4D multimodale beeldvorming van Published: August 13, 2013 doi: 10.3791/50450

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

James William Collins¹, Jeffrey A Meganck², Chaincy Kuo², Kevin P Francis², Gad Frankel¹

¹MRC Centre for Molecular Bacteriology and Infection, Division of Cell & Molecular Biology, Imperial College London, ²Preclinical Imaging, Caliper- A PerkinElmer Company

Summary

Multi-modaliteit beeldvorming is een waardevolle benadering voor het bestuderen van bacteriële kolonisatie in kleine proefdiermodellen. Dit protocol beschrijft infectie van muizen met bioluminescente

Abstract

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om longitudinaal monitoren een bioluminescerend bacteriële infectie met behulp van composiet 3D diffuus licht beeldvorming tomografie met geïntegreerde μCT (DLIT-μCT) en het latere gebruik van deze gegevens om een ​​vierdimensionale (4D) filmpje van de infectie cyclus te genereren. Om de 4D infectie films te ontwikkelen en de DLIT-μCT beeldvorming voor bacteriële infectie studies met behulp van een IVIS Spectrum CT valideren, gebruikten we een infectie met lichtgevende C. rodentium, die zelfbeperkende colitis bij muizen veroorzaakt. In dit protocol, schetsen we de infectie van muizen met lichtgevende C. rodentium en niet-invasieve bewaking van kolonisatie door dagelijkse DLIT-μCT imaging en bacteriële telling van feces gedurende 8 dagen.

Het gebruik van de IVIS Spectrum CT vergemakkelijkt naadloze co-registratie van optische en μCT scans met behulp van een enkel imaging platform. De lage dosis μCT modaliteit maakt de beeldvorming van muizenOp verschillende tijdstippen tijdens infectie, het verstrekken van gedetailleerde anatomische lokalisatie van lichtgevende bacteriën brandpunten in 3D zonder dat artefacten uit de cumulatieve straling. Belangrijk is dat de 4D films van geïnfecteerde muizen bieden een krachtige analytische tool om bacteriële kolonisatie dynamiek volgen in vivo.

Introduction

Kleine diermodellen, met name het gebruik van muizen, worden routinematig gebruikt om bacteriële pathogenese onderzoeken of interventiestrategieën testen op infecties, zoals antibiotica, probiotica, prebiotica en vaccins ^1-7. De belangrijkste experimentele uitlezingen van kleine dieren infecties pathogenen, ruimtelijke en temporele lokalisatie van de infectie, en veranderingen in de immuunrespons van het geïnfecteerde organisme. In vivo optische beeldvorming is een waardevol hulpmiddel voor infectieziekten en kan worden gebruikt voor het monitoren meerdere experimentele uitlezingen door het gebruik van reportergenen (luciferase, fluorescent eiwit, beta-lactamase, enz.), fluorescente kleurstoffen, nanodeeltjes of chemiluminescente probes gericht op een eiwit biologisch proces of micro-organisme ^6.

Bioluminescentie (BLI) is een optisch beeldvormende modaliteit gebruikt om de kolonisatie van kleine dieren, zoals muizen en ratten controleren door pathogene bacria ^3,6,8,9. Muizen geïnfecteerd met recombinant bacteriën een luciferase expressie, zoals het lux operon CDABE van Photorhabdus luminescens. Deze bacteriën kunnen vervolgens worden gedetecteerd door de productie van licht met een CCD gevestigd in vivo imaging systeem ^3,6,9. Belangrijk is alleen metabool actieve micro-organismen bioluminescerende (BL), waardoor alleen levensvatbare bacteriële cellen worden gemeten door deze methode ^10,11. Gebruik 2D BLI, de locatie van de BL bron wordt afgeleid uit het oppervlak van het dier wanneer het signaal wordt uitgezonden ^8. De exacte anatomische lokalisatie van de BL foci in vivo moet worden bepaald door ex vivo analyse van ^3,6,9 organen kunnen daarentegen samengestelde 3D ​​diffuus licht imaging tomografie (DLIT) worden gebruikt om een kwantitatieve 3D reconstructie van de BL samenstellen bron ^12. DLIT wordt uitgevoerd door het verzamelen van BL beelden zijn gemaakt met behulp gedefinieerd smalle band-pass optische filters enze vervolgens invoeren in een diffuse optische tomografie 3D reconstructie-algoritme ^1,7,12,13.

