Rekonstituering af et Kv Channel i lipidmembraner for strukturelle og funktionelle studier

Summary

Procedurer for rekonstituering af en prototype spændingsstyret kaliumkanal i lipidmembraner beskrevet. De rekonstituerede kanaler er egnet til biokemiske analyser, elektriske optagelser, ligand screening og elektron krystallografiske studier. Disse metoder kan have generelle anvendelser til de strukturelle og funktionelle studier af andre membranproteiner.

Abstract

At undersøge lipid-protein-interaktion i en reduktionistisk måde, er det nødvendigt at inkorporere membranproteiner i membraner af veldefineret lipidsammensætning. Vi studerer lipid-afhængige gating effekter i en prototype spændingsstyret kalium (Kv) kanal og har arbejdet detaljerede procedurer at rekonstruere kanalerne i forskellige membran-systemer. Vores rekonstituering procedurer tager hensyn til både vaskemiddel-induceret fusion af vesikler og sammensmeltningen af ​​protein / detergent miceller med lipid / detergent blandede miceller samt betydningen af ​​at nå en ligevægt fordeling af lipider blandt protein / detergent / lipid og detergent / lipid blandede miceller. Vores data antydede, at indsættelsen af ​​kanalerne i lipidvesiklerne er forholdsvis tilfældigt i orienteringer, og rekonstituering effektivitet er så høj, at ingen påviselige protein aggregater blev set i fraktionering eksperimenter. Vi har udnyttet rekonstituered kanaler til at bestemme de konformationelle tilstande af kanalerne i forskellige lipider, registrerer elektriske aktiviteter af et lille antal kanaler er indarbejdet i plane lipiddobbeltlag, skærm til kropsbygning-specifikke ligander fra en fag-viste peptid bibliotek og støtte væksten i 2D krystaller af kanalerne i membranerne. Rekonstitueringen her beskrevne procedurer kan tilpasses til at studere andre membranproteiner i lipiddobbeltlag, især til undersøgelse af lipid effekter på eukaryote spændingsstyrede ionkanaler.

Introduction

Celler udveksle materialer og information med deres omgivelser gennem funktionerne af specifikke membranproteiner ^1.. Membranproteiner i cellemembraner fungerer som pumper, kanaler, receptorer, intramembrane enzymer, linkere og strukturelle støtter tværs membraner. Mutationer, der påvirker membranproteiner har været relateret til mange humane sygdomme. Faktisk har mange membranproteiner været de primære lægemiddelkandidater, fordi de er vigtige og let tilgængelige i cellemembraner. Det er derfor meget vigtigt at forstå strukturen og funktionen af ​​forskellige membranproteiner i membraner, og gøre det muligt at udforme nye metoder til at afhjælpe de skadelige virkninger fra de mutante proteiner i humane sygdomme.

Lipider omgiver alle membranproteiner integreret i dobbeltlag ^{2, 3.} I eukaryote membraner, er de forskellige typer af lipider kendt for at være organiseret i mikrodomæner ^{4, 5.}Mange membranproteiner viste sig at være fordelt blandt disse mikrodomæner samt voluminøse flydende fase af membraner ^{3, 6.} Mekanismen bag organiseringen af ​​mikrodomæner og levering af membranproteiner ind i dem, og den fysiologiske betydning af sådanne distributioner er helt klart vigtigt, men forbliver dårligt forstået. En større tekniske vanskeligheder i at studere lipid effekter på membranproteiner er pålidelig rekonstituering af biokemisk oprensede membranproteiner i membraner af velkontrollerede lipid sammensætning, således at næsten alle rekonstitueres proteiner er funktionelle ^7.. I de sidste par år har vi udviklet metoder til at rekonstruere prototype spændingsstyret kaliumkanal fra A. pernix (KvAP) i forskellige membran systemer til strukturelle og funktionelle studier ^8-10. Dataene fra andre og os sammen viste, at lipiderne er sandsynligvis en bestemmende faktor i konformationelle ændringer i spænding-sensingdomæner af en spænding ionkanal og kan forme strukturerne af nogle af disse kanaler ^11. I den næste, vil vi give en detaljeret beskrivelse af vores metoder og vil tilbyde kritiske tekniske tips, der vil sandsynligvis sikre en vellykket reproduktion af vores resultater samt en udvidelse af vores metoder til studier af andre membranproteiner.

Protocol

1.. Ekspression og oprensning af KvAP Channel (figur 1)

1. Forberedelse Work - Dag 0
   1. Skyl glasflasker for bakteriekulturen med deioniseret vand (DIH ₂ O) og MilliQ H ₂ O (MQH ₂ O) for at fjerne spor af rengøringsmiddel fra almindelig opvask.
   2. Autoklave 1,000 ml LB-medium i 2,8 L Erlenmeyerkolber (i alt to-liters kultur som et eksempel her). Lav hårdhed af vandet blev fundet at være vigtig for den vellykkede dyrkning af de transformerede bakterier.
   3. Autoklave 100 ml LB-medium i 500 ml kolber
   4. Transform 60 pi XL1-Blue kompetente celler med 200 ng af pQE60 plasmid indeholdende genet for KvAP med et thrombin skæringssted og et His _6-tag ved dets C-terminus plade bakterierne på to LB-agarplader indeholdende 100 ug / ml ampicillin, og inkubere dem i 14-16 timer i en 37 ° C inkubator.
2. Ekspression af KvAP - Dag 1
   1. Kontroller appearance af de bakterielle kolonier på pladerne efter inkubering natten. Kolonierne var som regel kun omkring 0,2-0,5 mm i diameter, og der var en masse af dem. Vi ønsker ikke de plader, der huser store kolonier omgivet af en masse satellit kolonier.
   2. Tilføj 5,0 ml LB medium til hver LB-agar plade inkuberet natten og skrot fra kolonierne. Overfør bakterierne suspension i 100 ml LB medium autoklaveres i en 500 ml kolbe. Tilføj ampicillin til en slutkoncentration på 100 ug / ml, inkuberes lille kultur for ~ 1 time ved 37 ° C eller indtil OD600 når 0,60.
   3. I mellemtiden sted to kolber med 1,0 L medium i en 37 ° C rysteinkubator at varme op mediet, og forberede 20 ml _BaCl2 (1,0 M, 10 mM slutkoncentration i hver 1,0 L kultur), 2,0 ml 0,4 M IPTG (isopropyl-thio-β-galactosid), og 2,0 ml 100 mg / ml ampicillin lager i vand.
   4. Når den lille kultur er klar, tilsættes 10 ml _BaCl2, 1,0 ml ampicillin bestand, og 50 ml af små kultur fra trin 1.2.2 til forvarmet LB medier. OD600 skal være omkring 0,05. Hold øje med eventuel nedbør på grund af høj hårdhed af vandet og modionerne i LB-medier. Ba ^{2 +} vides at binde til pore domæne kaliumkanal og blokerer ionstrøm, og dermed mindsker giftigheden af ekspression på højt niveau af kanalerne til bakterierne.
   5. Tag OD600 hver time, indtil den når 0,70, og hver femten minutter, indtil den når 0,8-0,9. I vores set-up, det normalt tager ~ 5 timer at nå 0,8.
   6. Tilføj 0,40 mM IPTG at starte den inducerede ekspression af kanal-protein, og inkuberes kulturen for en anden 4,0 time ved 37 ° C med 225 rpm rystende.
   7. Harvest bakterier i 1,0-liters centrifugeflasker ved centrifugering ved 4.000 xg, 4,0 ° C i 15 min. Dekanteres supernatanten så meget som muligt i et spild bægerglas tilsættes 10 ml 1,0 M Na-fosfat buffer til udfældning alle Ba ^{2 +,} og derefter tilføje enlille mængde blegemiddel til at dræbe bakterier. Hold de høstede bakterier i centrifugeflasker begravet i is i en 4,0 ° C koldt rum natten over.
3. Oprensning af KvAP protein (Dag 2 og 3, figur 1B)
   1. Resuspender bakterierne pellet i 15 ml IMAC lyseringspuffer per 1,0 L kultur. Tilføj ~ 1,0 U DNase I, og tre proteaseinhibitorer leupeptin, aprotinin og pepstatin A ved 1,0 ug / ml. Den samlede volumen for to-liters kulturen var ~ 35 ml.
   2. Sonikeres de resuspenderede bakterier i en metal bæger begravet i is til en samlet 10 min af ON-tid. Den mikrosonde sonicator blev sat i en 5 sek ON / 10 sek OFF cyklus med en 40% udgangseffekt i en 4,0 ° C koldt rum. Udgangseffekten Indstillingen blev bestemt empirisk, således at de fleste af de bakterier blev lyseret uden megen opvarmning i opløsningen.
   3. Tilføj 0,50 g n-decyl-β-D-maltosid (DM, Sol-Grade fra Anatrace) i tørt pulver til den sonikerede cellelysat og inkuber blandingen i 3.5 Timer ved stuetemperatur (RT) med konstant horisontal omrystning (~ 100 rpm) for at udvinde så meget kanalproteiner som muligt. Det er vigtigt at sørge for, at vaskemiddel pulveret er helt opløst over en periode på 30-50 minutter.
   4. Efter detergentekstraktion, fjernelse af cellerester fra lysatet ved centrifugering ved 20.000 xg i 30 minutter ved stuetemperatur. Mens du venter på centrifugering til slut, udarbejde en His-tag-baserede LC (lavtryks-væskekromatografi) søjle som beskrevet i boks 1.
   5. Indlæse supernatanten fra trin 1.3.4 på færdigpakkede IMAC (jeg mmobilized m etal ion en ffinity c hromatography) søjle ved en strømningshastighed på 1-2 ml / min, der er drevet af en peristaltisk pumpe. Alternativt udvindes His-mærket protein kan inkuberes med IMAC harpiks til batchvis bindende.
   6. Vask IMAC resin ved at køre 5 lagvolumener IMAC vaskebuffer og 10 lejevolumener IMAC vask buffis plus 20 mM imidazol. En in-line UV monitor bruges til at sikre, at tøjet er rent.
   7. Eluere KvAP protein ved anvendelse af IMAC elueringsbuffer indeholdende 300 mM imidazol. De fleste af de bundne KvAP elueres indenfor 6 ml elueringsbuffer gennem søjlen. Tilføj thrombin (1,0 E pr 2-3 mg protein) ind i de puljede elueringsfraktionerne og inkuberes proteinet natten på bænken for at spalte His _6-tag.
   8. På næste dag, koncentrere thrombin-fordøjet protein opløsning i en Centricon (MWCO = 30K) ned til 600 pi for størrelses FPLC (hurtig protein-væskekromatografi). Under centrifugering, blandes prøven hver fem minutter for at minimere proteinaggregering. Da proteinet koncentreres, den lokale koncentration på membranfilter bliver højere, og der undertiden er klare hvide bundfald, som ellers kunne tilstoppe filteret membran. Også den høje koncentration af proteiner (~ 5-10 mg / ml) ved bunden af ​​koncentratoren fører til en pandenish farve og blanding virkelig hjælper til at minimere prøve tab.
   9. Kør den koncentrerede KvAP gennem en Superdex 200-søjle, der er præ-ækvilibreret med FPLC ækvilibreringspuffer. Typisk toppen af ​​tetramere KvAP kanal i DM eluerer med en retentionstid volumen på 12,3 ml. Der er en lille hængende hale på omkring 13,6 ml, som har en lille mængde af monomert KvAP. Det tomrum af kolonnen brugte vi er ved 7,0 ml, og sædvanligvis prøven giver anledning til en lille top ved tomrum, som indeholder meget lidt KvAP protein. Imidazolen kommer i slutningen af ​​elueringen (~ 24 ml). Pool fraktioner indeholdende KvAP tetramers sammen og koncentrere protein løsning ned til 0,5 ml. Bestemme koncentrationen af prøven ved hjælp af en anslået ekstinktionskoefficient (~ 1.2E-5,0 M ^-1 cm ^-1, som blev beregnet på grundlag af antallet af aromatiske rester) i KvAP ved 280 nm [ref ^12, URL: http:// web.expasy.org / protparam /].
      Ved stuetemperatur, er det oprensede KvAP i DM stabil i mindst en uge uden væsentligt tab af protein. Ved 4 ° C, kan det vare endnu længere. Aldrig fryse protein i vaskemidler. Det anbefales at opbevare proteinet i DM ved 4 ° C, og proteinet i β-OG ved stuetemperatur. Men vi normalt ikke vente, og fortsæt til rekonstituering trin umiddelbart efter proteinerne er klar.
   10. Assay prøverne i en 12% reducerende SDS-PAGE-gel.
       Prøverne fra hvert trin beskrevet ovenfor, blev fremstillet ved at blande de 20 mikroliter prøver med 5x SDS-prøvepuffer (tabel 3 for pufferne) suppleret med 1,0% β-ME. Prøverne blev ikke kogt. Efter geler var klar, prøverne sædvanligvis havde været i SDS-buffer for mere end 10 minutter ved stuetemperatur. Efter gelen blev kørt og farvet med Coomassie blue, vildtype KvAP viste som et enkelt bånd på omkring 26 kDa (figur 1B

