Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Permanent Cerebral Vessel Okklusjon Published: July 21, 2013 doi: 10.3791/50418
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1,2,3,4
1Department of Neurobiology & Behavior, University of California, Irvine, 2The Center for the Neurobiology of Learning and Memory, University of California, Irvine, 3The Center for Hearing Research, University of California, Irvine, 4Department of Biomedical Engineering, University of California, Irvine
* These authors contributed equally

Summary

Vi beskriver en svært reproduserbare metode for permanent okklusjon av en gnager store cerebrale blodkar. Denne teknikken kan oppnås med meget lite perifer skade, minimal blodtap, en høy grad av langvarig overlevelse, og konsistent infarktvolum i samsvar med den humane kliniske befolkning.

Abstract

Hjerneslag er en ledende årsak til død, uførhet, og sosioøkonomiske tap over hele verden. Majoriteten av alle slag skyldes et avbrudd i blodtilførselen (iskemi) 1. Mellom cerebral arterie (MCA) leverer et stort flertall av blod til den laterale overflate av hjernebarken 2, er den mest vanlige område av humant slag 3, og iskemi sitt territorium kan resultere i omfattende dysfunksjon eller død 1,4,5. Overlevende av hjerneinfarkt ofte lider tap eller avbrudd av motoriske evner, sensoriske underskudd, og infarkt. I et forsøk på å fange opp disse viktige kjennetegn ved hjerneslag, og dermed utvikle effektiv behandling, er en stor vekt lagt på dyremodeller av iskemi i MCA.

Her presenterer vi en metode for permanent tetter igjen en kortikale overflate blodåre. Vi vil presentere denne metoden ved hjelp av et eksempel på en relevant fartøy okklusjon som modellerer den vanligste typen, plassering og outcome av menneskelig slag, permanent midten cerebral arterie okklusjon (pMCAO). I denne modellen vi kirurgisk utsette MCA i voksen rotte og senere occlude via dobbel ligatur og transection av fartøyet. Dette pMCAO blokkerer kortikale proksimale gren av MCA, forårsaker iskemi i alle MCA kortikale territorium, en stor del av hjernebarken. Denne metoden for okklusjon kan også brukes til å okkludere mer distale partier av kortikale fartøy for å oppnå mer fokal iskemi rettet mot et mindre område av hjernebarken. De primære ulemper ved pMCAO er at den kirurgiske prosedyren er noe invasiv som en liten kraniotomi er nødvendig for å få tilgang til MCA, selv om dette resulterer i minimal vevsskade. De viktigste fordelene med denne modellen, derimot, er: åsted for okklusjon er godt definert, graden av blodstrøm reduksjon er konsistent, funksjonell og nevrologisk svekkelse skjer raskt, er infarktstørrelsen konsekvent, og den høye frekvensen av overlevelse gir lang Begrepet kronisk vurdering.

Introduction

For å indusere iskemiske tilstander som effektivt etterligner menneskelige iskemisk hjerneslag, er flere dyr takts modellene mye brukt, med varierende mengder infarkt som følge. I photothrombotic modellen, er hjernen bestråles gjennom den intakte skallen ved hjelp av laser-belysning etter intravenøs injeksjon av et fotofølsomt stoff (som rose-bengal), noe som resulterer i fotokjemisk koagulasjon, blokkering av de bestrålte fartøy, og iskemi innenfor omkringliggende vev 6, 7. Photothrombosis kan resultere i svært små, isolerte regioner av infarktet og brukes vanligvis som et middel for modellering "mini-slag", eller "mikro-slag".

Jo mer utbredt teknikk for fremkalling iskemisk slag, spesielt i middel-cerebral arterie (MCA), er den intraluminale monofilament modell 8 hvori et filament er kirurgisk innført i den ytre halsarterie og avansert til spissen tetter bunnen av MCA. En primary utfordringen med intraluminal filament okklusjon er høy dødelighet (70% når MCA er blokkert i 3 timer, et relevant tidspunkt for hjerneslag forskning) 9. Andre problemer med metoden inkludert mulig subaraknoidalblødning, ufullstendig okklusjon, og variabel infarktvolum 10,11. Denne modellen resulterer i en omfattende grad av infarktet både i cortex og subcortically 12, og modeller en massiv menneskelig slag.

Selv om både mikro-og massive takts modellene er viktige, menneskelige slag er vanligvis et sted i mellom. I store kliniske studier, hjerneslag infarkt varierer i størrelse 28-80 cm 3, som kan oversettes til 4,5 til 14% av ipsi-ishemic halvkule 9. Til sammenligning våre rotte pMCAO infarkt størrelse varierer fra ca 9-35 mm 3, som utgjør 3-12% av ipsi-ishemic halvkule. Vår pMCAO modell, derfor ligner menneskelige hjerneinfarkt infarkt volumer av prosentandel av hjernenvolum.