Momenteel, multi-modaliteit beeldvorming is de enige methode beschikbaar true non-invasieve anatomische lokalisatie van bioluminescent foci in vivo krijgen zonder dat ex vivo analyse. Onlangs, hebben we gebruik gemaakt van een combinatie van DLIT co-ingeschreven bij μCT beeldvorming om Citrobacter rodentium (C. rodentium) kolonisatie dynamiek evalueren na profylactische behandeling met een probioticum bacterie ^7. C. rodentium is een muizen specifiek darmpathogeen gebruikt om het model menselijke besmetting met enteropathogene en enterhemorrhagic Escherichia coli ^14. C. rodentium infectie veroorzaakt colitis, doorgaans geassocieerd met milde gewichtsverlies, diarree, gepolariseerde Th1 immuunrespons en duidelijke pathologische veranderingen, waaronder dikke crypte hyperplasie en vastmaken en uitwissen laesie formatiop ^14. Naast deze, C. rodentium pathogenese is grondig bestudeerd met behulp van BLI en de kolonisatie dynamiek in C57BL/6J-muizen zijn goed gedocumenteerd, waardoor deze bacterie een ideaal model organisme voor gebruik met multi-modaliteit beeldvorming ^3,4,7.

Dit protocol is de eerste van een methodologie voor geïntegreerde DLIT-μCT beeldvorming van een bacteriële infectie met behulp van een multimodale beeldvorming platform, de IVIS Spectrum CT, en het genereren van een 4D-film toont de ware dynamiek van deze infectie niet-invasief schetsen.

Protocol

1. Muizen Voorbereiding

1. Kopen of te fokken genoeg 18-20 g C57BL/6J-muizen nodig zijn voor de studie.
2. Als muizen zijn gekocht bij een externe leverancier na transport van de instelling, wennen muizen gedurende 1 week geautoclaveerd voedsel en water de darmflora stabiliseren.
3. Wegen, oor inkeping, en scheiden het vereiste aantal muizen per kooi.
4. De dag voorafgaand aan de infectie, voordat u narcose, controleer dan of er voldoende zuurstof en isofluraan voor de duur van de procedure. Indien nodig, voeg meer isofluorane of vervang de zuurstoffles. Vervolgens controleren het gewicht van de verdoving aaseters, indien zij hebben opgedaan meer dan 50 g sinds hun eerste gebruik, gooi deze weg en vervangen door verse aaseters.
5. Anestheseren muizen met 3% isofluorane in de XGI-8 Anesthesie System en epileren met VEET gedurende 7 minuten.
6. Opmerkingen:
   • Grondige ontharing is essentieel, vooralzwarte muizen als melanine in de vacht aanzienlijk verzwakt de lichtgevende signaal ^3,15.
   • Ontharen van muizen duurt meestal 8-10 dagen voor de vacht begint weer teruggroeien. Om 4D multimodale beeldvorming presteren over langere periodes, ontharen muizen wanneer nodig, zodat het gebied van belang is naakt voor de beeldvorming sessies.
   • Muizen zijn gehuisvest in een Biosafety Level 2 (BSL-2) opvangvoorziening.

2. Bacteriële Celpreparaat

1. Bereid genoeg Luria Burtani bouillon en agar platen aangevuld met kanamycine [50 ug ^ml-1] nodig zijn voor de studie en bewaar bij 4 ° C totdat ze nodig waren.
2. De dag voordat de infectie ontdooien een cryovial van C. rodentium stam ICC180 en voeg onmiddellijk een cryobead tot 15 ml LB-bouillon aangevuld met Kanamycine [50 ug ml ^-1] en cultuur overnacht bij 220 rpm, 37 ° C. Als controle voor middelgrote contaminatie, bereiden een extrageënte 15 ml LB-bouillon aangevuld met Kanamycine [50 ug ml ^-1] en cultuur bij 220 rpm, 37 ° C.
3. De volgende ochtend (~ 16 uur), controleer dan de medium controle voor troebelheid als een teken van de groei van bacteriën. Als de besturing is duidelijk, de overdracht van de ICC180 cultuur een falcon buis en centrifugeer bij 4.000 tpm. Vervolgens was de bacteriële pellet in PBS. Dan resuspendeer in 1,5 ml PBS (1/10 ^ste van het oorspronkelijke volume van LB aangevuld met kanamycine) en meng het bacterieel inoculum creëren.
4. Om te controleren of ICC180 goed is gekweekt en is bioluminescent voorafgaand aan infectie van de muizen, de afbeelding van het inoculum in de IVIS Spectrum CT met BLI en de automatische instelling in de Living Afbeelding 4.3.1 tovenaar zoals eerder beschreven ^1.
   Opmerking:
   • Stam ICC180 is een lichtgevende afgeleide van wild-type C. rodentium ICC169 ^2. Deze bacteriestam is de lux operon CDABE inclusief Kanamycin resistentie gen ingebracht in een pseudogen van xylE in het chromosoom ^2.
   • Het uitvoeren van alle bacteriële kweken met de standaard aseptische technieken en indien nodig ofwel de aankoop steriele verbruiksgoederen / reagentia of autoclaaf voorafgaand aan gebruik.
   • In stap 2.4, kan de bioluminescentie lezing (p / s / cm ² / sr) worden gebruikt om bacteriële aantallen schatten vóór de infectie van muizen.

