Summary
Humant cytomegalovirus (HCMV) infektion av nyfödda är en viktig orsak till psykisk utvecklingsstörning, men de molekylära händelser som leder till virus-inducerad patogenes är fortfarande dåligt kända. För att undersöka dynamiken hos hjärnans infektion, anpassade vi hela djur
Abstract
Humant cytomegalovirus (HCMV eller HHV-5) är en livshotande patogen i immun-äventyras individer. Vid medfödd eller neonatal infektion, kan viruset infektera och replikeras i den växande hjärnan, vilket kan leda till allvarliga neurologiska skador, inklusive dövhet och mental retardation. Trots den potentiella symtomens svårighetsgrad, är de terapeutiska alternativen begränsade av otillgängligheten av ett vaccin och avsaknaden av en specifik antiviral terapi. Vidare är en exakt beskrivning av de molekylära händelser som inträffar under infektion i det centrala nervsystemet (CNS) saknas fortfarande eftersom observationer mestadels härrör från obduktionen av infekterade barn. Flera djurmodeller såsom Rhesusapa CMV, har utvecklats och gav viktiga insikter i CMV patogenes i CNS. Men trots sin evolutionära närhet med människor, har denna modell begränsas av intrakraniell ympning förfarande som används för att infektera djur och nackdelaristently framkalla CNS infektion. Dessutom har etiska överväganden främjat utvecklingen av alternativa modeller, bland vilka neonatal infektion i nyfödda möss med musen cytomegalovirus (MCMV) nyligen har lett till betydande framsteg. Exempelvis rapporterades det att intraperitoneal injektion av MCMV till Balb / c nyfödda leder till infektion av nervceller och gliaceller i specifika områden av hjärnan. Dessa fynd tyder på att experimentell ympning av möss kan rekapitulera de brister inducerade av HCMV-infektion hos barn. Ändå är en dynamisk analys av MCMV infektion hos nyfödda svåra att utföra på grund klassisk metod kräver uppoffringar av ett betydande antal djur vid olika tidpunkter för att analysera virala börda och / eller immun-relaterade parametrar. För att kringgå denna flaskhals och för att möjliggöra framtida undersökningar av sällsynta muterade djur, tillämpade vi in vivo imaging-teknik för att utföra ett tidsförlopp analys av viral spridning i hjärnan vid perifer injektion av en rekombinant MCMV uttrycker luciferas till C57BL / 6 nyfödda.
Introduction
Humant cytomegalovirus (HCMV/HHV-5) är en medlem av β-herpesvirus familjen. HCMV är ett mycket vanligt förekommande, opportunistisk patogen som oftast förvärvas under tidiga liv som en asymtomatisk infektion 1. Liksom alla herpesvirus, kvarstår HCMV hela livslängd värd vars immunsystem tätt kontrollerar virusreplikation. Episoder av viral reaktivering sker oftast med nedsatt immunförsvar såsom transplanterade patienter som använder läkemedel för att förhindra avstötning av transplantat 2. Hos vuxna har HCMV också varit knuten till glioblastomas 3. Dessutom är HCMV en framträdande patogen för nyfödda med omogen immunitet 4-6. Primär infektion i det växande fostret eller nyfödda kan få allvarliga konsekvenser. HCMV infektion är den vanligaste infektiösa orsaken till medfödda missbildningar och sjukdomar barndom i utvecklade länder. Det uppskattas att incidensen av neonatal HCMV infektion drabbar 0,5-1% of alla levande födda bland vilka 5-10% kommer att drabbas av svåra symtom såsom mikrocefali eller cerebellär hypoplasi. Dessutom kommer 10% av de smittade spädbarn med subklinisk virusinfektion utvecklas senare följdtillstånd leder till mental retardation, hörselnedsättning, synfel eller beslag och epilepsi 7,8.