I tillegg til å modellere den strukturelle skader for slag, pMCAO resulterer i funksjonelle og adferdsmessige mangler lik den humane tilstand. På minimum, en effektiv modell av hjerneslag resulterer i bevegelse underskudd kontralaterale å stryke skade 13-15, tap eller avbrudd av motor og sensorisk funksjon 16,17, tap eller avbrudd av fremkalt neuronal aktivitet 16,18, reduksjoner i cerebral blodstrøm 19, 20, og infarkt 21,22. Følgelig våre pMCAO modeller en alvorlig okklusjon av MCA resulterer i fysisk funksjonshemming, tap av funksjon innenfor sensoriske cortex (og nabolandene cortices), forstyrrelse av neuronal aktivitet, en kraftig reduksjon i MCA blodstrøm, og infarkt-kjennetegn attributter av iskemisk hjerneslag 23 -25, og derfor tjener som en effektiv modell for menneskelig slag.

Prosedyremessig innebærer pMCAO en liten craniotomy der vi forsiktig fjerne hodeskallen og dura fraen 2 x 2 mm "kirurgisk vindu" over det første (M1) segment av MCA, like før den primære bifurkasjon av MCA inn i de fremre og bakre kortikale grener (figurene 1A og 1B). Vi passerer en halv kurve reverse cutting sutur nål og tråd (6-0 silke) gjennom pial lag av hjernehinnene, under MCA og over kortikale overflate (se tabell over spesifikke reagenser og utstyr for de kirurgiske forsyninger nødvendig for å utføre pMCAO ). Vi deretter knytte en dobbel ligatur, stram de to knop rundt MCA, og skjære over fartøy mellom de to knop. Den dobbel ligatur og transection gjennom M1 oppstår like distalt for lenticulostriate forgrening, slik at bare de grener av kortikale MCA påvirkes således-bare kortikale infarktvolum (ingen skade subkritisk) oppstår 26,27 (figur 2). Selv om menneskelige slag ofte innebærer subcortical infarktet, modellering dette hos gnagere krever økt invasivitet (occluding cerebral fartøy før cortical Branching krever tilgang arteries via carotisar i nakken og nødvendiggjør ytterligere occlusions) i teknikk og økt variasjon i infarktstørrelsen. Modellen er beskrevet her kan ikke utføres mer proksimalt som tilgang til tidligere grener av MCA er ikke mulig via en enkel craniotomy. Mens det kan være kirurgisk mulig å indusere en subcortical infarktet via pMCAO, ville okklusjon innebære en ekstremt inngrep og er derfor ikke ideelt.

Effektiviteten av okklusjon kan bekreftes via laser Doppler, eller laser spettet bildebehandling 12,24,25 (figur 3), eller histologisk post-mortem (figur 2). Det bør bemerkes at tidligere forskning har vist at sansestimulering kan spille en viktig rolle i utviklingen og utfallet av infarktet, overdragelse beskyttelse mot skader når det gis innen 2 timer av pMCAO og forårsaker en økning i hjerneslag skade når administrert i 3 hr post pMCAO 24,25,28. Vi har bekreftet at ved 5 timers post-pMCAO, stimulering ikke lenger har en effekt på resultatet (upubliserte data). Derfor bør sensorisk stimulering av fagene skal minimeres for 5 timer etter pMCAO å få infarkt volumer med minimal variasjon. Følgelig løper vår gruppe "ubehandlete kontroller" av denne type ved å holde rotter bedøvet i 5 t. post-pMCAO, i mørke, med minimal sensoriske stimuli, og uttrykkelig noen linje-stimulering.

Det bør videre bemerkes at sporadiske variasjon i MCA struktur, inkludert overdreven forgrening, flere primære segmenter, eller fraværet av kommuniserende arterier kan skje med en frekvens på 10 til 30% hos voksne hann Sprague Dawley-rotter 29,30. Dersom avvik i MCA er observert, er det ikke tilrådelig å bruke det aktuelle faget som å legge dyr med slike karlidelser vil øke infarktet variabilitet.