3. Infectie van Muizen met Bioluminescent C. rodentium en Beoordeling van de bacteriële kolonisatie

1. Voorafgaand aan de infectie, controleren of er voldoende zuurstof en isofluraan voor de duur van de procedure. Indien nodig, voeg meer isofluorane of vervang de zuurstoffles. Vervolgens controleren het gewicht van de verdoving aaseters, indien zij hebben opgedaan meer dan 50 g sinds hun eerste gebruik, gooi deze weg en vervangen door verse aaseters.
2. Anestheseren muizen met 3% isofluorane met een XGI-8 Anaesthesia Systeem om humane terughoudendheid te bieden.
3. Meng de bacteriële inoculum grondig en trekken 0,2 ml (ongeveer 5 x 10 ⁹ kve ICC180) in de spuit.
4. Verwijder muizen uit de narcose systeem een ​​voor een en nekvel ze door stevig grijpen de huid achter de nek met uw duim en wijsvinger.
5. Duw de maagsonde naald naar het dak van de mond, op de tong, en de slokdarm en injecteer het bacterieel inoculum in de maag.
6. Na orale maagsonde van de muizen, toezicht op hun manier van lopen en ademhaling voor tekenen van nood kan een teken zijn dat de bacteriële inoculum is afgeleverd in de longen kan worden. Euthanaseren alle muizen die zijn geïnoculeerd in de longen.
7. Gavage geïnfecteerde muizen met 200 ul PBS als voertuigcontrole, zoals beschreven in stappen 3.1-3.6.
8. Om te bevestigen dat de orale sondevoeding correct werd uitgevoerd, afbeelding geïnfecteerde en mock geïnfecteerde muizen in de IVIS Spectrum CT met BLI en de automatische instelling in de LivingAfbeelding 4.3.1 tovenaar zoals eerder beschreven ^1.
9. Bepaal het aantal levende bacteriën in het inoculum door seriële verdunning in PBS en in drievoud spotten op LB-agar aangevuld met kanamycine [50 ug ^ml-1].
10. Bereken het aantal ICC180 cfu / ml van het vinden van een verdunning waar ongeveer 5-50 kolonies en tel het aantal kolonies van elke vlek op dat verdunning en noteer de verdunning die de kolonies werden geteld op. Vervolgens berekent het gemiddelde aantal cfu (van de drie plekken) en vermenigvuldig deze waarde met de verdunningsfactor 50 (elke vlek is 20 ul van het oorspronkelijke monster 1 ml) en de verdunning van de kolonies werden geteld op, waardoor cfu / ml.
11. Monitor kolonisatie van de muizen dagelijks door het verzamelen uitwerpselen van elke muis in een vooraf gewogen Eppendorf buis (gewogen op een goede balans) en verdund 1/10 in PBS gebaseerd op het gewicht van het monster (0,1 g ^ml-1).
12. Bepaal het aantal levensvatbare bacteriën inde ontlasting door seriële verdunning in PBS en in drievoud spotten op LB-agar aangevuld met kanamycine [50 ug ^ml-1].
13. Bereken het aantal levende bacteriën per gram faeces volgens de punten 3.9, vermenigvuldigt het aantal cfu / ml van de fecale verdunningsfactor in PBS (stap 3.10) van 0,1 g ^{ml-1 tot} cfu / g.
14. Om te bepalen dat muizen werden geïnoculeerd met een zuivere cultuur ICC180 en dat alle kolonies bioluminescent. Neem de agar platen uit stap 3.8, beoordeelt de bacteriële kolonie morfologie hetzij door het oog of kies een vertegenwoordiger kolonie van de plaat en te analyseren met behulp van lichtmicroscopie. Eventueel kan de identificatie van bacteriën door stamspecifieke kolonie PCR worden uitgevoerd om cultuur zuiverheid te beoordelen. Vervolgens heeft het imago van de platen in de IVIS Spectrum CT met BLI zoals beschreven in stap 3.7 en controleer of 100% van de kolonies op de plaat zijn bioluminescentie.
    Opmerkingen:
    • In stap 3.4, bij het plaatsen van de maagsonde naaldAls je weerstand voelt niet dwingen de maagsonde naald, omdat dit zorgt ervoor dat de entstof te gaan in de longen. In plaats daarvan, opnieuw steek de naald en voorzichtig opnieuw te proberen.
    • Stap 3.1 is optioneel en muizen kunnen mondelinge gavaged worden zonder verdoving, afhankelijk van de instituten het dierenwelzijnsbeleid.
    • Ontlasting moet worden uitgestreken de dag dat ze worden verzameld. C. rodentium zal groeien, zelfs indien bij 4 ° C geïncubeerd in PBS en kan de kwantificering van cfu / g ontlasting onjuist.