2.. Ion Channel Rekonstitution

2.1. Liposompræparat og vaskemiddel-induceret fusion af vesikler

Forud for lipid forberedelse, vaske en 14 ml engangs glas reagensglas, en skruelågsglas rør, og en 250 gl glassprøjte med chloroform. Hæld ~ 10 ml chloroform til TestTube.

1. Fremstilling af palmitoyl-oleoyl-phosphatidylethanolamin (POPE) og palmitoyl-oleoyl-phosphatidyl-glycerol (POPG) liposomer.
   1. Overfør 3,75 mg POPE og 1,25 mg POPG (POPE: POPG = 03:01 vægtforhold) i chloroform til forrensede skruelågsglas rør og tørre lipiderne under en kontinuerlig strøm af argongas. Når ingen synlige chloroform tilbage, tør lipid yderligere under værelse vakuum i en time.
   2. Tilføj 440 pi lav salt-puffer (10 mM HEPES, pH 7,4) Eller vand i den tørrede lipid og vortex røret at hydratisere lipiderne. Lipidsuspensionen ser hvidlig og uklar.
   3. Sonikeres lipidsuspensionen i et iskoldt bad sonikator indtil vesikel opløsningen bliver gennemskinneligt (OD410 <0,2).
      Typisk for 10 mg / ml PAVE / POPG opløsning i vand eller lav salt buffer, drives vi ultralydsapparat med 30 sek ON og 30 sek OFF (på is) i alt 15-20 min. På grund af den varme, der genereres under lydbehandling, er det tilrådeligt at tilføje 1,0 mM DTT i lipid-løsning for at minimere lipidoxidation, og at nedkøle vandbad i sonikator til 10 ° C eller derunder. Den endelige OD410 er lipid-afhængig. For visse lipider kan det være meget vanskeligt at nå så lav OD. Hvis det sker, vi normalt bruger rengøringsmidler til helt solubilisere lipider og tillade lange inkubationstid for at nå god fordeling af lipider omkring protein-holdige miceller (se næste).
      En høj kapacitet bad sonicator er vigtig i wordsis at nå OD410 <0,2. Vi har ved hjælp af et system lavet af Laboratory Supplies Co, Inc (Model # G112SPIG, Hicksville, NY). Nøglen til korrekt lydbehandling af vesiklerne er at sikre, at den resonante centrum i midten af ​​røret har kraftige vibrationer. Vibrationen varierer med vandmængden, og derfor kan justeres. Også det empirisk vist sig, at forøget viskositet af vandet ved tilsætning af en lille mængde glycerol kan forbedre effektiviteten af ​​sonikering.
      Alternativt har vi fundet, at bruge en mikroprobe sonikator i kontakt med lipidsuspensionen i en plast-eller metalrør kan producere de samme resultater. Den mikroprobe skal rengøres og kun spidsen er nedsænke i lipidopløsningen. Fordi lipidpartiklerne er opdelt i små stykker på overfladen af ​​mikroprobe, er det meget vigtigt at holde prøven afkøles, og har nogle reduktionsmidler rundt for at forhindre oxidation af de umættede lipider.
      Under cryo-elektron MICRoscopy, at størstedelen af ​​de sonikerede unilamellare vesikler 30-50 nm i diameter (data ikke vist). Krumningen af ​​de små SUV'er er så høj, at en lille forstyrrelse er nok til at fremkalde den pulserende fusion af disse vesikler i større dem, der er 80-200 nm i diameter (se næste).
   4. Der tilsættes 50 ul 3,0 M KCl og 10 pi 0,50 M DM til blandingen, således at den endelige lipidsuspension har 300 mM KCI og 10 mM DM. Inkuber opløsningen med horisontal rotation i 2 timer ved stuetemperatur til dannelse af lipid / detergent blandede miceller. Efter inkubationen bør suspensionen blive en lille smule uklar (figur 2A), hvilket skyldes den detergent-induceret fusion af små unilamellare vesikler.
   5. Når proteinet koncentreres til mere end 2,0 mg / ml, tilsættes 0,50 mg KvAP protein, 50 pi 3,0 M KCI, 16 pi 0,50 M DM bestand i vand, og 10 mM HEPES, pH 7,4 til lipid / detergent blandingen lave 1 ml af den endelige volumen. Den endelige lipid: protein-vægtforhold 10:1og den endelige koncentration af DM er 18 mM (figur 2A). Inkuber protein / lipid / detergent blanding i glasrøret med horisontal rotation i yderligere 2 timer.
      Udvælgelsen af detergentkoncentrationen er styret af detergent-induceret vesikelfusion og vesikel solubilisering ^13.. Når vesiklerne dannes ved kraftig sonikering, deres gennemsnitlige diameter er i intervallet 30-50 nm under EM. Disse vesikler har meget lav spredning ved 410 nm. Ved lave koncentrationer, er vaskemidler indsættes først i vesiklerne, destabilisere vesiklerne, og inducere fusion af detergent-mættede vesikler (OD410 går op, se figur 2A). Vesikelfusion fører til forhøjelse af OD410 nm. For 10 mg / ml POPE / POPG vesikler. De OD410 topper ved omkring 15 mM DM Når flere detergenter indføres vesiklerne begynder at bryde i stykker og lipiderne bliver opdelt i detergent / lipid blandede miceller. Denne sidstnævnte proces ledsages affalde af OD410 ned til en endelig lavt niveau (<0,1).
      På grund af de aktive fusion begivenheder i stigende fase af den optiske tæthed på grund af vaskemiddel-induceret fusion af små blærer, er det meget sandsynligt, at proteinet / detergent miceller vil aktivt fusioneret med detergent-mættede lipidvesikler. Det er årsagen til valget af 18 mM DM på tidspunktet for udarbejdelsen af ​​protein / lipid / detergent blanding. Hvis vaskemiddel bliver koncentreret ved mere end 4 folder, at mængden af ​​DM behov justeres, således at den endelige koncentration er stadig omkring 18-20 mM. Når proteinet udbyttet er meget lavt, er det vanskeligt at vurdere, hvor meget koncentrerede opvaskemidler er i prøven, vil vi i stedet blande proteinet med fuldt solubiliserede lipider, og bruge den fuldt ækvilibreret blanding til rekonstituering. I vores hænder, hvis ikke nok tid fik lov til at nå en god ligevægt fordeling af lipiderne mellem proteinholdige og protein-frie miceller, den reconstitution effektivitet faldet betydeligt. Vi normalt teste rekonstituering effektivitet ved to eksperimenter: 1) at undersøge co-migrering af proteinet med vesikel fraktion i en sucrose-densitetsgradientultracentrifugering 2) udtrække proteinerne ud af de rekonstituerede vesikler, og fraktionere dem i en gel- filtrering kolonne for at finde, hvor meget protein (KvAP i vores tilfælde), er fortsat at være tetramert. Mindste inkubationstid af protein / lipid / detergenter er et par timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 grader.
      For en ny membran protein, der er stabil i en anden detergent, er det første skridt for at finde ud af solubilisering egenskab af lipiderne ved sådan et detergent, svarende til hvad der er vist i figur 2A. Dernæst er det tilrådeligt at starte med PC ekstrakter, såsom E. coli polar ekstrakt PC, sojabønner PC ekstrakt osv., således at hvis den specifikke protein har brug for visse phospholipider til dens funktion, kan det allerede indgår i udvindingTed lipidblanding.
2. Fremstilling af KvAP i blanding med detergent-solubiliseret 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propan (DOTAP) eller 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-succinat (DOGS) --- et eksempel på fuldstændig lipid solubilisering til rekonstitution
   1. Lipid forberedelse er den samme som for POPE / POPG vesikler. Sonikeringen hydratiserede lipider i små unilamellare vesikler kræver længere tid (sædvanligvis 45-60 min) end for POPE / POPG lipider (normalt 5-10 min). Hundene vesikler kan langsomt fusionere med hinanden og danne små olieagtige dråber.
      På grund af vanskeligheden i at gøre høj kvalitet SUV'er ud af DOTAP og HUNDE reproducerbart, vi normalt solubilisere disse to lipider fuldstændigt før blanding med proteinerne.
   2. At opløseliggøre DOTAP eller HUNDE totalt, er sonikerede vesikler blandet med 10 mM DM og 40 mM n-octyl-β-D-glucosid (β-OG). Lipid / detergent inkuberes natten over (> 15 timer)ved stuetemperatur, og blandingen bør ikke have nogen små partikler eller dråber. Men i stedet er det temmelig klart. Opnår fuldstændig ligevægt i dette trin vil føre til dannelsen af ​​en betydelig andel af de multilamellære vesikler.
   3. Bland KvAP proteinet med detergent-solubiliserede DOTAP eller HUNDE i et protein: lipid-forhold, der er mindre end eller lig med 1:10. Protein / detergent / lipidblanding inkuberes ved stuetemperatur i 2-3 timer med ende-over-ende rotation.