I tillegg er det flere praktiske sider ved our prosedyre som gjør dette okklusjon metoden fordelaktig for hjerneslag etterforskning. Først kan sting plasseres rundt arterien men ikke strammet til for å samle en baseline vurdering, etterfulgt av post-iskemisk vurdering etter ligatur og transection. På denne måte blir Kirurgiske preparater nødvendig for okklusjon kontrolleres effektivt for, innen fag. Fordi fagene kan forbli stasjonær eller innen en stereotaksisk ramme gjennom okklusjon, er det mulig å gjennomføre eksperimentell vurdering av hvert emne, før, under og etter okklusjon uten å flytte emnet eller forstyrre noen eksperimentelle utstyret i bruk 25,28. Videre denne prosedyren resulterer i en svært lav dødelighet, selv innenfor alderen gnager fagene 21-24 måneders alder (tilsvarer en eldre menneske) 31, og kan derfor brukes til å evaluere hjerneslag behandlinger hos rotter som nærmere modellere den vanligste aldersgruppe av hjerneslag lider 25,28. Fartøyet transection tjener også flere praktiske formål. Fravær av blødning etter transection bekrefter at fartøyet var helt tildekket på begge ligatur nettsteder. I tillegg sikrer transection en permanent forstyrrelse av blodstrøm. Endelig sikrer transection at enhver blodstrøm detektert i de distale deler av okkluderte fartøyet må komme fra en annen kilde.

Til slutt, selv om vi spesifikt beskrive denne okklusjon teknikk for MCA i dette manuskriptet og video, kan det samme dobbelt ligaturen transection teknikken brukes på alle cerebral fartøy som kan nås via craniotomy. Vårt laboratorium, for eksempel, benyttes pMCAO i forbindelse med flere andre permanente okklusjon av MCA distale grener for å blokkere både primær-og sikker-hetene blodstrømmen 24 på en måte som ligner på teknikker utformet for selektivt å indusere iskemi innenfor det primære somatosensory cortex 32..

Som konklusjon, tsin metode for permanent okklusjon anvendt på MCA nøye modeller tre primære aspekter av menneskelig hjerneinfarkt: den vanligste plassering (MCA), type (iskemi), og graden av skade (infarkt) forbundet med den menneskelige klinisk litteratur for slag. Videre kan denne metode for okklusjon anvendes til én eller flere stengbare steder i hjernen, og kan utføres i alderen individer med en høy sannsynlighet for overlevelse. Gitt den dynamiske, permanent, og relativt ikke-invasiv natur denne okklusjon, representerer denne teknikken et ekstra verktøy for prekliniske forskere vurdere nye tilnærminger for beskyttelse fra og behandling av hjerneslag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Komme i gang: Påkrevd kirurgiske instrumenter

Se figur 4.

  1. Dental drill (Kavo tannlegeutstyr, Modell: UMXL-TM), to-bit drill, og tre-bit drill
  2. To ~ 30 gauge sprøyte nåler
  3. Taggete pinsett, buede spissen valgfritt (kan være nyttig, men ikke avgjørende)
  4. To fine tips pinsett
  5. trådkuttere
  6. Sutur tråden
  7. Micro saks