4. Dagelijkse Composite 3D Diffuus licht Imaging Tomografie met μCT Imaging (DLIT-μCT) van geïnfecteerde muizen

Dierenwelzijnsoverwegingen: DLIT-μCT impliceert DLIT optische beeldvorming geïntegreerd met een snelle, lage stralingsdosis μCT scan (~ 23 mGy voor een twee muis scan, ~ 53 mGy voor een enkele muis-scan) van een geïmmobiliseerd dier. Deze dosis hoopt zich bij elke opnamesessie, zodat het doel is te houden de dosis als low mogelijk (en altijd ver onder de LD _50/30), terwijl nog steeds de studie volbrengen. In sommige gevallen, als er geen teken van infectie in een conventionele BLI scan van muizen, de μCT scan kan worden vermeden dosis verder te minimaliseren. Ook al dosis wordt gehouden zo laag mogelijk, in langdurige studies als er een bezorgdheid over de blootstelling aan straling, zullen muizen worden gedood bij het eerste teken van nadelige symptomen of aan het einde van de μCT beeldvorming periode.

1. Voorafgaand aan de beeldvorming, initialiseren de IVIS Spectrum CT en controleer of de X-ray veiligheidsblokkeringen werken en dat de verhitte fase is op de juiste temperatuur (37 ° C) voor de beeldvorming. Vervolgens moet u het peil van isoflourane in de anesthesie-systeem en het gewicht van de verdoving aaseters. Indien nodig, voeg meer isofluorane en als de aaseters hebben opgedaan meer dan 50 g sinds hun eerste gebruik, gooi ze weg en vervangen door verse aaseters.
2. Opzetten van het Spectrum CT, zodat de beeldvorming parameters diedraaien de functie automatische belichting in Living Afbeelding 4.3.1 zijn geoptimaliseerd voor de beeldvorming bacteriële luciferase. Kies Bewerken> Voorkeuren> Acquisitie en Auto Exposure Window. Selecteer vervolgens> Range Values> Exp. (Seconden) en stel de> Max. tot 300s. Ten slotte selecteert u> Target Graaf (minimum)> Luminescente en ingesteld op 10,000 telt.
3. Steek de ene muis imaging platform in de Spectrum CT en loodrecht het in de anesthesie.
4. Schakel de X-ray veiligheidsvergrendeling en initialiseren van de IVIS.
5. Zodra de IVIS Spectrum CT is geïnitialiseerd, verdoven de muizen met 3% isofluorane met een XGI-8 anesthesie-systeem op een menswaardige terughoudendheid te bieden.
6. Om te bepalen of het nodig is om een DLIT-μCT scan, pre-imago van de muizen met behulp van BLI zoals eerder ¹ beschreven, in de ene muis imaging platform uit te voeren. Als een sterk signaal wordt verkregen muis geschikt voor DLIT beeldvorming. Laat de verdoofde muis in de ene muis imaging platform na de BLI scan klaar voor DLIT-μCT.
7. Gebruik de Imaging Wizard in de Living Image software 4.3.1 voor de set-up van de DLIT-μCT scan. De Imaging Wizard bepaalt automatisch de FOV, belichtingstijd, F-stop en binning voor de DLIT en het FOV, belichtingstijd, filter sets en binning voor de μCT beeldvorming om het beste signaal te geven ruisverhouding. Wanneer u wordt gevraagd door de Imaging Wizard, zijn alleen de 560, 580, 600, en 620 nm emissie filters en selecteer de ene muis μCT scan. Klik vervolgens op> Ophalen om de beeldvorming te starten.
8. Terug de verdoofde muis naar zijn kooi na beeldvorming, verwijder de ene muis imaging platform van het Spectrum CT en desinfecteren met behulp van 1% Tri-gen. Indien nodig, vervangen schuimkussen dat de muis wordt op het risico van kruisbesmetting tussen muizen minimaliseren.
9. Afbeelding muizen dagelijks tot dag 8 na infectie (PI) met DLIT-μCT, zoals beschreven in stappen 4,1-4,8, de longitudinale beeldgegevens moeten 4D mo maken genererenvie van infectie.
   Opmerking:
   • In stap 4.7, raden wij het gebruik van de 560-620 nm emissie filters om afbeelding bacteriële bioluminescentie. Hoewel de piek van bacteriële bioluminescentie is ongeveer 485 nm, door weefsel optica (de aanzienlijke vermindering van blauw / groen fotonen murine weefsel) is het belangrijk om de oranje / rode fotonen voor 3D-reconstructies die de berekening van de signaal diepte vergemakkelijken .
   • De 'auto' belichtingsinstellingen in Living Afbeelding 4.3.1 voor DLIT moeten worden aangepast aan de hoeveelheid fotonen gevangen en de maximale imaging tijd gebruikt voor elk filter set te optimaliseren.
   • Het is alleen nodig als de invloed van de BLI pre-beeldvorming beschreven in stap 4.6 als de onderzoeker niet zeker of er een bioluminescente detecteerbaar signaal, bijvoorbeeld bij gebruik van een nieuwe infectie model.