2.2. Fjernelse af rengøringsmidler til at danne proteoliposomer

1. Dialyse --- langsomme fjernelse af rengøringsmidler, såsom DM og β-OG, der har relativt høje kritiske micellekoncentrationer (CMC ≥ 1,0 mM)
   Forbered 2-liter dialysepuffer (tabel 3) for hver 1,0 ml blanding.
   Klip en passende længde af dialyserør (MWCO = 10K, 0,70 cm bred), og vask det med DI vand. Det er vigtigt at kontrollere ogsikker på, at der ikke er nogen lækage i slangen. For følsomme prøver, kan slangen være først behandlet med en puffer af 10 mM Tris-HCI pH 8,0 og 2,0 mM EDTA, og derefter renset i kogende vand i 3-5 min. Slangen klemmes derefter ved den ene ende og skyllet med dialysebufferen.
   Indlæse protein lipid-vaskemiddel blandingen i en dialyseslange. Klem begge ender af slangen med minimal plads tilbage over løsningen. Sæt den fyldte slangen i dialysebufferen, og bruge en omrøring pladen, så slangen roterer langsomt i opløsning. Skift dialysebufferen gang hver 8. time. Efter den første buffer ændringer bør opløsningen bliver uklar, hvis proteinet-lipid-detergent blandingen var fuldstændig klar. Hvis dialyse er for hurtigt, kan der være faste hvide bundfald i bunden af ​​dialyserøret. Det anbefales, at på tidspunktet for buffer ændringer bør slangen gnides, og vendes flere gange. Efter fem skift af dialysebuffer, er vesiklerne normalt klar.
   Vi tjekker den restmængde af vaskemidler ved at skyde blærer på lipiddobbeltlaget. Når der er stadig betydelig mængde tilbage rengøringsmidler, dobbeltlaget bliver brudt næsten øjeblikkeligt. Det er også muligt at måle den resterende vaskemiddel ved hjælp kolorimetri eller måle overfladespænding vehikelsuspension.
2. Anvendelse af polystyrenperler at hjælpe med at fjerne detergenter, der har lav CMC
   I mange tilfælde er vi nødt til at bruge lave CMC rengøringsmidler, såsom DDM (CMC ~ 0,17 mM i vand). Perler med små hydrofobe porer anvendes til at fjerne disse detergenter ^14..
   1. Fremstilling af perlerne. Vægt out 0,5 g tørre perler og sætte dem ind i en 50 ml Corning rør, tilsættes 20 ml methanol, der sonikeres løsningen i et bad sonicator i 5 min for at fjerne indespærrede bobler, spin ned perlerne ved 5.000 rpm i 5 min, og derefter dekanteres mest methanol. Gentag vask med ethanol og MilliQ vand. De vaskede perler opbevares i 20% ethanol ved 4 ° C, ogskal ændres til en detergent-fri buffer før brug.
   2. Vurdere mængden af ​​detergenter i protein / lipid / detergent blanding, der skal behandles, og beregne mængden af ​​perler, der er nødvendige for at fjerne detergenter. For DDM og DM, er bindingskapaciteten omkring 100 mg perler til 10 mg vaskemidler. De våde perler uden overskydende vand afvejes, og tilsættes direkte til proteinblandingen. Mindst 15-20 min er nødvendig for perlerne at være fuldt effektive og faldet i detergentkoncentrationen når et stabilt niveau ^14-16. For at fjerne 8,7 mg DDM (dodecyl-maltosid) i 1,0 ml opløsning, svarende til ~ 18 mm, i alt 87 mg polystyrenkugler, såsom Bio-Beads SM2, der bruges i fem lige store fraktioner. Bland protein / lipid / detergent blanding med hver fraktion i 20-30 minutter med konstant ende-over-ende rotation ved stuetemperatur, spin ned perlerne overføres supernatanten til den næste del af perler, og gentag indtil slutningen.
      Når vaskemiddel concentration når sit CMC, vi bevidst forlænge fristen for at til en time, således at den lille mængde af vaske-og rengøringsmidler i løsningen vil lette fusion af små blærer i store virksomheder.
   3. For at fjerne spor mængden af ​​vaskemidler efter det sidste trin, tilsættes 35 mg Bio-Rad SM2 perler og inkuberes med blærer i 4 timer.
      Når procedurerne for vaskemiddel fjernelse beskrevet ovenfor skal anvendes til en ny protein, er det generelt tilrådeligt at starte med protein / lipid-forhold (vægt / vægt) i ~ 1:10. Lipid / detergentblanding skal nøje forberedt, så nok vaskemidler er tilføjet til helt solubilisere lipider (figur 2A). Det er vigtigt at inkubere lipid-detergent blandingen i mere end 2 timer ved stuetemperatur (med 1-2 mM DTT) med konstant rystning (400 rpm) eller ende-over-ende rotation. Når proteinet blandes med lipider, bør protein / lipid / detergent blanding inkuberes længe nok (natten over, hvis proteinet er stable) ved enten stuetemperatur eller i et koldt rum, så fordelingen af ​​vaske-og lipider mellem protein-holdige miceller og protein-fri miceller er relativt jævn. Hertil kommer, at hvis hurtige fjernelse af detergenter ved hjælp BIOBEADS anvendes, er det vigtigt at finde ud af vaskemiddel-bindende kapacitet af perlerne. Den langsomme fjernelse af detergenter sandsynligvis sikrer, at proteinerne vil have nok lipider til at opretholde deres integritet og blive indsat i relativt betydelige vesikler.