2. Opprette Kirurgisk Window

  1. Anestesi: Prosedyrer er i samsvar med NIH retningslinjer og har blitt godkjent av UC Irvine Animal Care og bruk Committee. Eksperimentelle fag er 295-400 g Sprague Dawley hannrotter (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA) og følgende anestesi prosedyren brukes:
    1. Injisere rotte intraperitonealt med en bolus natriumpentobarbital (55 mg / kg kroppsvekt) etterfulgt av en intramuskulær injeksjon av atropin (0,05 mg / kg kroppsvekt) i hind etappe, og administreres 3,0 cc av 5% dekstrose i vann subkutant.
    2. Supplere natriumpentobarbital (27,5 mg / kg, kroppsvekt) injeksjoner som nødvendig. Administrere en ophthalmic antibiotisk salve til øynene for å beskytte hornhinner under følgende prosedyrer. Administrer 5% dekstrose (3 ml) og atropin (0,05 mg / kg, kroppsvekt) hver sjette time redusere luftveissekreter under anestesi. Mål kroppstemperaturen via en rektal probe, og opprettholde kroppstemperaturen ved 37 ° C med en selvregulerende varmeteppe.
  2. Finn MCA ved å enten:
    1. Tynning en 2 x 2 mm bildebehandling / visualisere vindu over somatosensoriske cortex ved hjelp av en størrelse HP 3 borekronen inntil skallen er nesten gjennomsiktig og deretter tynning til full åpenhet med en størrelse HP 2 borekronen. MCA plasseringen kan da sees gjennom dette vindu og dens proksimale bane benyttes til nøyaktig plassering av den første segmentet. MCA vil generelt kjøre diagonalt over dettevindu i en rostral til kaudal / ventral til dorsal retning (for eksempel venstre mot høyre / bunn til topp når du ser på venstre hemisfære fra kirurgens synspunkt). Den kirurgiske vinduet kan da opprettes ovenfor hvor observatøren estimerer M1 segment (proksimalt for kortikale forgrening) for å bli lokalisert ved en distal grener synlig gjennom det første vinduet. For å minimalisere mengden av skallen som fjernes for å få tilgang til MCA, bør avbildning / visualisere vindu være plassert i nærheten av, men atskilt fra det kirurgiske vinduet.
      Eller
    2. Et lite kirurgisk vinduet skal plasseres ca 3 mm anterior og 1 mm lateralt for foramen ovale eller underkjevens nerve, i nærheten av buen talerstolen 30,33,34. For effektivt å kunne få tilgang til spindelen av MCA (også kjent som den M1-segmentet), blir temporalis muskelen midlertidig reflekteres bort fra skallen overflate. (Merk: Når det gjelder langsiktige overlevelse operasjoner, har vår lab erfaring vært that ved at temporalis muskelen til å forbli festet til ankeret sitt, vil muskelen re-basepartilpasses til skallen overflaten, slik at for sunn mat oppførsel og effektivt vedlikehold av kroppsvekt.
  3. Følg MCA til rostral, ventral hjørne av bildebehandling vinduet (hvis du bruker dette som referanse) for å anslå hvor den opprinnelige kortikale filial ligger.
  4. Opprett en ny tynn-skallen regionen (vi refererer til dette som den kirurgiske vindu) litt rostral og ventral til bildebehandling vinduet (hvis du bruker dette som referanse) hvor M1 segmentet (pre-kortikale forgrening) av MCA skal være. VIKTIG: La det være ca en 2 mm gap mellom bilde-vinduet (hvis du bruker dette som referanse) og kirurgisk vinduet.
  5. Lokaliser stammen av MCA (også kjent som den M1 segment) like før kortikale forgrening av arterien som vist i figurene 1A og 1B.
  6. Ved hjelp av en størrelse HP-tre borekronen, tynn skallen over estimert M1 segmentet plassering. Daskallen blir litt gjennomsiktig, bytte til mer delikat størrelse HP-2 borekronen og tynn skallen til den er helt gjennomsiktig. Bekrefte visuelt som kirurgisk vindusområdet blir tynn nok til å vise vaskulatur, og vurdere plasseringen av M1 på dette punktet og fullføre vinduet slik at det er 2-3 mm på hver side av den lengde av M1-segment (dette gir rom for innsetting og utgang av sutur nål på hver side av MCA).

VIKTIG: Stopp tynning når tykkelsen av skallen er lik som plastfolie. Fartøyet vil sprekke hvis drill bryter gjennom skallen og dura. Hvis skallen ikke er tynn nok på den annen side, vil fjerne den for lukkingen være vanskelig og kan føre til skade på hjernebarken eller arterie.

  1. Ta en 30 gauge (30 g) hypodermisk nål og bøyes tuppen av nålen, ved hjelp av taggete pinsett.
  2. Bruk 30 G nål til punktering skallen omsorgfullt ut i et område som ikke direkte over en arterie. Bruk dette punktering hull å tillate pinsett til å gripe skallen og fjern forsiktig tynnet område av kirurgisk vinduet.
  3. Ta en ny 30 G behov, bøye tuppen som i trinn 6, og forsiktig fjerne dura.

MERK: Skjæring dura, vil få den til å trekke tilbake og MCA vil bli mer fremtredende, som et resultat av redusert trykk.

3. Tilstoppes MCA

  1. Bruk wire cutters å trimme en halv kurve bakover kutte sutur nål (runde 3/8, 16 mm sutur nål) ned til ca 3-5 mm.
  2. Træ trimmet sutur nål som vist på bildet i figur 4E. VIKTIG: Det er viktig at nålen er trædd slik at begge ender av sutur tråden er av tilsvarende lengde. Dette gjør det mulig å trekke av begge trådendene i henhold M1 på samme tid, kan nålen deretter kuttes fri forlater to lengder av tråd for å binde de to stikk rundt MCA.
  3. Bruk taggete pinsett slip sutur nål under M1. Sett med ca 0,5-1 mm avstand fra MCA, bor så grunt som mulig for å minimere skader på cortex, men unngå for mye belastning på MCA også.
  4. Når suturen nålen kommer ut på den andre side slik at det er under MCA bruke en fin spiss pinsett (som vist nedenfor) for å trekke spissen av nålen fra sutur den motsatte side samtidig som de fortsetter å mate eller skyve den andre enden av sutur nål med taggete tips pinsett.
  5. Når suturen nålen er fullstendig ført under MCA og har blitt trukket ut, fortsetter å trekke i nålen sutur eller tråden til lengden av tråden er lik på begge sider av MCA. Ved å trykke ned på gjengene som den mates gjennom for å minimere belastningen på MCA kan være nyttig for å hindre brudd som tråden passerer under arterien.
  6. Klipp tråden nær sutur nål.
  7. Bruk begge fin spiss pinsett å gre de to resulterende sutur trådens slik at det finnes to uavhengige tråder tredd henhold MCA som ikke rørende. Ideelt trådene vil være ca 1 mm fra hverandre der de passerer under MCA.
  8. Bruk begge fin spiss pinsett til å knytte to separate knop (to ligaturer) med trådene rundt MCA forsøker å hevde at ~ 1 mm plass mellom knop for å gi plass for transection.