5. 3D Reconstructie van DLIT-μCT Imaging gegevens

1. Open Living Image software 4.3.1 en selecteer>, Bladeren en open de map met de DLIT-μCT bestanden.
2. Open de DLIT-μCT bestand in de Living Afbeelding Browser, bijvoorbeeld C. rodentium Dag 1 PI door te klikken op Load.
3. In de Tool Palette select> Surface Topografie> Naakt muis, passen de drempel, en klik vervolgens op> Generate Surface. Als het oppervlak reconstructie is succesvol een oppervlakte omtrek wordt weergegeven in het venster 3D.
4. Om de diensten verschaft μCT scan in het venster 3D bekijken, verberg het oppervlak omtrek (Klik> 3D optische instrumenten en deselecteer> Beeldscherm Surface Object), of verlaag de oppervlakte dekking (Klik> 3D optische instrumenten en pas de> ondoorzichtigheid schuifbalk).
5. Voor gedetailleerde anatomische lokalisatie van de 3D DLIT reconstructie moet de 3D volumetrische data (μCT scan) wijzigen zodat alleen het skelet muis zichtbaar is en dat het de optimale contrast. Klik> 3D Multimodaliteit gereedschappen en selecteer> logaritmische Histogram, Gradient Verlichting, Kwaliteit en Denoise. Tot slot passen de Histogram schuifbalk naar rechts en de 3D volumetrische data verandering contrast kijken. Houd het aanpassen van de gegevens totdat alleen de botten zijn duidelijk zichtbaar. Indien gewenst, verandert de kleur van de overdrachtsfunctie punten op het histogram.
6. Volgende select> DLIT 3D Wederopbouw in de Tool Palette en zorg ervoor dat alleen de 560, 580, 600, en 620 nm filter sets, die nodig zijn voor de beeldvorming bacteriële luciferase in vivo, zijn geselecteerd. Klik op> Start. De gegevens Preview menu Venster verschijnt nu met de spectraal gefilterde BL signalen van de muis die werd afgebeeld in 2D. Deze signalen worden automatisch thresholded door de software, maar kan handmatig worden aangepast, indien nodig met behulp van tabs aan de onderkant van het menu. De drempel bepaalt de minimum data-intensiteit (weergegeven als een percentage van het maximum signaal in de afbeelding), die zal worden opgenomen data in de reconstructie.
7. Volgende select> DLIT 3D Wederopbouw in de Tool Palette en controleer of de optische eigenschappen die voor de DLIT reconstructie correct zijn. Selecteer> tabblad Eigenschappen en zorg ervoor dat de instellingen voor Tissue Properties is ingesteld op de muis weefsel, is Source Spectrum ingesteld op bacteriën.
8. Klik> Reconstrueer aan de DLIT reconstructie uit te voeren.
9. Om de DLIT-μCT 3D-film klikken genereren> Extra> 3D-animatie en selecteer> Preset Animaties> CCW Y-as en> Totaal Looptijd> 10 sec (25 frames per seconde). Zodra de instellingen voor de 3D-animatie juist pers> Opnemen en opslaan van de DLIT-μCT 3D reconstructies als. Avi-bestanden gelabeld met het experiment, groep en tijdstip in een aparte map.
   Opmerking:
   • Het is van belang bij het uitvoeren van 3D-reconstructies van DLIT-μCT data naar een PC te gebruiken met Living Afbeelding 4.3.1 en dienstenpakket 1 is geïnstalleerd en dat de PC een grafische kaart geschikt voor het uitvoeren van de multi-modaliteit beeldvorming software. This software kan worden gedownload, en GPU specificaties zijn opgenomen in de release notes ( http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm ).
   • Als de DLIT-μCT 3D reconstructies na gered lijken achteruit, wordt uw computer een oude versie van zijn grafische driver en dit kan door een update van de website van de fabrikant downloaden worden verholpen.
   • In stap 5, presenteren wij onze voorkeursinstellingen voor het genereren van 3D DLIT-μCT reconstructies. Er zijn echter meerdere punten in de 3D-reconstructies waar parameters die niet in dit protocol worden besproken kunnen worden gemodificeerd. Voor een uitgebreide gids voor 3D-reconstructies met behulp van Living Afbeelding 4.3.1 wordt verwezen naar de fabrikant handleiding.
   • Het is belangrijk om de 3D-reconstructies met identieke instellingen in de multi-modaliteit beeldvorming gereedschap zodanig dat ze vergelijkbaar te maken. Naastdeze, bij het maken van de DLIT-μCT 3D reconstructies, is het belangrijk om de video's met hetzelfde aantal frames per seconde en de totale duur (lengte), anders wordt de timing van de 4D video is niet homogeen te maken.