2.3. Opbevaring af proteoliposom og kvalitetskontrol

1. Når vesiklerne er klar, forberede dem i 50 pi alikvoter og flash-indefryse portioner ved direkte kaste sig flydende nitrogen. De frosne vesikler opbevares derefter i en -80 ° C fryser. For biokemiske analyser, vi ikke bruger frosne vesikler fordi fryse-tø cyklus tider blev fundet at indføre artefakter i vores cys-specifik reaktion. For elektrisk optagelses, vi kun bruger vesikler, der er gemt i -80 ° C i mindre end 6 måneder.
2. Flydning af vesiklerne i en densitetsgradient (figur 2B)
   1. Load 50 ul af vehikelsuspension oven på lag af sucrose-gradient indeholdende 0,3 ml af hver af 10, 35 og 55% saccharose fremstillet i 10 mM HEPES og spin ved 200.000 g i 4 timer ved 4 ° C. Accelerere og decelerere langsomt for at undgå forstyrrelser i grænsefladen mellem lagene.
   2. Saml 100 pi fraktioner fra top til bund og køre dem på en ikke-reducerende SDS-PAGE (figur 2B). Den KvAP farves godt med Coomassie sådan at et bånd af 0,5-1,0 mikrogram protein er klart synlig. Den KvAP protein bør findes ved grænsefladen mellem 10 og 35% saccharose. Ingen tunge aggregater af proteiner ses ved høj densitet rækkevidde, viser, at næsten alle proteiner er i membranerne.
3. Kontroller korrekt konformation af KvAP kanal i vesikler. <br /> Vores tidligere data fastslået, at en enkelt cystein mutant (L125C/C247S) KvAP ved korrekt integreret i dobbeltlag, fuldt begravet i membraner, og kan ikke tilgås af cystein-specifikke reagenser ^8. De rekonstituerede procedurer blev testet med denne mutant kanal, og kontrolleres af en Cys-reagens, MTS-PEG5000. Ændringen på L125C med 1,0 uM MTS reagens ved stuetemperatur introducerer en 5 kDa skift til KvAP bandet i en reducerende SDS-PAGE gel. En vellykket gennemførelse af vores rekonstituering procedurer bør føre til nogen påviselig reaktion for L125C mutant kanaler i phospholipidmembraner, hvilket tyder næsten fuldstændig indsættelse af alle kanaler i dobbeltlag. Som en positiv kontrol af reaktionen, er 5,0 mM DM introduceret at gøre næsten alle L125C rester i de mutant kanaler tilgængelige for MTS reagens.
   Alternativt, en pore-bindende toksin, såsom chrybdotoxin, kan anvendes til at tælle de tetramere kanaler. Et antistof-baserede bindendesige (se boks 2, hvor Fv fremstilles som en konformation-specifik ligand for KvAP) kan bruges til at kvantificere de tilgængelige bindingssteder i de rekonstituerede blærer. Disse bindingsanalyser kan derefter sammenlignes med en kvantitativ analyse måle den totale protein for at finde ud af hvad brøkdel af de rekonstituerede kanaler er tetramerer og hvilken fraktion af proteinet har den spænding-sensoren padle (S3/S4 af spændingssensoren) korrekt foldet.
   For andre proteiner skal rekonstitueres, er det tilrådeligt at indføre en kvantitativ metode til at vurdere, hvad brøkdel af de rekonstituerede proteiner foldet korrekt. Omhyggelig funktionel undersøgelse er således en forudsætning for at udvikle god kvalitetskontrol for en vellykket rekonstituering.

3.. Ansøgninger af den rekonstituerede Channel-holdige vesikler

3.1. Funktionel undersøgelse af ionkanal-aktiviteter i sorte lipidmembraner.

Fremstilling af needed materialer.

1. Lipid forberedelse
   1. Rengør et glas reagensglas, en rav hætteglas med Teflon-dukket skruelåg, og et sæt glas sprøjter med chloroform. Tør gule hætteglas under en strøm af argon gas.
   2. Overførsel 0,75 mg POPE og 0,25 mg POPG i chloroform i det ravfarvede hætteglas og fordampe chloroform med argon gas.
   3. Vask de tørrede lipider med 0,20 ml pentan, og tørre helt at fjerne resterende chloroform. Endelig opløse lipider i 50 pi decan. Lipiderne i decan (20 mg / ml) vil blive anvendt til at male et lipiddobbeltlag tværs af en 150-250 mikron hul (figur 3B) boret i den indsnævrede del ved den ene side af en eksperimentel dobbeltlag kop (fig. 3A).
2. Løsning forberedelse
   1. Intracellulær opløsning (trans): 10 mM HEPES / KOH, pH 7,4, 15 mM KCI
   2. Ekstracellulær opløsning (cis): 10 mM HEPES / KOH, pH 7,4, 150 mM KCI
   3. Salt bro: Bend glaskapillareri U-formede broer, og fylde dem med 1,0% smeltet agar opløst i ekstracellulær opløsning.
      Den osmotiske gradient mellem de trans-og cis løsninger viste sig at være den vigtigste drivkraft for vesikelfusion på lipiddobbeltlaget ^17.. For negativt ladede lipider blev 15 mM _CaCl2 eller positivt ladede poly-Arginin peptider fundet at være i stand til at inducere fusion begivenheder. Fusogene lipider, såsom DOTAP og hunde mv, kan indføres i lipidvesiklerne så chancen for fusion begivenheder er højere.

Elektriske optagelser fra KvAP kanaler i lipiddobbeltlagene

1. Pre-male det runde hul (diameter ~ 0.25 mm), som er boret på den cylindriske overflade af dobbeltlaget kop (figur 3B). Lipiderne overføres med en kapillær støder, der er lavet i laboratoriet. Den runde hoved kapillar pistil er poleret og ikke ridse overfladen af ​​koppen. The lille mængde af lipider båret af den kapillære støder spredes omkring hullet i dobbeltlaget kop, og lufttørret.
2. Vent 1-2 min, så decan vil fordampe fuldstændigt. Der bør udvises omhu for at undgå lipidopløsningen fra at komme ind i hullet.
3. Sæt koppen ind i optagelsen kammer og sat i saltbroer og elektroderne tilsluttes de to sider af optagelsen cup (figur 4A). Tilsæt cis-og trans-løsning til de to sider af hullet. En osmotisk gradient er indført for at lette fusion af vesikler i lipiddobbeltlaget.
4. Juster potentialet forskydning mellem to sider af koppen til ~ 0 (normalt <2 millivolt). Brug kapillarrøret pistil at overføre en lille mængde af lipidblanding i decan, og male lipidet over hullet, indtil et dobbeltlag hinde. Dannelsen af ​​dobbeltlaget påvises ved registrering af kapacitans strøm under leveringen af ​​en rampe puls.
5. Vent til membranentynder ud og bliver relativt stabil. Vi venter indtil der ikke er flere forandringer i membranen kapacitans i 3-5 min.
   Den generelle tanker om plane dobbeltlag dannet på tværs af et stort hul er, at meget midterste del af membranen er tæt at være ~ 4.0 nm tyk som en almindelig dobbeltlag, og membranen bliver tykkere, når det kommer tæt på kanten af ​​hullet, hvor der er en ring rundt og det meste af decan opløsningsmiddel er ^{18, 19.} Det er uundgåeligt, at der er resterende decan tilbage i den centrale dobbeltlag del af membranen. Tidligere vurdering af volumenforholdet mellem n-decan versus PC var 0,35-0,45 efter udtynding af dobbeltlaget ^{18, 20-22.} EM undersøgelse af den indsnævrede dobbeltlaget viste, at der var linser af decan klemt mellem de to foldere af en dobbeltlaget ^22. Disse data antydede, at membranproteiner indsat i lipiddobbeltlagsmembraner sameksistere med små øer (op til 50 nm i diameter) i decan. Den resterende decan In dobbeltlaget mindsker også elkapaciteten konstant 0,4-0,5 uF / cm ^2, hvilket kan anvendes til at opnå et groft estimat af størrelsen af den indsnævrede dobbeltlaget baseret på den målte kapacitans. En dobbeltlag af 100 pF kapacitans kommer fra en cirkulær tolagsmembran på ~ 180 um i diameter.
   For KvAP, har resterende decan ikke forringe sin spænding-afhængige gating, selvom kanalen funktionen er ikke blevet nøje undersøgt i en opløsningsmiddel-fri dobbeltlag. Det samme viste sig at være tilfældet for de NaChBac kanaler og Kv1.2 kanaler indsat i BLMs ^23.. Det er stadig uklart, om den betydelige venstre forskydning af GV-kurven målt fra Kv1.2 kanaler i decan-tolagede forhold til kanaler i oocytter har noget at gøre med den resterende decane ^23.. Afhængigt af de anvendte lipider til dannelse af dobbeltlag, kan mængden af ​​den resterende decan i dobbeltlaget varierer. For eksempel blev det rapporteret, at dannelsen af ​​plane lipid MembrAnes af MGDG (mono-galactosyl-diacylglycerol) kræver decan, muligvis på grund af sprækker mellem den koniske MGDG bliver fyldt med decan molekyler. Hvorvidt den resterende decan har virkninger på proteinerne der skal undersøges er rent empirisk, og den eksperimentelle test er nødvendig for at fortælle om effekten er væsentlig eller ej.
6. Så snart membranen bliver stabil, skyde 0,5-1,0 pi kanal-holdige vesikler ved at placere den fine ende af en P2-pipettespids, lige over hullet. Vesiklerne falde ned over hullet i bunden af ​​koppen.
   Under denne proces bliver flere vesikler knyttet til membranen hen over hullet. Givet tilstrækkelig tid, er nogle smeltet ind dobbeltlaget del, så at et lille antal KvAP kanaler korrekt indsat i den plane dobbeltlag i den midterste del af membranen. Både osmotisk gradient og elektrostatisk interaktion er vigtige i sammensmeltning af vesiklerne i lipid dobbeltlag ^{17, 24.}
7. For at testede KvAP kanaler i dobbeltlaget er en kort puls på 80 mV leveret fra bedrift potentiale -80 mV. På grund af den hurtige inaktivering og langsom bedring mod inaktivering, et langt interval (~ 120 sek for kanaler i PE / PG membraner) er givet mellem to pulser. En typisk aktuelle optagelse fra kanalerne i et POPE / POPG membran er vist i figur 3C. Hvis den nuværende er lille, skyde flere vesikler. Når strømmen ser godt i størrelse, balance ion koncentrationer i de løsninger på begge sider af membranen. Kanalerne er klar til elektrofysiologiske eksperimenter.