MERK: Hvis en intern narreakupunkturkontroll er ønsket, forberede okklusjon forlater okklusjonen knop løs, slik at de ikke trekker seg sammen i det hele tatt MCA og samle inn dataene forut for stramme knutene og skjæring av fartøyet. Trim tråden for å hindre den fanger på noe før okklusjon men la nok tråd til å tillate innstramming av knop senere. På denne måten kan alle baseline bildebehandling eller datainnsamling utføres med alle de samme kirurgiske invasjonen som okklusjon og knutene strammet på riktig tidspunkt med liten forsinkelse.

  1. Når knutene har væreno trukket stramt, bruker mikro saks til tversgående M1 i mellom de to knop.
  2. Når det gjelder langsiktige overlevelse studier:
    1. Sutur radert skalp klaff tilbake på plass med steril kirurgisk tråd eller sikre vev ved hjelp av sterile sår klipp.
    2. Administrer antibiotika lokalt til såret område (for eksempel bacitracin salve) og systemisk ved profylaktisk tilførsel av ampicillin (150 mg / kg, IM).
    3. Mens temaet er fortsatt bedøvet administrere en ophthalmic antibiotisk salve til øynene.
    4. Administrer supplerende atropin (0,05 mg / kg IM) for å redusere luftveissekreter under anestesi.
    5. Injisere flunixin meglumine (1,1 mg / kg) subkutant ved avslutningen av operasjonen og igjen påfølgende morgen (~ 12 timer senere) for smerte kontroll.
    6. Plasser dyret på en tørr, varm, skråstilt underlag slik at dyrene nesen er over halen på den skrå (dette letter puste inntil dyret er våken). </ Li>
    7. Overvåke dyret før det er våken og beveger seg trygt på egen hånd.
    8. Når dyret er tilbake i vivarium, dyrets aktivitet, bør utseende, vokalisering, og mate-og drikkeatferd overvåkes daglig.

4. Eutanasi

  1. Ved avslutningen av hvert eksperiment, bør rotter avlives med natrium-pentobarbital (2-3 ml, intraperitonealt).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vellykket okklusjon av et fartøy kan bekreftes ved hjelp av laser spettet imaging (LSI) blant annet blodstrøm imaging teknikker. Blodstrøm i de store kortikale grener av MCA bør slippe til ~ 25% av baseline eller mindre etter en okklusjon avhengig av nivået av støy i opptakssystemet og følsomhet av teknikken. Se figur 3 for en LSI representativt bilde av et segment av en kortikal gren av MCA før og etter MCA okklusjon. Når den beskrevne okklusjon teknikk påføres MCA på M1 segmentet, blokkerer alle kortikale MCA grener, og sensoriske stimuli forhindres ~ 5 timers etter en okklusjon, er resultatet en kortikale infarktvolum på 28,4 ± 2,4 mm 3 (for en representativ koronal skive en 2,3,5-Triphenyl-tetrazolium-klorid [TTC] farget hjerne med den beskrevne skade, se figur 2; blek unstained område tilsvarer infarkt) 25.


Figur 1. Gule piler indikerer omtrentlig plassering av pMCAO på M1 segmentet. Dette okklusjon eksempel innebærer occluding MCA bare distalt for lenticulostriate forgrening, før alle cortical forgrening, og dermed kutte av blodtilførselen til kortikale grener bare. (A) Diagram av MCA på lateral kortikale overflaten. (B) Koronal syn på omtrentlig MCA kortikal og subcortical gren steder. Merk at okklusjon av MCA proksimalt for lenticulostriate forgrening vil resultere i hjernebarken og subcortical infarktet, men tilgang til denne regionen krever en relativt invasiv kirurgisk prosedyre. Klikk her for å se større figur .