6. Generatie van een 4D film van C. rodentium Infectie

1. Duidelijk alle van de DLIT-μCT 3D-reconstructies met de juiste experiment, tijdstip en de groep in een gemakkelijk toegankelijke map labelen.
2. Maak een nieuw bestand in Windows Live Movie Maker en steek de DLIT-μCT reconstructies in chronologische volgorde vanaf dag 1 PI met het tabblad gereedschappen uit de map bereid in stap 6.1.
3. Bijschriften toe te voegen aan het begin van elke video het beschrijven van de tijdstip, bijvoorbeeld dag 1 PI door de juiste DLIT-μCT video te selecteren en dan Home> Bijschrift toevoegen. Een tekstvak verschijnt op het scherm, waar de juiste legende wordt toegevoegd. Pas de lettertype grootte, stijl, kleur, en rechtvaardiging als desired met identieke tabbladen om Microsoft Word in de werkbalk software. Tot slot verplaatst de titel om de linker bovenhoek van de video.
4. Herhaal stap 7.3 voor alle DLIT-μCT video's.
5. Voeg een titelpagina, bijvoorbeeld C. rodentium infectie dagen 1-8 door te klikken op Home> Titel. Een tekstvak verschijnt op het scherm waar de juiste titel wordt toegevoegd aan een lege dia. Pas de lettertype grootte, stijl, kleur, en de verantwoording naar wens gebruik identiek tabbladen om Microsoft Word in de werkbalk software.
6. Sla het project als Movie Maker-project * MMP in een geschikte map met de titel van de film. Deze stap is essentieel als u de film wilt wijzigen.
7. Sla de film als een. Wmv-bestand. Klik Filmmenu maker> Opslaan film> voor computer.
8. Zetten de movie maker bestand met behulp van een file converter naar. Avi of een andere geschikte bestandstype compatibel zijn met uw computer.
   Opmerkingen:
   • Het wordt aanbevolen dat de 4D filmsworden gegenereerd op een PC met Windows Live Movie Maker geïnstalleerd ( http://windows.microsoft.com/en-GB/windows7/products/features/movie-maker ) en een goede multi-media programma kan afspelen. wmv of. avi-bestanden typen.

Representative Results

Infectie van C57BL/6J-muizen met 5 x 10 ⁹ kve C. rodentium is een goed beschreven bacteriële infectie model en resulteert in een zelf-beperkend gastrointestinale infectie die pieken tussen dagen 6-8 na infectie en duurt tussen 3-4 weken ^2,14. De infectie wordt beperkt tot het intestinale lumen van het murine immuunsysteem en als gevolg daarvan, worden de bacteriën continu werpen in de feces. Kolonisatie van muizen door C. rodentium kan non-invasief worden gevolgd door directe bacteriële opsomming van uitwerpselen, of bioluminescentieweergave ^2,3.

Dit manuscript schetst een geoptimaliseerd protocol voor het uitvoeren van 3D-en 4D multimodale beeldvorming in C. rodentium binnen muizen om bacteriële belasting en lokalisatie tijdens infectie te controleren. De in figuur 1 tonen de resultaten controles die nodig zijn voor succesvolle 4D beeldverwerking. Voorafgaand aan de infectie van muizen is het essentieel te ontmoedigenmijn die de bacteriële inoculum gebruikt is bioluminescentie (Figuur 1A) en dat na de orale sondevoeding van een muis met lichtgevende C. rodentium, dat het signaal kan worden waargenomen in de maag van het dier en niet in de longen (Figuur 1B) ^16.

Naast het monitoren van bacteriële kolonisatie met bioluminescentieweergave, is het verstandig om bacteriële aantallen kwantificeren faeces die wordt gebruikt als een indirecte meting van bacteriële kolonisatie van de maag mucosa Figuur 2 toont de typische bacteriële verontreiniging in feces uit 8 C57BL6 / J. muizen die zijn geïnfecteerd met 5 x 10 ~ ⁹ cfu ICC180 en bewaakt van 8 dagen PI Colonization stijgt van dag 2 tot dag PI 6-7 waar de infectie pieken bij ongeveer 5 x 10 ¹⁰ cfu / g, dat is in lijn met eerdere rapporten ^2,3,17.