Till skillnad från andra humana herpesvirus såsom Herpes Simplex 1 (HSV-1/HHV-1) som kan ympas till möss via olika vägar för injektion 9, är cytomegalovirus replikation artspecifik. Denna funktion har allvarligt försvårat utredningar av HCMV patogenes som utförs i olika djurmodeller (mus, råtta, marsvin, rhesusapa) och deras respektive äkta värdspecifika CMVs. Alla CMVs uppvisar betydande likheter i genomet storlek och organisation, vävnad tropism och reglering av genuttryck. De framkallar också liknande patologier i sina respektive värd. Trots genomisk mångfald varamellan HCMV och mus cytomegalovirus (MCMV) (50% av de ORF som finns i mänskligt virus identifieras i murina CMV), har den musmodell visat nyligen att vara fördelaktigt, främst eftersom mutantstammarna kan testas för sin förmåga att styra viral replikation in vivo. Detta har lett till en genetisk skärm som möjliggjorde en beräkning av det antal av mus gener som uttrycks i sitt vuxna stadium som bildar den "resistome" till detta virus 10. Sammantaget talar detta för att MCMV-infekterade möss utgör en attraktiv modell för studier av värd-virus interaktioner hos vuxna. Utforskandet av kongenital CMV-infektion är mer komplicerad eftersom skillnader i moderkakan skikt organisation mellan människa och möss försämrar mor-till-foster överföring av virusinfektion hos möss. Nyligen har direktinsprutning av MCMV i moderkakan på dag 12,5 av dräktigheten aktiverat hjärna infektion av möss nyfödda som ledde till hörselnedsättning 11. Men de flesta jagnvestigations använder nu intraperitoneal injektion av 4-20 tim-gamla nyfödda för att ge systemisk viral spridning kan leda till hematogen hjärnan infektion, en modell som är mer relevant än en intrakraniell injektion. Detta protokoll gav viktiga insikter i CMV patogenes och närmare bestämt, visades det att MCMV infektion av nyfödda resulterar i virusreplikation i neuronala och gliaceller belägna i inflammatoriska foci som är infiltrerade med mononukleära celler såsom makrofager 12. Denna rapport beskrivs också förändrat morfogenesen av lillhjärnan tillsammans med minskad granulat neuron proliferation och migration samt induktion av flera interferon-stimulerade gener. Den viktiga roll CD8 + T-celler för bekämpning av MCMV i det centrala nervsystemet har också rapporterats av samma grupp 13. En viktig aspekt att beakta när man analyserar den patologiska effekten av en mikrob är dynamiken i infekterajon. I fallet MCMV, är det särskilt viktigt att undersöka och kvantifiera utvecklingen av viral spridning i den växande hjärnan för att förstå och förutse storleken på de framtida neurobiologiska skador. Traditionellt kräver en kvantifiering av progressionen av en infektion den regelbundna offret av infekterade djur att titrera patogenen i vävnader, såsom hjärnan, som i övrigt är oåtkomliga. Denna typ av protokoll som nu utmanas av nödvändig förbättring av djurskyddet och 3R (Reduce, Begränsa, Ersätt) principer 14. Använda in vivo imaging-teknik kan tillåta en drastisk minskning av antalet djur som behövs in vivo-infektion experiment. Här rapporterar vi och beskriva ett tidsförlopp analys av viral spridning i hjärnan vid intraperitoneal MCMV-Luc injektion till mus nyfödda. Med samma djur, spårade vi och övervakas i vivo platserna för intensiv VIral replikation under en två-veckors period.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Framställning av virussuspension
- Skaffa Smith stam av MCMV uttrycka Luciferase (MCMV-Luc 15) från Ulrich Koszninowski laboratorium. I denna rekombinant, är luciferasgenen insatt i IE2 geometriska orten för MCMV-genomet.
- Att förstärka MCMV-Luc, infektera en mus benmärg stromal cellinje (M2-10B4, ATCC # CRL-1972) med MCMV vid olika mångfald av infektion (MOI, 0,001 till 1) 16. För detta, tillsätt virus till odlade celler i serumfritt medium vid 37 ° C. Efter en timme, avlägsna supernatanten och ersätta den med DMEM kompletterat med 10% fetalt kalvserum (FCS). Fem dagar senare, skörda odlingsmedium och alikvoter förvaras vid -80 ° C fram till användning.