3.2. Screening for kropsbygning-specifikke ligander mod kanaler i vesikler

1. Indførelse af fag-viste bibliotek.
   Fagen-displayed 20-mer peptidbibliotek er til stede ved N-terminalen af de fem-kopier af pIII proteiner i den ene ende af den filamentøse bakteriofag fd-tet ^25.. Biblioteket viser ca. 1 x 10 ⁸ forskelligeskellige typer af tilfældige 20-mer peptid sekvenser, og var venligt givet os af Dr. Kathlynn Browns laboratorium på UT Southwestern Medical Center ^26.. Phag infektion i E. E. coli K91 gør bakterierne resistente over for 12 ug / ml tetracyklin.
   En detaljeret procedure for bakteriekulturen har forstærkning og titrering af fager og planlægning af fag kolonier blevet beskrevet af McGuire et al. ^26. Vi vil give en kort beskrivelse af de grundlæggende funktioner i næste afsnit. Læserne kan finde flere oplysninger i McGuire papir. Vi vil i stedet fokusere på isoleringen af specifikke kloner, som binder tæt til ionkanaler rekonstitueret i vesikler (fig. 4A).
   Den grundlæggende idé bag vores skærm er, at fager bundet til de rekonstituerede kanaler specifikt kan trækkes ned med vesiklerne. Den bundne fag kan forstærkes og testes mod kanaler i lipidmembraner. Vores undersøgelse afkonformationelle ændringer i KvAP spændingssensorer i forskellige lipidmembraner ⁸ viste, at det er muligt at holde spændingssensorer i enten "aktiveret" eller "hvilende" tilstand ved at skifte lipiderne fra regelmæssige phospholipider til dem, der ikke indeholder fosfater i hovedgruppen regioner (DOTAP og hunde i vore eksperimenter). Disse to lipid fastlagte konformationer udnyttes i vores screening af kropsbygning-specifikke ligander. Fagbiblioteket vil først blive mættet af kanalerne i phospholipidvesikler (negativ selektion), før at blive udvalgt til snævre bindemidler til kanaler i DOTAP og HUNDE membraner (positiv selektion).
2. Grundlæggende procedurer bag fagselektion
   Vækst af K91 bakterier i LB-medium: Fordoblingstiden af bakterierne er omkring 20 min ved 37 ° C med 200 rpm rystende.
   Forstærkning af biblioteket: Bland fagopløsning med bakterierne K91 kl OD0.4. Efter 15 minutters inkubering ved 37° C, blandingerne er spredt jævnt på -9,5 x 9,5 tommer ² agarplader indeholdende 12 mg / ml tetracyclin, Brugen af store plader forhindrer dominans af kulturen af bakterier, der har højere vækst-rate. Når mangfoldigheden af ​​biblioteket er mindre, er 10-cm petriskåle bruges til at vælge og små forstærkning.
   Storstilet amplifikation af individuelle kloner: pode en lille prøve af fager (~ 100 millioner) i 250 ml LB plus 5 mM _MgSO4 og 12 ug / ml tetracyclin, Grow natten over ved 37 ° C. Saml celler ved 6.000 rpm spin for 10 min. Indsamle supernatanten og tilsæt i det 0,2 vol / vol udfældning puffer (2,5 M NaCl, 20% PEG8000). Efter inkubation på is i 1,0 time, centrifugeres opløsningen ved 17.000 xg i 30 min til pellet alle fager. Fjern alle supernatant tilsættes 1,0 ml PBS, inkuberes på is i 30 min, forsigtigt pellet resuspenderes (ingen vortexing). Overfør suspensionen til et frisk rør, og der centrifugeres ved 14,000 rpm i 2 min. Supernatanten overføres til et andet rør, og inkuber i 65 ° C vandbad i 15 min for at dræbe alle bakterier. Centrifugeres røret i 2 minutter ved 13.000 rpm. Kassér pellet alikvot og opbevares fagopløsning ved -80 ° C.
3. Panorering af fagerne mod KvAP kanaler i lipidvesikler.
   1. De peptid-visning fager skal forstærkes og titreret før vores eksperimenter, således at antallet af fager pr volumen er kendt. KvAP blev rekonstitueret i POPE / POPG (3:1) plus 0,50% Biotin-DOPE vesikler som negativ kontrol, og ind i HUNDE: biotin-DOPE (199:1, samme skete for DOTAP vesikler) anvendes som valget målet. Den endelige koncentration af KvAP i vesikler er 0,50 mg / ml, og lipiderne er 5,0 mg / ml. Panoreringsteknikken puffer indeholdt 500 mM KCI, 100 mM HEPES / KOH pH 7,4, og 0,10 mg / ml BSA.
      For første løb blev ~ 10 ¹⁰ fager (100 eksemplarer for hver type) fortyndet til 0,050 ml LB medium. For de efterfølgende panorering Trappe, starting fag blev justeret til at være inden Juni ^10-August 10.
   2. Negativ selektion:
      Inkuber de fortyndede fager i 50 pi LB med 100 pi neutravidin agaroseperler (stand til at binde 1-2 mg biotinyleret BSA pr ml harpiks, Pierce) i 1,0 ml panorering puffer. Efter 10 minutters inkubation, adskille perlerne ved spinding dem ved 100 xg i 1,0 minut. Gentag dette trin to gange for at fjerne eventuelle fager, der binder direkte til perlerne.
      Bland de tiloversblevne fager fra det foregående trin med 50 pi tomme vesikler (POPE / POPG plus 0,5% biotin-DOPE), der indeholder ingen proteiner. Tilsæt 100 pi neutravidin Perler, der er blevet vasket med panorering buffer til fagen-vesikel blanding. Efter rotation af blandingen ved stuetemperatur i 5 minutter, fjerne perlerne ved 100 xg spin for 30 sek. Dette trin gentages for tomme vesikler af hunde: biotin-DOPE (199:1) samt for KvAP kanaler i POPE / POPG vesikler (med 0,5% biotin-DOPE). Supernatanten efter disse behandlinger contains den fuldt ryddet fager. Efter de første to skærm cyklusser, kan preclearance kun udføres mod KvAP i POPE / POPG vesikler.
   3. Positiv selektion
      Inkuber fuldt ryddet fager med KvAP kanaler i HUNDE: biotin-DOPE (199:1) vesikler (den samme for DOTAP vesikler) i overværelse af 100 ul NeutrAvidin perler ved stuetemperatur i 10 min. Bringe volumenet af blandingen til 15 ml ved hjælp af panning buffer før centrifugering ved 100 xg i 10 min. Saml perlerne, og vaske dem tre gange med 45 ml panorering buffer.
   4. Resuspendere perlerne i 500 pi LB-medium indeholdende 5,0 ug / ml biotin, og inkuber blandingen ved stuetemperatur i to timer for at frigive nogle af de bundne fager fra NeutrAvidin, som har lavere affinitet end den native biotin. Adskille perlerne ved 100 xg spin for et minut. Saml supernatanten og perlerne i to forskellige rør til titrering.
   5. At forstærke de udvalgte fager, mIX 200 ul af supernatanten eller de resuspenderede kugler i det sidste trin med 500 pi K91 bakteriekultur (OD600 ~ 0,4-0,6, kultiveret ~ 4 timer, inden den anvendes). Efter inkubation ved 37 ° C i 15 min, plade 50 ul af hver på tetracyklin plader til dyrkning natten.
      I de første to skærm cyklusser (Figur 4A), indsamle alle 500 pi supernatant og perlerne fra det sidste trin, bland dem med de 5 ml bakteriekultur, og pladen dem 9,5 tommer firkantede plader for at restituere sig og forstærke alle fag kolonier . Dette trin er vigtigt for genvinding af disse fager, der gør bakterierne vokser langsommere end andre.
   6. Kolonierne fra pladerne forstærkes og titreret før den næste cyklus af panorering og udvælgelse (se McGuire et al., ^26).
   7. Undersøg aktiviteterne i de positivt udvalgte fager på kanaler.
      Efter 10-12 cykler af udvælgelse, afprøve de samlede forstærkede fager på KvAP kanaler lipid Bilayers lavet af POPE / POPG. Hvis der er en væsentlig del af positive kloner bør de udvalgte fager ved 100-500 nM blokere en betydelig del af kanaler i dobbeltlag (figur 4B) som vi selektion mod kanaler stabiliseret i hviletilstand. De positive data tyder på, at der er kloner, der vil vise stærke binding til kanalerne i hviletilstand. Efter 16 cykler af udvælgelse, pick 50 positive kolonier for single-koloni sekventering. De identificerede dominerende fagkloner er valgt blandt sammenligning af sekvenserne, og forstærkes og testet i forhold kanaler i dobbeltlag. Når de positive kloner bekræftes, syntetisere peptiderne båret af stærke positive kloner og teste dem på de kanaler, samt til at bekræfte deres kropsbygning-specifikke aktiviteter.