Om het belang van evaluatie benadrukkenting van de verspreiding van de infectie in een enkele muis, figuren 1b en 3, alsmede Video 1 zijn gegenereerd uit dezelfde muis na C. rodentium infectie, zoals hierboven beschreven. Dagelijks DLIT-μCT werd gebruikt om de ruimtelijke verdeling van bioluminescente bacteriën in deze muis evalueren, met het skelet als een anatomische referentie. Figuur 3 toont de DLIT-μCT reconstructie van C57BL/6J muizen geïnfecteerd met ICC180 op 3 belangrijke tijdstippen PI At dag 3 PI kleine bioluminescent foci kan worden waargenomen in de dikke darm, dat een matige toename bioluminescentie intensiteit met dag 5 PI met weinig verandering in ruimtelijke verdeling vertonen. Op dag 7 PI zagen we een aanzienlijke verhoging van bioluminescentie en bioluminescent foci verspreid over het gehele colon.

Video 1 is een compilatie van 3D DLIT-μCT reconstructies van dagen 1-8 PI met ICC180 en illustreert C.rodentium binnen het proximale maagdarmkanaal tussen dagen 1-2 PI die zich verspreidt naar de dikke darm op dag 3 PI Vanaf dagen 4-6 PI het aantal bacteriën in de dikke darm uit te breiden tot een piek op dag 7 PI waar de bacteriële brandpunten bestrijkt de gehele dikke darm. Op dag 8 PI slechts twee verschillende bacteriële foci aanwezig in de proximale en distale colon. De mogelijkheid om de volledige 3D reconstructie bekijken op elk tijdstip in chronologische volgorde vormt een krachtig instrument om gastheer pathogeen interacties te analyseren en is gemakkelijker te interpreteren dan een 3D-foto van dezelfde dataset.

Figuur 1. 2D bioluminescentie beeldvorming van A) Bioluminescent C. rodentium ICC180 inoculum en B) een muis na orale gavage met 200 ul van het inoculum. Arrowhead (>) illustreert bioluminescentie C. rodentium em> in de maag.

Figuur 2. C. rodentium kolonisatie dynamiek. Kwantificering van C. rodentium kolonievormende eenheden van feces voor 8 dagen PI

Figuur 3. Diffuus licht beeldvorming tomografie-μCT scan van bioluminescentie C. rodentium besmetting van de ene muis gecontroleerd op dag 3, 5 en 7 PI Arrowhead (>) illustreert colon kolonisatie. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Video 1.p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv "target =" _blank "> Klik hier om de video te bekijken. 4D film van C. rodentium besmetting van de ene muis gevolgd vanaf dag 1-8 PI

Discussion

De 4D film van een bacteriële infectie een nuttig hulpmiddel om grote hoeveelheden van multi-modaliteit beeldvorming gegevens snel en gemakkelijk visualiseren en interpreteren. Deze techniek maakt een gedetailleerde analyse van hoe een infectie verspreidt een individuele muis kan worden gebruikt om te onderzoeken hoe deletie van gastheer of bacteriële genen of bijzondere interventiestrategieën effect bacteriële belasting, distributie en lokalisatie in een longitudinale studie ^7. Deze video's geven ook nuttig leermiddelen en een middel van het verspreiden van informatie aan het publiek.

Er zijn een aantal cruciale stappen in dit protocol kunnen hebben voor de kwaliteit van de gegevens van DLIT-μCT beeldvorming en de mogelijkheid om een ​​4D video infectie stellen. Het belangrijkste onderdeel van dit protocol is de succesvolle en homogene infectie van muizen met C. rodentium. Het is essentieel dat de muizen gebruikt voor de studie tussen 18-20 g en dat de bacrial inoculums worden vers bereid en ongeveer 5 x 10 ⁹ cfu, zoals eerder beschreven ^2,3. Voorafgaand aan infectie van de muizen is het belangrijk om te controleren dat het inoculum is bioluminescent met de Spectrum CT en zodra het inoculum is opgesteld, moet het voortdurend worden gehomogeniseerd elke muis wordt gavaged zodat de muizen op vergelijkbare infectieuze doses. De DLIT-μCT beeldvorming van muizen is geoptimaliseerd zodat de functie Automatische belichting in Living Afbeelding 4.3.1 software bepaalt automatisch de geoptimaliseerde beeldvorming parameters voor het signaal om goed boven het lawaai. De functie automatische belichting voert de gebruiker gedefinieerde instellingen en parameters die moeten worden gemodificeerd zoals beschreven in de procedure. Doet u dit niet zal resulteren in slechte beelden met een lage aantal fotonen verzameld die niet resulteren in een duidelijke progressie in de infectie, als de fabrieksinstellingen van de Spectrum CT voor automatische belichting zijn geprogrammeerd voor imaging tumoren dievuurvliegluciferase. Reconstructies uitgevoerd met 560-620 nm de beste overeenkomst tussen gesimuleerde en gemeten data en dus zijn de meer betrouwbare gegevens om in de reconstructie.