- Titrering av den virala suspensionen genom plackanalys.
- Split 3T3-celler (ATCC # CRL-1658) i en 24 brunnars platta vid 40000 celler / brunn i 1 ml DMEM kompletterat med 10% FCS innehållande penicillin (200 lU / ml) och steptomycin (200 mg / ml) Och inkubera 24 timmar vid 37 ° C.
- Bered seriespädningar (10 -1 till 10 -8) av en alikvot av MCMV suspension i DMEM och infektera målceller (3T3) med 200 | il av spädning efter avlägsnande cellodlingsmedium. Inkubera 1 timme vid 37 ° C. Tillsätt 1 ml Top Medium (DMEM 3% FCS, 2% (volym / volym) gentamycin, 200 lU / ml penicillin, 200 mg / ml streptomycin, 8 g / L Karboximetylcellulosa) och inkubera 5 dagar vid 37 ° C.
- Fixera cellerna genom tillsats av 200 | il 10% formaldehyd (utspädning av formaldehyd med vatten bör göras i en kemisk huv för att undvika toxiska inhalationer) till varje brunn, och inkubering 6 h vid rumstemperatur. Avlägsna odlingsmedium + fixeringsanordningen genom att pipettera ut och tillsätt 200 | il lösning cellfärgning (1% kristallviolett (vikt / volym) i 20% etanol). Före användning, späd 1 del med 9 delar milli-Q-vatten. Inkubera 2 minuter vid rumstemperatur, tvätta plattan 3-4x genom att blötlägga den i vatten, låt torka och räkna antalet plack med en kikare.
<li> Späd MCMV-Luc i DMEM att erhålla 50 PFU i 50 ^ och lämna på is tills vidare användning. Använda högre virala inoculums inducerar dödlighet innan de nyfödda når 2-3 veckors ålder. I vår erfarenhet, 500 PFU inducerar dödlighet i vart neonate 5 till 7 dagar efter injektionen.
2. Injektion av Nyfödda
- När nyfödda (4 till 20 timmar gamla möss) är tillgängliga, manipulera strö och avföring från buren med handskar innan man försiktigt hanterar valparna för att undvika kontaminering med "främmande" lukter som skulle betona mor och inducerar avstötning av valparna .
- Utför en intraperitoneal injektion med användning av en insulinspruta (29 G) såsom visas i fig. 1A. Håll det nyfödda barnet med den dorsala huden. Med ventrala sidan uppåt, införa nålen under framben och tryck försiktigt subkutant uppnå i bukhålan (lite under naveln). Vi injicerar för närvarande 1% Metylenblått utspädd i DPBS och övervaka överlevnad till practice tekniken innan du utför virusinfektioner. Eftersom Metylenblått syns tydligt under injektionen processen, rekommenderar vi att du utför denna "utbildning" injektion först för att säkerställa korrekt leverans av virussuspensionen i intraperitoneal hålighet.
- Eliminera de små bloddroppar som kan uppstå och placera den neonatala tillbaka in i buren.
3. In vivo Imaging
- På dag 7, hantera nyfödda med samma varningar såsom tidigare nämnts. Injicera intraperitonealt en blandning av anestetika (4 mg / ml ketamin, 0,8 mg / ml xylazin) och luciferin (0,15 mg / g kroppsvikt) i 50 ul i varje djur. Genomsnittlig kroppsvikt hos djuren är 1-2 g och dosen av bedövningsmedel per djur är: ketamin 40 mikrogram, xylazin 8 pg Vänta 12-15 min tills luciferin når sitt maximum av utsläpp. Detta måste bestämmas i förväg och beror på luciferin leverantören och bildsystem som används.
- Medan valparna är anesthetiZed, tagga dem för framtida identifiering och skörda en liten bit vävnad som sedan kan användas för framtida genotypning om muterade djur används.
