусной нагрузки в брюшной органов (печени, селезенки, почек) и легких, в то время как распространение вируса в мозге могут постепенно быть подтверждена. Thявляется наблюдение, которое можно было наблюдать у мутантных животных, а не в контрольной группе, будут документироваться с более подробной информации и статистического анализа в рукопись в подготовке где природа видоизмененный ген также будет обсуждаться. Тем не менее, наш метод визуализации представляет собой значительное улучшение по сравнению с классическими методами эвтаназии, которая требует нескольких животных для каждого момента времени, после чего времени и ресурсов методами (методом бляшек или количественной ПЦР) для измерения титров вируса в гомогенатах, полученных от различных органов на рассечение. Это также в соответствии с руководящими принципами этики экспериментов на животных, которые требуют постоянных усилий, чтобы минимизировать количестве, достаточном для достижения статистической значимости. Наконец, еще одно преимущество в том же животного (Tagged на 7 день) в течение всего времени эксперимента заключается в снижении между индивидуальными вариациями. В результате количественного сделаны в каждый момент времени (дни 7, 9, 11 и 14) перфорацияORMED на группу из 6 новорожденных значительно повышает статистическую значимость результатов (данные не показаны).
В настоящее время мы используем эту методологию для анализа влияния мутаций у мышей на распространение MCMV и рукописи в настоящее время готовятся отчеты дополнены вирусное распространение в мозге мутантных животных. Наш опыт показывает, что сравнение группа из 5-6 мутантов к эквивалентной группе контрольных новорожденных, обеспечивает высокое качество и важные данные. Мы, однако, не считают эту методику подходит для скрининга phenodeviants порожденных случайными программы мутагенеза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конкурирующих финансовых интересов.
Этика заявление
Животные содержались в беспатогенной условий на объекте по уходу за животными из Institut d'Immunologie др. d'Hématologie. Обращение с мышами и экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с французским законом о защите лабораторных животных. Порядок был утвержден службой vétérinaire-де-ла префектуру Du Bas-Rhin (Франция) в соответствии с полномочиями число-67-345.
Acknowledgments
Мы благодарим Ли Tuddenham (IBMC, Страсбург) для усиления и титрования MCMV-Люк и Томас Baumert (INSERM U748, Страсбург) за разрешение использовать вивария Института вирусологии. Финансовая поддержка со стороны INSERM, Университет Страсбурга и Национальное агентство La Recherche (ANR-08-MIEN-005-01) признается. Первоначальная участием Соня Beroud и Летиция Lelieur во время их главный проект также признается.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| DMEM | Fisher Scientific | W3523A | |
| Methylen blue | Sigma Aldrich | 319112 | |
| Insulin needles | VWR | 613-4897 | |
| Ketamine | CentraVet | Ket 201 | |
| Xylazine/Vetranal | Sigma Aldrich | 46995 | |
| DPBS | DUTSCHER | P0436500 | |
| Luciferin | Caliper | 760504 | |
| gentamycin | Sigma Aldrich | G1272 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15070 | |
| carboxymethylcellulose | Sigma Aldrich | C4888 | |
| formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| crystal violet | Sigma Aldrich | C3886 | |
| Equipment | |||
| IVIS 50 | Caliper/Perkin Elmer | ||
References
- Loewendorf, A., Benedict, C. A. Modulation of host innate and adaptive immune defenses by cytomegalovirus: timing is everything. J. Intern. Med. 267, 483-501 (2010).
- Lischka, P., Zimmermann, H. Antiviral strategies to combat cytomegalovirus infections in transplant recipients. Curr. Opin. Pharmacol. 8, 541-548 (2008).
- Johnsen, J. I., Baryawno, N., Soderberg-Naucler, C. Is human cytomegalovirus a target in cancer therapy? Oncotarget. 2, 1329-1338 (2011).
- Morein, B., Abusugra, I., Blomqvist, G.
- Zaghouani, H., Hoeman, C. M., Adkins, B. Neonatal immunity: faulty T-helpers and the shortcomings of dendritic cells. Trends Immunol. 30, 585-591 (2009).
- Morein, B., Blomqvist, G., Hu, K.
- Cheeran, M. C., Lokensgard, J. R., Schleiss, M. R. Neuropathogenesis of congenital cytomegalovirus infection: disease mechanisms and prospects for intervention. Clin. Microbiol. Rev. 22, 99-126 (2009).
- Tsutsui, Y. Effects of cytomegalovirus infection on embryogenesis and brain development. Congenit. Anom. (Kyoto). 49, 47-55 (2009).
- Sancho-Shimizu, V., et al. Genetic susceptibility to herpes simplex virus 1 encephalitis in mice and humans. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 7, 495-505 (2007).
- Crozat, K., et al. Analysis of the MCMV resistome by ENU mutagenesis. Mamm. Genome. 17, 398-406 (2006).
- Juanjuan, C., et al. Murine model for congenital CMV infection and hearing impairment. Virol. J. 8, 70 (2011).
- Koontz, T., et al. Altered development of the brain after focal herpesvirus infection of the central nervous system. J. Exp. Med. 205, 423-435 (2008).
- Bantug, G. R., et al. CD8+ T lymphocytes control murine cytomegalovirus replication in the central nervous system of newborn animals. J. Immunol. 181, 2111-2123 (2008).
- Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1245, 14-16 (2011).
- Sacher, T., et al. The role of cell types in cytomegalovirus infection in vivo. Eur. J. Cell Biol. 91, 70-77 (2012).
- Lutarewych, M. A., et al. Propagation and titration of murine cytomegalovirus in a continuous bone marrow-derived stromal cell line (M2-10B4). J. Virol. Methods. 68, 193-198 (1997).