Een beperking van het gebruik van DLIT-μCT is dat ioniserende straling van de μCT scan veroorzaakt sublethale bestraling schade die cumulatief in een longitudinale studie ^18. Subletaal blootstelling aan straling kan de immuunrespons verzwakken, leiden tot DNA-schade en apoptose in interne organen ^19. Uiteindelijk kan cumulatief subletale stralingsschade dood veroorzaken als de LD _50/30 van ioniserende straling wordt overschreden, die tussen 5-7 Gy naargelang de muis stam en leeftijd van de muizen gebruikt ^18,20,21. Hoewel sommige van de moleculaire schade als gevolg van ioniserende straling kan genezen, omdat het overkoepelende principe is om dosis conservatief schatten, wordt dit meestal niet verantwoord in studieplanning. Integendeel, de bedoeling is om te verblijven zoveel below deze grenzen mogelijk terwijl nog steeds het realiseren van de leerdoelen. Dit is vooral belangrijk bij dit onderzoek door de normale immuunrespons op de infectie, kan de frequentie van de beeldvorming en het feit dat transgene, immuno-bestaande of zwaar geïnfecteerde dieren gevoeliger voor ioniserende straling.

Bij het ​​plannen van het experiment een 4D film infectie genereren, is het belangrijk de lengte van het experiment beschouwen, het aantal scans μCT vereist tijdens deze periode en de LD _50/30 van ioniserende straling voor de muis stam gebruikt. Een andere mogelijke beperking tot DLIT-μCT is de kracht van de reporter uitdrukking binnen de bacteriestam wordt gebruikt, omdat dit van invloed op bacteriële detectielimieten en imaging keer. Het is sterk aanbevolen dat de onderzoekers gebruiken gevalideerde bacteriestammen die volledig virulent, maar geoptimaliseerd voor maximale lux operon meningsuiting, zoals eerder aangetoond voor BLI2,3.

Een waarschuwing aan het huidige ontwerp van de 4D beeldvorming is dat elke film bestaat uit afzonderlijke DLIT-μCT scans die verschillende foton schalen hebben. Dit kan de beelden moeilijk te interpreteren maken als de wijzigingen in de lokalisatie van de BL brandpunten, of de intensiteit zijn subtiel, of als er een intense BL focus, omringd door meerdere zwakke foci. Daarom is voor longitudinale visualisaties, is het belangrijk de kleurenbalken consistent houden over de tijdstippen.

Het begrip 4D film infectie kan worden toegepast op elke geschikte wijze gemerkte bacteriële pathogenen. Toekomstige ontwikkeling van deze techniek zal streven naar fluorescentiebeelvorming tomografie (FLIT) alsook DLIT gebruiken om het onderzoek van gastheer reacties op infectie met behulp van een combinatie van bioluminescentie bacteriële pathogenen en injecteerbare fluorescerende nabij infrarood sensoren om gastheer responsen te onderzoeken om infectie te vergemakkelijken. In aanvulling op deze, alleen in dit protocol hebben webeschrijven het gebruik van bioluminescente bacteriën 4D films infectie creëren. Echter, in sommige gevallen noodzakelijk om fluorescent gemerkte bacteriën gebruiken kunnen bijvoorbeeld gelabeld met IRFP, zodat de bioluminescente reportergen kan worden gebruikt voor het onderzoeken van genetica van tijdens infectie. Belangrijk is, zal het gebruik van multi-modaliteit beeldvorming combineert DLIT / FLIT-μCT ons toelaten om meerdere parameters niet-invasieve onderzoeken van een bacteriële infectie, die aanzienlijk zal bijdragen tot de vermindering, verfijning en vervanging van het gebruik van dieren bij wetenschappelijk onderzoek zoals uiteengezet in het initiatief van de NC3R's ( http://www.nc3rs.org.uk/ ).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioluminescent C. rodentium	Frankel lab	ICC180	Wiles et al., 2004
Veet	Boots		Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well.
Isofluorane (100% v/v)	Abbott	B506
Medical Oxygen	BOC Medical		Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required.
Luria Bertani broth	Merck	1.10285.0500	25 g in 1L Demineralised water.
Luria Bertani agar	Merck	1.10283.0500	37 g in 1L Demineralised water.
Kanamycin sulphate	Sigma (Fluka)	60615
50 ml Polypropylene conical Falcon tubes	BD (Falcon)	352070
Universals	Corning (Gosselin)	E5633-063
1 ml syringe	BD (Plastipak)	300013
Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved	Vet Tech	DE005
Microbanks (Cryovial)	Pro-Lab Diagnostics	PL.170/Y
IVIS Spectrum CT	Caliper- a PerkinElmer Company	133577 Rev A/ Spectrum CT
6kVA UPS	Caliper- a PerkinElmer Company
XGI-8 anesthesia system	Caliper- a PerkinElmer Company	118918
XAF-8 Anaesthesia filter charcoal	Caliper- a PerkinElmer Company	118999/00
Living Image v4.3.1 SP1	Caliper- a PerkinElmer Company
Benchtop shaking incubator	New Brunswick Scientific	Innova 44