- Placera de PUP i avbildningssystemet och utför förvärv av det utsända ljuset från hela kroppen. Sju dagar efter infektion, har viruset replikeras i flera kopior i målorgan såsom lever, njurar, lungor och spottkörtlar, och därför bör exponeringstiden vara kort. I vårt fall utför vi förvärvet under 10 till 20 sekunder (Figur 1B). Plattformen i förvärvet kammare av avbildningsanordningen behöver värmas för att förhindra överdriven kylning av kroppstemperaturen hos sövda djur. Dessutom är det bra att få lågupplösta bilder på flera djur inom en runda av förvärv och sedan flytta upp plattformen närmare kameralinsen för att fokusera på en del av ett visst djur eller ett isolerat organ efter dissektion. Programvaran måste aktivera snabba förändringarav parametrarna (exponeringstid, avstånd prov / objektiv, känslighet), kvantifiering av definierade områden av intresse och framtida export av ögonblicksbilder.
- Att förvärva ljussignal från huvudet bara, täcka kroppen av de nyfödda som ligger i sidled med ett tjockt, mörkt papper som kommer att maskera fotoner som emitteras i nivå med de organ där hög virusreplikation inträffar (lever, lungor, spottkörtlar) och utför förvärv under 5 till 10 min (Figur 1C). Utför förvärv av den motsatta sidan av djuret under samma betingelser.
- Återinföra valparna in i buren och placera en värmelampa ovanpå för att undvika överdriven kylning av sövda nyfödda. Regelbundet övervaka efter anestesi återhämtning. Med den angivna dosen, varar anestesi närvarande 30 min.
- Upprepa samma procedur på dagarna 9, 11 och 14. På dag 11 och 14, ändra dosen av bedövningsmedel (6 mg / ml ketamin, 1,2 mg / ml xylazin).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett representativt experiment illustreras i figur 1. Efter intraperitoneal injektion av 50 PFU av MCMV-Luc (Panel A visar en liknande injektion utförs med Metylenblått att visualisera subkutana nålen), var nyfödda sövdes och fick samtidigt 0,3 mg av luciferassubstrat (Luciferin, klave). Femton minuter senare placerades djuren ventrala sidan uppåt i förvärvet kammare IVIS 50 (In Vivo Imaging System, klave) och ljuset från hela djuret fångades under en 10 sek exponering. Panel B visar ögonblicksbilder tagna på dag 7, 9, 11 och 14 med programvaran (Living Image 3.2, klave) avsedd för analysen. Bilderna kalibrerades med samma inställningar: Max emission är satt till 10 7 fotoner per sekund (p / s) och min vid 10 6 p / sek. Från dessa bilder framgår det att den totala virala titern i hela djuret minskar med tiden. Kvantifiering av den luminiscens som utförs med samma programvara bekräftar denna observation (ej visad). Därefter täckte vi hela kroppen utom huvudet, av djuret med en tjock, mörkt papper som förhindrar de fotoner som emitteras av organ såsom lungor, lever, njurar och spottkörtlar som skall detekteras av den digitala kameran. Detta möjliggör längre exponering (5 min i vårt fall) och avslöjar en diskret plats vid nivån för vänster öra vars intensitet ökar mellan dag 7 och dag 14 (panel C). En signal uppträder också vid underkäken och näsan av djuret. Bilder sattes med ett max på 2,000 p / s och min vid 100 p / sek. Detta experiment, som utförs på samma djur mellan dag 0 och dag 14, visar att utvecklingen av virusinfektion kan registreras och kvantifieras med denna teknik och att spridningen av MCMV till hjärnan kan dynamiskt observerats in vivo.