3.3. Krystallisation af KvAP kanaler i membraner til strukturbestemmelse ^27-29

1. At stabilisere konformationen afkanalen, en konformation-specifik bindemiddel af kanalen, 33H1 Fv-protein, der anvendes til at danne KvAP / Fv komplekset. Forberedelsen af ​​Fv protein er beskrevet i rubrik 2. Rense komplekset i en Superdex 200-søjle. De komplekse eluerer ved ca 11,4 ml i vores system.
2. For det første skærmbillede, blande protein med DMPC eller POPC der er helt opløst i DM eller β-OG. Protein / lipid / detergent blandingen er blandet i mere end 15 timer for at nå en termodynamisk ligevægt i fordelingen af ​​de tre komponenter blandt de blandede miceller. Normalt vi først teste tre forskellige lipid / protein-forhold (LPR = 0,5, 1,5, 2,5) og tre forskellige pH-niveauer (6,0, 7,0, og 8,0). Dialysebufferen indeholder 20 mM K-phosphatpuffer, 100 mM KCI og 3,0 mM NaN3. Dialysebufferen skiftes hver 2-3 dage. En lille prøve af krystallerne er taget ud hver 2-3 dage for at undersøge dannelsen af ​​vesikler og eventuel forekomst af krystalgitter.
   En tabloid listeaf LPR vs pH anvendes til at bestemme opførslen af ​​proteinet i de to forskellige typer af lipider. Vi ønsker at opnå relativt store og mellemstore (mere end 150 nm) blærer eller membran ark, når dialyse Prøverne undersøges af en negativ-pletten EM. En lille regelmæssigt mønster i membraner tyder et hit og vil blive brugt til at vejlede yderligere optimering.
   Negativ-pletten EM: Kobber net belagt med carbon film (~ 3-5 nm tykt), er glød udledes i luften for at gøre carbon overflade hydrofil. Et lille volumen (2-3 mikroliter) af krystaller suspensionen læsset på kulstof overflade, og inkuberet i 0,5-1,0 minutter. Dup ristene fra siden med en revet kant af et stykke Whatman nr. 4 filtrerpapir. Flip gitteret og inkuber det til ~ 15 sek på toppen af ​​en dråbe af 150 mikroliter farveopløsning (2,0% PTA / KOH, pH 8,0 i vand plus 0,5% trehalose, eller 6,0% ammoniummolybdat / KOH, pH6.3-6.5 i vand plus 0,5-1,0% trehalose). Dup så meget som muligt opløsningen fra tHan grid overfladen, og lade nettet at tørre, før du sætter det ind i en TEM til undersøgelse. Billeder af vesikler er taget under lavdosis betingelse for at undgå skader af enhver krystallinsk pakning af elektroner.
3. Skærmen ekspanderes derefter til at undersøge mindre trin af LPR for at nå en korrekt LPR. Hvis proteinerne er egnede til krystallisation, kan en lille gitter af proteiner i membraner bliver synlige. Omkring disse oprindelige betingelser, optimere yderligere krystallisering ved at variere salt typer og koncentrationer, temperatur, hastighed og metoder vaskemiddel fjernelse, divalente kationer, rengøringsmidler, der anvendes til fremstilling af proteiner faeldningsmidler, lipider sammensætning etc.
   De optimerede 2D krystaller af KvAPΔ36/Fv komplekset vokse i store plader, der spænder fra et par mikron til 20-30 mikrometer (figur 5A). Under cryoEM betingelser, viser krystallerne klar kvadratisk gitter med indlysende fire-fold symmetri som forventet ud fra fire-fold symmetrisk chanNels (figur 5B og C).

Representative Results

Den generelle strøm af forsøgene til rensning af KvAP kanal til biokemisk homogenitet er beskrevet i figur 1A. Typiske prøver under ekspression og oprensning af proteinet er vist i SDS-PAGE-gel i figur 1B. Proteinet efter IMAC oprensning er forholdsvis ren. Udbyttet af KvAP kanal er omkring 1,0 mg / liter kultur.

Opløsning af lipidvesikler med rengøringsmidler skal arbejdes ud for hvert par af lipid vs vaskemiddel. Solubilisering af små unilamellare vesikler POPE / PAVE af DM er vist i figur 2A, resultaterne fra vesikler flydeevne er normalt forholdsvis ligetil. Typiske resultater i SDS-PAGE-assay af fraktionerne fra gradienter er vist i figur 2B. I sucrosemassefyldegradient, normalt kanal-holdige POPE / POPG vesikler er koncentreret på grænsefladen mellem de 10% laget end 35% lag. De KvAP-holdige DOTAP eller HUNDE vesikler er lettere og sædvanligvis ved grænsefladen mellem 5% og 10% (lidt trængt ind i 10% lag). Hvis der er en væsentlig del af multilamellære vesikler, de normalt er hvidlige og koncentreret under 10-35% grænsefladen. Vi fandt, at dette sker normalt, når protein-detergent-lipidblanding blev ikke inkuberet længe nok til at nå en god fordeling af lipiderne.

Elektriske optagelser fra KvAP kanaler indarbejdet i plane lipiddobbeltlag er vist i figur 3.. Den typiske nuværende spor viser, at ved -80 mV, kanalerne er rolige. Skifte til +80 mV fører til en hurtig kapacitans peak (den skarpe én på tidspunktet for spændingen skift). En langsom stigende fase af den nuværende antyder, at kanalerne bliver aktive og er i stand til at udføre udad kalium strøm. Efter toppen af ​​den stigende fase, begynder den aktuelle at falde, et trin navngivne inaktivering. Den inactivatipå tager et par hundrede millisekunder at fuldføre. Når spændingen er slået tilbage til -80 mV, er der en returnering fase efter den nedadgående kapacitans peak, hvilket afspejler den lukning af de åbne kanaler og kaldes deaktivering (figur 3C).

I midten af ​​fag skærmen, testede vi aktiviteten af ​​de amplificerede fager på KvAP kanaler i dobbeltlag af POPE / POPG. Efter 12 udvælgelse cyklusser, hæmmede de amplificerede fager kanalen aktiviteter (figur 4B, valgte fag). Men som udgangspunkt fag-displayed bibliotek viste ikke nogen effekt på de kanaler (figur 4B, kontrol fag). Selv om aktiviteterne af de udvalgte fager var ikke meget høj, fordi kun en lav koncentration af de positive fager var rundt, de klare, reproducerbare virkninger foreslog at der er aktive, positive kloner, der udviser høj affinitet, bør selektivt beriget i resterende screening cytøjer, og når beriget, vil sandsynligvis have stærke hæmmende aktiviteter på kanaler i membraner.

I den tidlige fase af screening 2D krystaller oplevede vi små gitre i mange små blærer. Med optimering, viste nogle store plader op med en masse små blærer omkring (figur 5A). De cryoEM billeder af disse krystaller viste altid en masse af lokale defekter (figur 5B), hvilket tyder på, at yderligere optimering er nødvendig for at opnå bedre krystaller. Når krystallerne godt blev optimeret, de udviste skarpe kanter, og fremstod som enkelte ark. Ved stor forstørrelse, er de enkelte enheder klart langt bedre bestilte (5C).

Navn på reagens / Material	Company	Catalog Number	Kommentarer
Tryptone	RPI Corp	T60060
Gærekstrakt	RPI Corp	Y20020
NaCl	Fisher	S271-3
Tris-base	RPI Corp	T60040
Kaliumchlorid	Fisher	BP366-500
n-Dodecyl-β-D-maltosid	Affymetrix	D322S	Sol-grade
n-octyl-β-D-glucosid	Affymetrix	O311	Ana-grade
Aprotinin	RPI Corp	A20550-0.05
Leupeptin	RPI Corp	L22035-0.025
Pepstatin A	RPI Corp	P30100-0.025
PMSF	P7626
DNase I	Roche	13407000
Bio-Bead SM-2	Bio-Rad	152-3920
HEPES	RPI Corp	H75030
POPE	Avanti Polar Lipids	850757C
POPG	Avanti Polar Lipids	840457C
HUNDE	Avanti Polar Lipids	870314C
DMPC	Avanti Polar Lipids	850345C
Biotin-DOPE	Avanti Polar Lipids	870282C
DOTAP	Avanti Polar Lipids	890890C
NeutrAvidin agasteg perler	Piercenet	29200
Dialyserør	Spectrum Laboratories, Inc.	132-570
Pentan	Fisher	R399-1
Decan	TCI America	D0011
MTS-PEG5000	Toronto Research Chemicals	M266501

Tabel 1. Liste af reagenser og materialer.