Figur 2. Enkel representant koronale skive fra en rotte hjernen viser infarkt som følge av pMCAO (med omtanke for å minimere beskyttende sansestimulering for 5 timer etter en okklusjon). 2,3,5-Triphenyl-tetrazolium klorid (TTC)-løsning flekker friskt vev rødlig og forlater områder av celledød eller infarkt (angitt med pil) blek. Legg merke til at på grunn av plasseringen av okklusjon (før alle MCA kortikale grener, men distalt subkortikale grener) bare kortikale infarktvolum observert, og sterkt myelinerte regioner av hjernen ikke tar opp TTC-oppløsningen og vil derfor forbli hvit farve, til tross som er strukturelt intakt.

Figur 3
Figur 3. Bildet viser flyten i en del av en enkelt gren av kortikal MCA før og enfter pMCAO som avbildes med laser spettet imaging (LSI). Varmere farger indikerer sterkere strøm. Den beskrives MCA grenen er godt synlig krysser grunnlinjen bilde (venstre) fra nedre venstre hjørne til øverste høyre hjørne og forsvinner etter pMCAO. Merk: Av noen minimal bevis for strømning forblir i en gitt gren, men følgende pMCAO nivå bør falle til 20% eller mindre av opprinnelig strøm for å bekrefte okklusjon suksess.

Figur 4
. Figur 4. Kirurgiske Nødvendig verktøy for pMCAO (A) ekstra fin Græfe tang -.... 0,5 mm Tips svak kurve (B) Keramiske Coated Dumont # 5 tang (C) ekstra fin Bonn saks, rett (D) Round 3/8 (16 mm) Sutur Needles (E). MERK: Sutur nåler kan være shortened via kabelkuttere henhold til brukerens preferanser. Etter forkorting med avbiter, bør Sutur nåler bli sterilisert. (F) 6-0 Flettet Silk Sutur. (G) 30 gauge nål, ½ i lengde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen ble utviklet for å indusere iskemi innenfor gnager cortex, og å gjøre dette med minimal ytre påvirkning til eksperimentelle fag. Den doble okklusjon og transection metoden gjør det mulig for visuell bekreftelse på at fartøyet har blitt permanent tildekket, og kan utføres uten overdreven invasjon eller vevsskade, og med en høy overlevelse. Dette okklusjon protokollen kan brukes på alle cortical fartøy som kan nås via craniotomy for å indusere iskemi innenfor en bestemt cortical domene. Videre kan slike okklusjoner utføres når et dyr er i et stereotaktisk apparat som tillater samtidig bruk av ulike investigational teknikker, slik som funksjonell avbildning eller elektrofysiologisk registrering. Dette gjør denne okklusjon teknikken gjelder for et bredt spekter av eksperimentelle design, også innen-faget etterforskning. For eksempel kan vurderingen skje ved baseline med sting på plass rundt Artery (men før du har skaffet sting og transecting), i løpet av iskemisk utbruddet, og når som helst etter okklusjon tidspunkt nødvendig.

Vellykket gjennomføring av denne okklusjon er betinget av to kritiske trinn. Først riktig visualisering av årens er kritisk for å fremkalle iskemi. Okklusjon i gatene eller proksimalt til distalt til ønsket stilling (i vårt typisk tilfelle, bare proksimalt til den primære anterior / posterior kortikal bifurkasjon av MCA) kan resultere i en stor grad av infarktvolum variabilitet, så bør man være forsiktig å bekrefte skikkelig nettsted for okklusjon og transection. Sekund, passerer sutur nål rundt målet arterien krever grundig og presis teknikk. Av nødvendighet, vil suturen passerer gjennom den mest overfladiske lag av hjernebarken umiddelbart under arterien. Forsiktighet bør utvises for å unngå dykking også dypt inne i kortikale overflaten, fordi dette kan føre fartøy ruptur, blødning, eller skade på hjernen på occlusion nettstedet. Mens mange typer blodkar okklusjon kirurgiske verktøy er tilgjengelig, har vår lab hatt mest suksess med halv kurve Sutur nåler, avkortet i henhold til experimenter preferanse. Brukes i forbindelse med ultra-fine tang, gjør dette verktøyet brukeren å passere sutur tråden under en arterie og over kortikale overflaten med bare minimal vevsskade.