1.jpg "/>
Figur 1. Time-kurs analys av ett representativt mus nyfödda experimentellt smittade med en självlysande cytomegalovirus. A. Intraperitoneal metylenblått injektion hos nyfödda. Den förstorade bilden (till höger) visar den subkutana vägen för injektion på bröstkorgen. B. In vivo avbildning av samma nyfödda från dag 7 till dag 14 efter MCMV-Luc injektion. Luminiscens från hela sövda djur visualiseras på luciferin injektion och 10 sek exponering. C. Luminescens avges av huvudet (vänster) av samma djur på dagarna 7 till 14. Släckning fotonerna från resten av kroppen med ett mörkt papper ger längre exponeringstid (5 min).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Använda in vivo imaging-teknik för att övervaka MCMV-Luc spridning i möss nyfödda, kunde vi konstatera viral spridning till hjärnan av muterade djur, i motsats till vildtyp. Ytterligare dissektion av djuret och ex vivo-avbildning av hjärnan bekräftade närvaron av luminescerande virus i det centrala nervsystemet. Dessutom utförde vi också immunohistokemi (ej visad) på hjärnan tunna sektioner med en antikropp specifik för MCMV E1 tidig protein och konstaterar faktiskt är MCMV närvarande i samma områden som de i vilka luminiscens detekterades, vilket visar att makroskopisk visualisering av det utsända ljuset från hela, levande sövda djur speglar faktiskt egenskaper virusinfektion som sker in vivo.
Sådana analyser har använts i stor utsträckning för vuxna djur, till exempel för att övervaka tumörtillväxt vid implantation av självlysande celler. I vårt fall var utmaningen att använda neonates för vilka den gasformiga anestesi med isofluran levereras till djuret inuti förvärvet kammaren inte var möjligt av tekniska skäl. Därför var vi tvungna att använda ketamin / xylazin injektion och vi anpassat dosen till den lilla storleken på nyfödda. Vi hanterade även valparna noga för att undvika risken för avstötning av sin mamma. Genom att följa de rekommendationer och doser som beskrivs här, och som är avgörande för en säker hantering och resultatet av valparna, anestesi av nyfödda blir en alternativ hållbart alternativ som möjliggör långa perioder av orörlighet som krävs för att utföra in vivo imaging.
Eftersom vidare luminescens nivån kan kvantifieras med lämplig programvara, visade vi att progressionen av infektionen under en två-veckors period kännetecknas av en minskad viral last i de peritoneala organ (lever, mjälte, njurar) och lungorna, medan virus sprids i hjärnan kan gradvis bevisas. Thär observation, vilket märktes i muterade djur och inte i kontrollerna, kommer att dokumenteras med mer detaljer och en statistisk analys i ett manuskript under utarbetande, där arten av den muterade genen kommer också att diskuteras. Ändå utgör vår avbildningsmetod en betydande förbättring jämfört med de klassiska tekniker som kräver dödshjälp av flera djur för varje tidpunkt, följt av tid-och resurskrävande metoder (plack analys eller kvantitativ PCR) för att mäta virustitrar i homogenat framställda från olika organ vid dissektion. Detta är också i linje med de etiska principerna för djurförsök som kräver ständigt arbete med att minimera antalet tillräckliga för att nå statistisk signifikans. Slutligen är en annan fördel med att följa samma djuret (taggad vid dag 7) under hela experimentets varaktighet för att minska inter-individuella variationer. Som ett resultat, gjorde kvantifiering vid varje tidpunkt (dag 7, 9, 11 och 14) perfOrmed på en grupp av sex nyfödda avsevärt förbättrar den statistiska signifikansen av resultaten (data ej visade).
Vi använder för närvarande denna metod för att analysera effekterna av mutationer i möss på spridning av MCMV och ett manuskript håller på att utarbetas rapporter augmented viral spridning i hjärnan av muterade djur. Vår erfarenhet visar att jämföra en grupp av 5-6 mutanter till en motsvarande grupp av kontrollåtgärder nyfödda tillhandahåller högkvalitativa och betydelsefulla uppgifter. Vi vet dock inte överväga denna metod lämplig för screening av phenodeviants genereras av en slumpmässig mutagenes program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen konkurrerande ekonomiska intressen.