Bakteriekultur rysteinkubator Spektrofotometer Mikro-sonde-sonikator Rocker Gulv-model centrifuge til opsamling bakteriekultur og koncentrere prøver Tomme kolonner Superdex 200-søjle forbundet til et FPLC-system

Tabel 2. Nødvendigt udstyr.

Buffer navn	Indhold
IMAC Lysis buffer	50 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCI
IMAC vaskebuffer	50 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCI og 5,0 mM DM
IMAC elueringsbuffer	50 mM Tris (pH 8,0), 100 mM KCI, 5,0 mM DM, og 300 mM imidazol
SDS-prøvepuffer (5X) (reducerende)	60 mM Tris-HCI (pH 6,8), 25% glycerol, 2,0% SDS, 0,10% bromphenolblåt. (1,0% 2-mercaptoethanol tilsat for at gøre det reducerende puffer).
Stacking gel buffer til SDS-PAGE (4X)	0,50 M Tris-HCI (pH 6,8), 0,40% SDS
Opløsning gel buffer til SDS-PAGE (4X)	1,5 M Tris-HCI (pH 8,8), 0,40% SDS
FPLC ligevægtration	20 mM Tris pH 8,0, 100 mM KCI og 5,0 mM DM
Liposom dialyse	10 mM HEPES, 100 mM KCI

Tabel 3. Buffer navn og indhold.

Figur 1. Udarbejdelse af KvAP til rekonstitution. A. Generel arbejde flow af protein ekspression, oprensning og rekonstitution. B. Biokemisk oprensning af proteinet. Induceret kultur af E. coli XL1-blå udtrykker KvAP blev forarbejdet og KvAP oprenses. Tyve mikroliter cellekulturer før (bane 1) eller efter (bane 2) induktion, detergentekstrakt (bane 3), gennemstrømning fra IMAC kromatografi (bane 4), to vasketrin (bane 5.6) og 5,0 ug af det samlede protein efter300 mM imidazol eluering (bane 7) og 5,0 ug af KvAP tetramer ud af størrelsen FPLC (bane 8), blev underkastet ikke-reducerende 12% SDS-PAGE og Coomassie blue-farvning.

Figur 2. Opløsning af KvAP i POPE / POPG blærer. A. Vesikelfusion og solubilisering som en funktion af detergent koncentrationer. Absorbans ved 410 nm blev anvendt til at overvåge lysspredningen af ​​vesikler (baseline trækkes til ingen vaskemiddel fraktion). Lipider (POPE / POPG 3:1) var 10 mg / ml. De små unilamellare vesikler efter kraftig sonikering er monodispergeret og har svag spredning på grund af deres størrelser på 30-50 nm i diameter. Når vaskemidler blev indført, de fordeles mellem opløsning fase og lipidmembranen fase. På grund af den kraftige krumning i den lille unilamelvesikler, den indførte rengøringsmidler udløse vesikelfusion og frigivelse af krumningen (og dermed den lave overflade potentielle energi). De fusionerede vesikler er større i størrelse og vise stærkere lysspredning ved 410 nm. Den stigende fase af peak (gråt område) afspejler derfor detergent-induceret fusion, en god ordning for protein micelle fusion til vesiklerne. Koncentrationen af detergent (DM som et eksempel her) lige ved absorptionstoppen faktisk blev valgt til vores rekonstituering proces. B. Halvtreds mikroliter rekonstituerede KvAP vesikler (KvAP 0,5 mg / ml) blev separeret ved sucrosemassefyldegradient. Prøver af 100 ul fraktioner fra top til bund (1 ~ 9) saccharose-gradient blev analyseret i en 12% reducerende SDS-PAGE. Gelen var Coomassie blåfarvet. Bane 3 indeholdt ~ 2 ug KvAP.

/ Files/ftp_upload/50436/50436fig3.jpg "/>
Figur 3. Elektriske aktivitet i KvAP kanal i rekonstitueret dobbeltlag. A. Optage-setup inde i et Faradays bur, 1, to elektroder, 2, trans side, 3, cis side, 4. Saltbro B. Forstørret del af den indsnævrede del ved den ene side af dobbeltlaget kop viser et hul ⁵ , som bruges til fremstilling af membraner. C. Elektrisk aktivitet KvAP kanaler, blev fusioneret i den sorte lipid membranen blev registreret. Mens bliver holdt på -80 mV, blev membranpotentialet pulserende til 80 mV for 150 msek, og derefter ændret tilbage til bedriften potentiale. Den ioniske strøm blev indspillet i spænding-clamp-tilstand ved hjælp af en Axopatch 200B forstærker.

Figur 4.. Screening for conformatipå specifikke ligander fra en fag-displayed bibliotek. A. Scheme bag screeningen mod ionkanaler rekonstitueret i vesikler. Vesiklerne er doteret med biotin-DOPE, og de kan trækkes ud af opløsning ved neutravidin perler. Konformationen af ​​KvAP kanal styres af specifikke lipider. Negative markeringer mod perler, tomme vesikler og vesikler med kanaler i en anden konformation er færdig før fagerne inkuberes med kanalerne i målet konformationelle tilstand (i DOTAP eller hunde som et eksempel her). De udvalgte fager kan amplificeres og testes mod kanaler i dobbeltlag. B. Afprøvning af de udvalgte fager i midten af skærmen. Elektriske aktivitet KvAP i dobbeltlaget på forskellige tidspunkter efter tilsætning af de udvalgte fager: sort spor - før tilsætningen, gule spor - 2 min efter, rød spor - 10 minutter efter tilsætning Top: Udgangspunktet fagbibliotek (total. ~ 10 ¹⁰ fager tilføjettil dobbeltlaget) blev testet på kanaler i dobbeltlag, og blev fundet at have nogen påviselig aktivitet, fordi hver fag-klon har kun omkring 100 kopier Bund:. Efter 12 udvælgelse cyklusser, var fagerne stadig en blanding af forskellige kloner. Tilføjelse omkring 10 ¹⁰ fager til kanalerne i dobbeltlaget fører til den klare hæmning af kanal-aktivitet, hvilket tyder på, at der er positive kloner, der skulle have høj affinitet. Klik her for at se større figur .

Figur 5. To-dimensionelle krystallisation af KvAP i membraner. A. Billede af negativt farvede enkelt lag 2D krystaller i midten af krystal optimering. Krystallerne blev farvet med 6,0% ammoniummolybdat, pH 6,4 plus 0,50% trehalose. På grund af sukker, de undertiden stablet op med hinanden. Den sorte firkant boks betegner et område, der giver anledning til diffraktionsmønster er vist på højre side med diffraktion pletter går til ~ 20 Â. B. CryoEM billede af en 2D krystal fra en prøve svarende til den, der anvendes i (A). Prøven blev blandet med 3% trehalose og frosset ved direkte indstikning og filmede under en cryoEM. Billedet blev opnået ved 50.000 x. Det var klart, at der var lokale defekter i krystalpakning. C. CryoEM billede af en yderligere optimeret krystal. Prøven blev indlejret i 0,75% tannin og 10% trehalose og billedet blev taget på 50.000 X. lige linjer og den stramme pakning foreslog, at de kanaler, godt blev bestilt i denne type af krystaller. De to sorte pile markerer kvadratisk gitter.

Boxes:

Boks 1. Udarbejdelse af IMAC kolonne

1. Resuspender IMAC Resin grundigt.
2. Omgående overføre den nødvendige mængde af harpiks i suspensionen til en 50 ml rør. Vi bruger 2 ml lejevolumen af ​​harpiks til oprensning af KvAP fra 2 L kultur.
3. Centrifugeres røret ved 700 xg i to minutter for at pelletere ned harpiksen.
4. Fjern og kassér supernatanten.
5. Tilføj 10 lejevolumener MQH ₂ O og bland kortvarigt at skylle harpiksen.
6. Recentrifuge ved 700 xg i 2 min til pelletering ned harpiksen. Supernatanten.
7. Tilføj 10 lejevolumener MQH ₂ O og hæld i tomme kolonne.
8. Vent resin afregner ned, og luk søjlen med et flow adapter til lavtryks-væskekromatografi.
9. Kør 5 søjlevolumener MQH ₂ O og 5 søjlevolumener ækvilibreringspuffer gennem søjlen.

Boks 2. Oprensning af Fv

Fv Transformation - Dag 1

1. Omdan100 ng af plasmidet indeholdende Fv-His _6-60 pi JM83 kompetente celler, plade bakterierne på fire LB-agarplader indeholdende 100 ug / ml ampicillin, og inkuber natten over i en 37 ° C inkubator.
2. Forbered 6 X 1 L LB bakteriekultur.

Ekspression af Fv - Dag 2

3. Skrot alle kolonier fra pladerne til LB-medium. Tilføj denne suspension af bakterier til 6 X 1 L LB i nærvær af ampicillin (100 mg / l) og inkuberes indtil OD600 når 0,5.
4. Da OD når 0,5, sænke temperaturen til 20 ° C og RPM og 115. Når temperaturen falder til -20 ° C, tilsæt anhydrotetracycline (100 ul 1mg/ml i DMF til 1 L) for at indlede induktion af proteinekspression og inkuberes yderligere 5 timer ved 20 ° C med normal omrystning.
5. Harvest bakterier i 1 L centrifuge-flaske ved 4000 xg i 15 min. Hæld supernatanten så meget som muligt. Hold de høstede bakterier på is ien 4 ° C koldt rum natten over.