Etter vellykket fullføring av en okklusjon, blir infarkt begrenset til cortex alene (figur 2). I sammenheng med å bruke denne okklusjon metode for å modellere MCA slag, kan dette ha viktige implikasjoner for forskere gitt at mange MCA slagpasienter opprettholde infarkt innen både hjernebarken og basalgangliene. Men favoriserer vårt laboratorium denne okklusjon metoden anvendt på MCA enn teknikker som intraluminal sutur gitt den nylige funn som svekket tygging, svelging funksjon, og nedsatt motorisk funksjon oppstår i 47% av alle fag som gjennomgår intraluminal sutur 35; nedsatt cerebral perfusjon og redusert spontan motorisk aktivitet som følge av redusert mat og vannopptak også bidra til dårligere nevrologisk bedring hos rotter etter intraluminal sutur 36-40. Trueman et al. 2011 har også rapportert unormal spising, nedsatt drikking oppførsel, og sensorisk funksjonshemming (som kvantifisert av lim fjerning oppgave) følger denne prosedyren 11. Kritisk, observerte vi de samme atferdsmessige underskudd i humbug intraluminale sutur dyr 11. Som et resultat, kan intraluminal sutur legge alvorlige konfunderende faktorer å preklinisk hjerneslag studie-mange av dem er direkte knyttet til det kirurgiske inngrepet og ikke til cerebral iskemisk hjerneslag.

Det er umulig å modellere den variable etiologi og patologi av humant hjerneinfarkt - faktisk en så stor grad av variasjon ville være uønsket i en eksperimentell modell. Stroke forskning på dyr bør instead fokusere på å produsere et resultat mer analogt til menneskelig slag skader og underskudd under forsøk på å modellere etiologi som best mulig. Vi foreslår at minimalt invasiv art, okklusjon av MCA resulterer i iskemi, infarktvolum som kan sammenlignes med menneskelig MCA iskemi, og evne til å innlemme flere utforskende teknikker sammen pMCAO kan gjøre denne metoden et attraktivt alternativ for noen prekliniske hjerneslag etterforskere. I tillegg gir okklusjon metoden modellert her ved pMCAO et alternativ, minimalt invasive, effektivt middel for okkludering enhver overflate cortical fartøy.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre på dette tidspunktet.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av American Heart Association Predoctoral 788808-41910 Fellowship, NIH-ninds NS-066 001 og NS-055832, og Senter for hørsel Forskning NIH Training Grant 1T32DC010775-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Extra Fine Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Slight Curve (1) Fine Science Tools 11151-10
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps (2) Fine Science Tools 11252-50
Extra Fine Bonn Scissors, straight (1) Fine Science Tools 14084-08
Round 3/8 (16 mm) Suture Needles Fine Science Tools 12050-02
6-0 Braided Silk Suture Fine Science Tools NC9071061
Harvard Apparatus
No.:510461
30 gauge needle, ½" length Fine Science Tools NC9867376