Ethics uttalande
Djuren hölls under patogenfria betingelser inom djurvård anläggningen av Institut d'Immunologie et d'hématologie. Hantering av möss och experimentella procedurer utfördes i enlighet med den franska lagen om skydd av försöksdjur. Förfarandet godkändes av tjänsten schweiziska de la Préfecture du Bas-Rhin (Frankrike) under godkännandenummer A-67 till 345.
Acknowledgments
Vi tackar Lee Tuddenham (IBMC, Strasbourg) för att förstärka och titrera MCMV-Luc och Thomas Baumert (INSERM U748, Strasbourg) om tillstånd att använda djuranläggningen av Institutet för virologi. Finansiellt stöd från INSERM, Université de Strasbourg och Agence Nationale de la Recherche (ANR-08-MIEN-005-01) är erkänt. Den initiala deltagande Sonia Beroud och Laetitia Lelieur under deras examensarbete är också erkänt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| DMEM | Fisher Scientific | W3523A | |
| Methylen blue | Sigma Aldrich | 319112 | |
| Insulin needles | VWR | 613-4897 | |
| Ketamine | CentraVet | Ket 201 | |
| Xylazine/Vetranal | Sigma Aldrich | 46995 | |
| DPBS | DUTSCHER | P0436500 | |
| Luciferin | Caliper | 760504 | |
| gentamycin | Sigma Aldrich | G1272 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco | 15070 | |
| carboxymethylcellulose | Sigma Aldrich | C4888 | |
| formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| crystal violet | Sigma Aldrich | C3886 | |
| Equipment | |||
| IVIS 50 | Caliper/Perkin Elmer | ||
References
- Loewendorf, A., Benedict, C. A. Modulation of host innate and adaptive immune defenses by cytomegalovirus: timing is everything. J. Intern. Med. 267, 483-501 (2010).
- Lischka, P., Zimmermann, H. Antiviral strategies to combat cytomegalovirus infections in transplant recipients. Curr. Opin. Pharmacol. 8, 541-548 (2008).
- Johnsen, J. I., Baryawno, N., Soderberg-Naucler, C. Is human cytomegalovirus a target in cancer therapy? Oncotarget. 2, 1329-1338 (2011).
- Morein, B., Abusugra, I., Blomqvist, G.
- Zaghouani, H., Hoeman, C. M., Adkins, B. Neonatal immunity: faulty T-helpers and the shortcomings of dendritic cells. Trends Immunol. 30, 585-591 (2009).
- Morein, B., Blomqvist, G., Hu, K.
- Cheeran, M. C., Lokensgard, J. R., Schleiss, M. R. Neuropathogenesis of congenital cytomegalovirus infection: disease mechanisms and prospects for intervention. Clin. Microbiol. Rev. 22, 99-126 (2009).
- Tsutsui, Y. Effects of cytomegalovirus infection on embryogenesis and brain development. Congenit. Anom. (Kyoto). 49, 47-55 (2009).
- Sancho-Shimizu, V., et al. Genetic susceptibility to herpes simplex virus 1 encephalitis in mice and humans. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 7, 495-505 (2007).
- Crozat, K., et al. Analysis of the MCMV resistome by ENU mutagenesis. Mamm. Genome. 17, 398-406 (2006).
- Juanjuan, C., et al. Murine model for congenital CMV infection and hearing impairment. Virol. J. 8, 70 (2011).
- Koontz, T., et al. Altered development of the brain after focal herpesvirus infection of the central nervous system. J. Exp. Med. 205, 423-435 (2008).
- Bantug, G. R., et al. CD8+ T lymphocytes control murine cytomegalovirus replication in the central nervous system of newborn animals. J. Immunol. 181, 2111-2123 (2008).
- Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1245, 14-16 (2011).
- Sacher, T., et al. The role of cell types in cytomegalovirus infection in vivo. Eur. J. Cell Biol. 91, 70-77 (2012).
- Lutarewych, M. A., et al. Propagation and titration of murine cytomegalovirus in a continuous bone marrow-derived stromal cell line (M2-10B4). J. Virol. Methods. 68, 193-198 (1997).