Frigørelse af Fv molekyler fra bakterier - Dag 3

6. Resuspender bakterier i 150 ml Fv-frigivende puffer (50 mM Tris, pH 8,0, 20% saccharose, 1,0 mM EDTA).
7. Under omrøring med en magnetomrører tilsættes lysozym til 0,1 mg / ml og holde bakterierne på is i 30 minutter. Bagefter tilsættes MgCl _2-2,0 mM og holde på is i yderligere 10-15 min.
8. Centrifuger de behandlede bakterier ved 20.000 xg i 30 minutter ved 4 ° C. De bakterielle spheroblasts bør alle gå ned til pelleten, og de fleste af Fv-molekyler frigives i supernatanten.
9. Dialyseres supernatanten mod 4,0 L af vaskepuffer (20 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl) i koldt rum i mindst 4 timer. I slutningen af ​​dagen, skift til frisk dialysebuffer og dialyseres natten over. På grund af saccharose i opløsningen, vil omfanget af dialysatet stige med omkring 50%. Overskydende dialyserør bør anvendes.

IMAC rensning og FPLC - Dag 4

10. Ækvilibrer 10 ml lejevolumen IMAC rensning harpiks (se boks 1) med det dialysebufferen i 50 ml rør.
11. Overfør dialysevæske fra slangen, tilføje _MgCl2 til 10 mM og øge volumen til 200 ml. Bland med præækvilibreret harpiks og inkuberes i 30 minutter ved 4 ° C.
12. Pak den tomme kolonne med den inkuberede harpiks, og vaskes harpiksen med 5 lejevolumener vaskebuffer, efterfulgt af 5 lejevolumener vaskebuffer med 10 mM imidazol og 30 mM imidazol hver.
13. Eluere bundne protein med 20 ml vaskepuffer plus 300 mM imidazol.
14. Kør koncentrerede Fv gennem Superdex 200-søjle præ-ækvilibreret med vaskepuffer. Pool fraktioner indeholdende Fv (typiske toppe viser op på 17,6 ml retentionsvolumen) sammen og koncentrerer det. Bestemme koncentrationen af ​​prøven ved hjælp af ekstinktionskoefficienten af ​​Fv ved 280 nm.

Discussion

Rekonstituering af KvAP kanaler i forskellige membraner har været anvendt i flere undersøgelser ^8-10. Efter ideen om at sikre fordelingen af ​​lipider mellem vaske / lipid blandede miceller og protein / detergent / lipid blandede miceller, er vi i stand til at nå op på næsten fuldstændig opløst KvAP i membraner lavet af meget forskellige lipider. Hver tetramere KvAP kanal behov ~ 100 lipid molekyler til fuldt ud at dække sit transmembrane domæne. Det væsentlige krav er at tillade nok lipidmolekyler at smelte ind i protein / lipid / detergent miceller før vaskemidler er fjernet. Vores standard betingelser (0,5 mg protein og 5,0 mg lipider) sikre, at der i gennemsnit ~ 1.000 lipid molekyler pr protein molekyle. Vores floatation eksperiment og biokemiske eksperimenter bekræftede, at rekonstituering er næsten afsluttet. Elektriske optagelser fra kanaler indsat i sorte lipid membraner, screening af de rekonstituerede kanaler against en fag-viste peptid bibliotek, og væksten i 2D krystaller af kanalerne i membraner viser alle de succesfulde anvendelser af membran rekonstituering til forskellige formål.

De lipid-afhængige konformationsændringer af KvAP kanaler og screening mod en fag-vist peptid bibliotek fremvise en ny vej til at screene for kanal blokkere eller kanalåbnere ved biokemiske metoder i stedet for at stole på elektrofysiologi at holde kanalerne i bestemte konformationer ^8. Succesen i vores screening for kropsbygning-specifikke bindere antyder, at den samme strategi kan anvendes til at finde specifikke bindemidler til den aktiverede konformation. Det forventes, at de rekonstituerede kanaler i vesikler kan bruges imod en enkelt Fv biblioteker, Fab biblioteker, osv. På samme måde kan andre membranproteiner køre gennem disse operationer og sikre deres stramme bindemidler, der kan være nyttige til forskellige formål. Vi mener, at dette new metode vil se mere generelle anvendelser i fremtiden.

Rekonstituerede membran systemer vil gøre det muligt at klarlægge de kemiske detaljer bag lipid effekter på membranproteiner ^11.. Lipid-protein-interaktion er blevet kendt for at være vigtigt for mange membranproteiner, og har været genstand for flere undersøgelser i de seneste ^3. I de cellebaserede undersøgelser kan manipulationer skal gennemføres for at ændre specifikke komponenter i membranerne, og derefter de funktionelle ændringer i membranproteiner er forbundet med de strukturelle og kompositionelle ændringer i membranerne. Sådanne forbindelser er indirekte og kan resultere fra flere faktorer i cellemembraner, der ikke er godt karakteriseret. I en rekonstitueret homogen membran, er det mere definitiv i, at forbindelserne mellem de strukturelle og funktionelle ændringer af membranproteiner og ændringer i lipidsammensætning og membran egenskaber. I sidste ende, for at forstå tHan kemiske principper bag lipid-protein-interaktion, er vi nødt til at afgrænse fordelingen af ​​lipider omkring det transmembrane domæne, og for at forstå de dynamiske ændringer i disse lipider Lige ved siden af ​​proteiner. Et rekonstitueret system synes at være en pålidelig vej mod en sådan forståelse.

Rekonstituering af membranproteiner kræver kontrolleret fjernelse af vaskemidler fra protein / lipid / detergent blandede miceller og sammensmeltningen af de blandede miceller i store virksomheder, der i sidste ende bliver til blærer ^30.. Tre forskellige metoder er blevet brugt til fjernelse af detergenter, dialyse, perler og ^{cyclodextrin-14, 31, 32.} Men det er stadig vanskeligt at opnå en velkontrolleret, gradvis fjernelse af detergenter fra en lille volumen ^{33, 34.} En ideel metode til vaskemiddel fjernelse ville tage rengøringsmidler ud af den vandige fase jævnt over hele volumenet på en kontrollerbar tempo, og bør ikke udøve kraftig interferens on genoprettelse af dobbeltlagsmembraner. En sådan fremgangsmåde kan være i stand til at ændre hastigheden og effektiviteten af ​​rekonstituering og vil sandsynligvis gøre det muligt for rekonstituering i et lille volumen. En kombination af langsom fortynding og enhver af tre konventionelle metoder til vaskemiddel fjernelse kan nærme sig dette mål. Slow-fortynding ved at indføre lille mængde vand i proteinet / detergent / lipidblanding er en styrbar måde at jævnt reducere detergentkoncentrationen ned til sin CMC. Vaskemidlet fjernelse bagefter er mindre kritisk for vesikeldannelse, men stadig vigtig for fusion af små blærer i store virksomheder. Andre måder at opnå kontrolleret vaskemiddel fjernelse stadig skal udtænkt og udviklet.

Vores rekonstitueringsprocedure tager hensyn lipid fordeling blandt blandede miceller og vaskemiddel-induceret fusion af vesikler samt blandede miceller. Dens succes baner vejen, der fører til et bredere spektrum af anvendelser af reconstituted vesikler, meget mere end de tre retninger, vi præsenteres. Tilpasningen af ​​vores procedure til andre membranproteiner bør ikke støde større tekniske grænse. Selvom mange membranproteiner er blevet rekonstitueret ene eller den anden måde, har det været vanskeligt at opnå nær rekonstituering og vurdere funktionaliteten af ​​proteinerne fra flere forskellige perspektiver. Vores indsats i KvAP rekonstituering tyder på, at vores metoder kan tillade fuld opløsning og vil være egnet til disse formål.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	RPI Corp.	T60060
Yeast Extract	RPI Corp.	Y20020
NaCl	Fisher	S271-3
Tris Base	RPI Corp.	T60040
Potassium Chloride	Fisher	BP366-500
n-Dodecyl-β-D-Maltoside	Affymetrix	D322S	Sol-grade
n-Octyl-β-D-Glucoside	Affymetrix	O311	Ana-grade
Aprotinin	RPI Corp.	A20550-0.05
Leupeptin	RPI Corp.	L22035-0.025
Pepstatin A	RPI Corp.	P30100-0.025
PMSF	SIGMA	P7626
Dnase I	Roche	13407000
Bio-Bead SM-2	Bio-Rad	152-3920
HEPES	RPI Corp.	H75030
POPE	Avanti Polar Lipids	850757C
POPG	Avanti Polar Lipids	840457C
DOGS	Avanti Polar Lipids	870314C
DMPC	Avanti Polar Lipids	850345C
Biotin-DOPE	Avanti Polar Lipids	870282C
DOTAP	Avanti Polar Lipids	890890C
NeutrAvidin agarose beads	Piercenet	29200
Dialysis Tubing	Spectrum Laboratories, Inc	132-570
Pentane	Fisher	R399-1
Decane	TCI America	D0011
MTS-PEG5000	Toronto Research Cemicals	M266501