No.:ZT-5-030-5-L/COL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caplan, L. R. Caplan's Stroke, A Clinical Approach. , 4th edn, Saunder's & Elsevier. (2009).
  2. Blumenfeld, H. Neuroanatomy Through Clinical Cases. , Sinauer Associates. (2002).
  3. Roger, V. L., et al. Heart Disease and Stroke Statistics--2011 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. , (2011).
  4. Dirnagl, U., Iadecola, C., Moskowitz, M. A. Pathobiology of ischaemic stroke: an integrated view. Trends Neurosci. 22, 391-397 (1999).
  5. Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacol. Biochem. Behav. 87, 179-197 (2007).
  6. Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Busto, R., Watson, B. D. Photochemically induced cortical infarction in the rat. 2. Acute and subacute alterations in local glucose utilization. J. Cereb. Blood Flow Metab. 6, 195-202 (1986).
  7. Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann. Neurol. 17, 497-504 (1985).
  8. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema, I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese Journal of Stroke. 8, 1-8 (1986).
  9. Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
  10. Howells, D. W., et al. Different strokes for different folks: the rich diversity of animal models of focal cerebral ischemia. J. Cereb. Blood Flow Metab. 30, 1412-1431 (2010).
  11. Trueman, R., et al. A Critical Re-Examination of the Intraluminal Filament MCAO Model: Impact of External Carotid Artery Transection. Transl. Stroke Res. 2, (2011).
  12. Dirnagl, U. Neuromethods. Waiz, W. olfgang , Spring Science & Business Media. New York. (2010).
  13. Cirstea, M. C., Levin, M. F. Compensatory strategies for reaching in stroke. Brain. 123 (Pt. 5), 940-953 (2000).
  14. Nakayama, H., Jorgensen, H. S., Raaschou, H. O., Olsen, T. S. The influence of age on stroke outcome. The Copenhagen Stroke Study. Stroke. 25, 808-813 (1994).
  15. Nudo, R. J., Plautz, E. J., Frost, S. B. Role of adaptive plasticity in recovery of function after damage to motor cortex. Muscle Nerve. 24, 1000-1019 (2001).
  16. Chiganos, T. C., Jensen, W., Rousche, P. J. Electrophysiological response dynamics during focal cortical infarction. J. Neural Eng. 3, 15-22 (2006).
  17. Traversa, R., Cicinelli, P., Bassi, A., Rossini, P. M., Bernardi, G. Mapping of motor cortical reorganization after stroke. A brain stimulation study with focal magnetic pulses. Stroke. 28, 110-117 (1997).
  18. Weber, R., et al. Early prediction of functional recovery after experimental stroke: functional magnetic resonance imaging, electrophysiology, and behavioral testing in rats. J. Neurosci. 28, 1022-1029 (2008).
  19. Dirnagl, U., Kaplan, B., Jacewicz, M., Pulsinelli, W. Continuous measurement of cerebral cortical blood flow by laser-Doppler flowmetry in a rat stroke model. J. Cereb. Blood Flow Metab. 9, 589-596 (1989).
  20. Wintermark, M., et al. Comparison of admission perfusion computed tomography and qualitative diffusion- and perfusion-weighted magnetic resonance imaging in acute stroke patients. Stroke. 33, 2025-2031 (2002).
  21. Crafton, K. R., Mark, A. N., Cramer, S. C. Improved understanding of cortical injury by incorporating measures of functional anatomy. Brain. 126, 1650-1659 (2003).
  22. Nudo, R. J., Eisner-Janowicz, I. Ch. 12. Reprogramming the Cerebral Cortex. Lomber, S. tephen, Eggermont, J. os , Oxford Scholarship Online. (2006).
  23. Davis, M. F., Lay, C. C., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Amount but not pattern of protective sensory stimulation alters recovery after permanent middle cerebral artery occlusion. Stroke. 42, 792-798 (2011).
  24. Lay, C. C., Davis, M. F., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Mild sensory stimulation completely protects the adult rodent cortex from ischemic stroke. PLoS One. 5, e11270 (2010).
  25. Lay, C. C., Davis, M. F., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Mild sensory stimulation reestablishes cortical function during the acute phase of ischemia. J. Neurosci. 31, 11495-11504 (2011).
  26. Coyle, P. Middle cerebral artery occlusion in the young rat. Stroke. 13, 855-859 (1982).
  27. Risedal, A., Zeng, J., Johansson, B. B. Early training may exacerbate brain damage after focal brain ischemia in the rat. J. Cereb. Blood Flow Metab. 19, 997-1003 (1999).
  28. Lay, C. C., Davis, M. F., Chen-Bee, C. H., Frostig, R. D. Mild sensory stimulation protects the aged rodent from cortical ischemic stroke following permanent middle cerebral artery occlusion. Journal of the American Heart Association Cardiovascular and Cerebrovascular Disease. , (2012).
  29. Niiro, M., Simon, R. P., Kadota, K., Asakura, T. Proximal branching patterns of middle cerebral artery (MCA) in rats and their influence on the infarct size produced by MCA occlusion. J. Neurosci Methods. 64, 19-23 (1996).
  30. Wang-Fischer, Y. Manual of Stroke Models in Rats. , CRC Press. 17-30 (2009).
  31. Quinn, R. Comparing rat's to human's age: how old is my rat in people years? Nutrition. 21, 775-777 (2005).
  32. Wei, L., Rovainen, C. M., Woolsey, T. A. Ministrokes in rat barrel cortex. Stroke. 26, 1459-1462 (1995).
  33. Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J., Pulsinelli, W. Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries. J. Cereb. Blood Flow Metab. 8, 474-485 (1988).
  34. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischaemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).
  35. Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 34, 2252-2257 (2003).
  36. Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26, 1086-1091 (1995).
  37. Kuge, Y., Minematsu, K., Yamaguchi, T., Miyake, Y. Nylon monofilament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats. Stroke. 26, 1655-1657 (1995).
  38. Laing, R. J., Jakubowski, J., Laing, R. W. Middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Which method works best? Stroke. 24, 294-297 (1993).
  39. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
  40. Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A., Reulen, H. J. A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry. Stroke. 29, 2162-2170 (1998).

Tags

Medisin Biomedical Engineering anatomi fysiologi nevrobiologi Neuroscience Behavior kirurgi Therapeutics kirurgiske prosedyrer operative etterforskningsmetoder miljø-og biovitenskap (General) Behavioral Sciences Dyremodeller Stroke iskemi bildebehandling midt cerebral arterie fartøy okklusjon gnager modell kirurgiske teknikker dyremodell
Permanent Cerebral Vessel Okklusjon<em&gt; Via</em&gt; Dobbel Ligatur og transection
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davis, M. F., Lay, C., Frostig, R.… More

Davis, M. F., Lay, C., Frostig, R. D. Permanent Cerebral Vessel Occlusion via Double Ligature and Transection. J. Vis. Exp. (77), e50418, doi:10.3791/50418 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter