4D imaging multimodale di Published: August 13, 2013 doi: 10.3791/50450

DOI

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James William Collins¹, Jeffrey A Meganck², Chaincy Kuo², Kevin P Francis², Gad Frankel¹

¹MRC Centre for Molecular Bacteriology and Infection, Division of Cell & Molecular Biology, Imperial College London, ²Preclinical Imaging, Caliper- A PerkinElmer Company

Summary

Di imaging multi-modalità è un valido approccio per studiare la colonizzazione batterica in piccoli modelli animali. Questo protocollo descrive l'infezione di topi con bioluminescenti

Abstract

Questo protocollo descrive i passaggi necessari per monitorare longitudinalmente un bioluminescente infezione batterica utilizzando la tomografia composito 3D diffusa luce di imaging con μCT integrato (DLIT-μCT) e il successivo utilizzo di questi dati per generare un film a quattro dimensioni (4D) del ciclo di infezione. Per sviluppare il cinema 4D di infezione e di convalidare la rappresentazione DLIT-μCT per gli studi di infezione batterica utilizzando una IVIS Spectrum CT, abbiamo usato l'infezione con bioluminescenti C. rodentium, che causa autolimitante colite nei topi. In questo protocollo, abbiamo delineare l'infezione di topi con bioluminescenti C. rodentium e monitoraggio non invasivo di colonizzazione da imaging DLIT-μCT quotidiano e la conta batterica da feci per 8 giorni.

L'uso della Spectrum IVIS CT ​​facilita senza soluzione co-registrazione di scansioni ottiche e μCT utilizzando una singola piattaforma di imaging. La modalità μCT basso dosaggio permette l'imaging di topi, in varie occasioni durante l'infezione, fornendo dettagliata localizzazione anatomica delle foci dei batteri bioluminescenti in 3D senza causare artefatti dalla radiazione cumulativa. È importante sottolineare che il cinema 4D di topi infetti forniscono un potente strumento di analisi per monitorare le dinamiche di colonizzazione batterica in vivo.

Introduction

Modelli piccoli animali, in particolare quelle che utilizzano topi, sono abitualmente utilizzati per studiare la patogenesi batterica o per testare le strategie di intervento per le infezioni, come gli antibiotici, probiotici, prebiotici e vaccini ^1-7. I principali letture sperimentali da infezioni animali piccoli sono carico patogeno, la localizzazione spaziale e temporale delle infezioni, e modifica la risposta immunitaria dell'organismo infetto. Nel imaging ottico in vivo è uno strumento prezioso per la ricerca della malattia infettiva e può essere utilizzato per monitorare multipla letture sperimentali attraverso l'uso di geni reporter (luciferasi, proteine ​​fluorescenti, beta-lattamasi, ecc), coloranti fluorescenti, nanoparticelle o sonde chemioluminescenti mirati ad un processo biologico delle proteine, o microrganismo ^6.

L'imaging bioluminescenza (BLI) è una modalità di imaging ottico utilizzato per monitorare la colonizzazione di piccoli animali, come topi e ratti, per batterica patogenaria ^3,6,8,9. I topi sono infetti da batteri ricombinanti esprimenti una luciferasi, come l'operone lux CDABE da luminescens Photorhabdus. Questi batteri possono essere rilevate mediante la loro produzione luce utilizzando un CCD sede a sistema di imaging in vivo ^3,6,9. È importante sottolineare che solo metabolicamente microrganismi attivi sono bioluminescente (BL), il che significa solo le cellule batteriche vitali vengono rilevati da questa metodologia ^10,11. Utilizzando 2D BLI, la posizione della sorgente BL viene dedotto dalla superficie dell'animale dove il segnale viene emesso ^8. L'esatta localizzazione anatomica del BL focolai in vivo deve essere determinato attraverso l'analisi ex vivo di organi ^3,6,9 In contrasto, tomografia composito 3D diffusa luce di imaging (DLIT) può essere utilizzato per compilare una ricostruzione quantitativa 3D della BL fonte ^12. DLIT viene effettuata attraverso la raccolta di immagini scattate BL utilizzando filtri ottici definiti strette passa-banda esuccessivamente averli inseriti in una tomografia ottica algoritmo di ricostruzione 3D diffusa ^1,7,12,13.

Attualmente, l'imaging multi-modalità è l'unica metodologia disponibile per ottenere vera localizzazione anatomica non invasiva di bioluminescenti focolai in vivo, senza bisogno di analisi ex vivo. Recentemente, abbiamo usato una combinazione di DLIT co-registrate con μCT imaging per valutare Citrobacter rodentium (C. rodentium) dinamiche di colonizzazione dopo il trattamento profilattico con un batterio probiotico ^7. C. rodentium è un patogeno enterico specifico murino utilizzato per l'infezione umana modello con enteropatogeno e enterhemorrhagic Escherichia coli ^14. C. infezione rodentium provoca colite, tipicamente associati con lieve perdita di peso, diarrea, polarizzazione Th1 risposta immunitaria e alterazioni patologiche distinte, tra cui colon iperplasia delle cripte e di fissaggio e cancellando lesione formazionil ^14. In aggiunta a questo, C. rodentium patogenesi è stato studiato a fondo utilizzando BLI e le sue dinamiche di colonizzazione nei topi C57BL/6J sono ben documentati, rendendo questo batterio un microrganismo modello ideale per l'uso con l'imaging multimodale ^3,4,7.

Questo protocollo è il primo a delineare una metodologia per l'imaging integrato DLIT-μCT di una infezione batterica utilizzando una singola piattaforma multimodalità di imaging, il IVIS Spectrum CT, e la generazione di un film 4D mostra la vera dinamica di questa infezione non invasivo.

Protocol

1. Topi Preparazione

1. Acquistare o allevare abbastanza 18-20 g topi C57BL/6J necessari per lo studio.
2. Se i topi sono acquistati da un fornitore esterno, a seguito di trasferimento verso la struttura, abituare i topi per 1 settimana in cibo autoclavato e acqua per stabilizzare la flora intestinale.
3. Pesare, orecchio tacca, e separare il numero di topi per gabbia.
4. Il giorno prima dell'infezione, prima di eseguire qualsiasi anestesia, controllare che vi sia sufficiente ossigeno e isoflurano per la durata della procedura. Se necessario, aggiungere più isofluorane o sostituire la bombola di ossigeno. Successivamente, controllare il peso degli spazzini anestetici, se hanno guadagnato più di 50 g dal loro primo utilizzo, eliminarle e sostituirle con spazzini freschi.
5. Anestetizzare topi utilizzando 3% isofluorano nel XGI-8 Sistema di Anestesia e depilare con VEET per 7 min.
6. Note:
   • Depilazione accurata è essenziale, soprattutto intopi neri come la melanina del pelo attenua in modo significativo il segnale bioluminescente ^3,15.
   • Depilazione di topi di solito dura 8-10 giorni prima che la pelliccia comincia a ricrescere. Per eseguire 4D imaging multimodale su periodi più lunghi, depilare topi quando richiesto in modo che l'area di interesse è nuda per le sessioni di imaging.
   • I topi sono alloggiati in un livello di biosicurezza 2 (BSL-2) impianto di contenimento.

2. Batterica delle cellule Preparazione

1. Preparare abbastanza Luria Burtani brodo e piastre di agar addizionato con kanamicina [50 mg ml ^-1] richiesta per lo studio e conservare a 4 ° C fino al momento dell'impiego.
2. Il giorno prima che l'infezione scongelare un esageratamente di C. rodentium ceppo ICC180 e subito aggiungono uno cryobead a 15 ml di brodo LB addizionato con kanamicina [50 mg ml ^-1] e della cultura durante la notte a 220 rpm, 37 ° C. Come controllo per la contaminazione medie, preparare un ulterioreinoculato 15 ml di brodo LB addizionato con kanamicina [50 mg ml ^-1] e della cultura a 220 rpm, 37 ° C.
3. La mattina dopo (~ 16 ore), controllare il controllo del mezzo per la torbidità come un segno di crescita batterica. Se il controllo è chiaro, di trasferire la cultura ICC180 ad un tubo falcon e centrifugare a 4.000 rpm. Successivamente, lavare il pellet batterico in PBS. Poi risospendere in 1,5 ml di PBS ^(1/10 del volume originale di LB addizionato con kanamicina) e mescolare bene per creare l'inoculo batterico.
4. Per verificare che ICC180 è stato coltivato correttamente ed è bioluminescente prima infezione dei topi, immagine l'inoculo nel IVIS Spectrum CT utilizzando BLI e l'impostazione automatica della procedura guidata 4.3.1 viva immagine come descritto in precedenza ^1.
   Nota:
   • Strain ICC180 è un derivato bioluminescente di selvaggio tipo C. rodentium ICC169 ^2. Questo ceppo batterico ha il CDABE operone lux compreso un Kgene di resistenza anamycin inserito in un pseudogene di Xyle nel cromosoma ^2.
   • Eseguire tutti coltura batterica utilizzando tecniche standard di asepsi e, se richiesto o l'acquisto di materiali di consumo / reagenti sterili o in autoclave prima dell'uso.
   • Nel passo 2.4, la lettura bioluminescenza (p / s / cm ² / sr) può essere utilizzato per stimare numeri batterico prima l'infezione di topi.

3. L'infezione di topi con bioluminescente C. rodentium e Valutazione della colonizzazione batterica

1. Prima dell'infezione, controllare che vi sia sufficiente ossigeno e isoflurano per la durata della procedura. Se necessario, aggiungere più isofluorane o sostituire la bombola di ossigeno. Successivamente, controllare il peso degli spazzini anestetici, se hanno guadagnato più di 50 g dal loro primo utilizzo, eliminarle e sostituirle con spazzini freschi.
2. Topi anestetizzare con 3% isofluorano utilizzando un XGI-8 anestesiologicaSystem SIA per fornire moderazione umana.
3. Mescolare l'inoculo batterico accuratamente e disegnare 0,2 ml (circa 5 x 10 ⁹ cfu ICC180) nella siringa.
4. Rimuovere i topi dal sistema una anestesia per volta e li stropiccio impugnando saldamente la pelle dietro il collo con il pollice e l'indice.
5. Spingere l'ago sonda gastrica verso il tetto della bocca, sulla lingua, e l'esofago ed iniettare l'inoculo batterico nello stomaco.
6. A seguito di sonda gastrica dei topi, monitorare la loro andatura e la respirazione per segni di sofferenza, che può essere un segno che l'inoculo batterico è stato consegnato nei polmoni. Euthanize eventuali topi che sono stati inoculati nei polmoni.
7. Gavage topi infetti con 200 microlitri di PBS come un controllo del veicolo, come descritto nei passaggi 3,1-3,6.
8. Per confermare che la sonda gastrica è stata eseguita correttamente, immagini infette e finto topi infettati in IVIS Spectrum CT utilizzando BLI e l'impostazione automatica del LivingWizard 4.3.1 immagine come descritto in precedenza ^1.
9. Determinare il numero di batteri vitali nel inoculo mediante diluizione seriale in PBS e spotting in triplicato su LB agar addizionato con kanamicina [50 pg ml ^-1].
10. Calcolare il numero di ICC180 ufc / ml trovando una diluizione dove ci sono circa 5-50 colonie e contare il numero di colonie da ogni spot a questa diluizione e registrare la diluizione che le colonie sono state contate su. Successivamente, calcolare il numero medio di ufc (dai tre macchie) e moltiplicare questo valore per il fattore di diluizione 50 (ogni spot è 20 microlitri del campione originale 1 ml) e la diluizione le colonie sono state contate su, dando cfu / ml.
11. Monitorare colonizzazione dei topi giornalieri raccogliendo feci da ciascun topo in una provetta Eppendorf pre-pesato (pesato su un equilibrio fine) e diluire 1/10 in PBS in base al peso del campione (g 0,1 ml ^-1).
12. Determinare il numero di batteri vitali nelle feci di diluizione del siero in PBS e spotting in triplice copia su LB agar integrato con kanamicina [50 mg ml ^-1].
13. Calcolare il numero di batteri vitali per grammo di feci seguendo passo 3.9, quindi moltiplicare il numero di ufc / ml per il fattore di diluizione fecale in PBS (passo 3.10) di 0,1 g ml ^-1 dare ufc / g.
14. Per determinare che i topi sono stati inoculati con una coltura pura ICC180 e che tutte le colonie sono bioluminescenti. Prendere le piastre di agar dal Punto 3.8, valutare la morfologia delle colonie batteriche o da occhio o scegliere un rappresentante colonia dalla piastra ed analizzare al microscopio ottico. Se necessario, identificazione batterica può essere eseguita da ceppo specifico colonia PCR per valutare la purezza cultura. Successivamente, l'immagine dei piatti in IVIS Spectrum CT utilizzando BLI come descritto al punto 3.7 e verificare che il 100% delle colonie sulla piastra sono bioluminescenti.
    Note:
    • Nel passo 3.4, quando si inserisce l'ago sonda gastrica, Se si avverte resistenza non forzare l'ago sonda gastrica, in quanto questo provoca l'inoculo di andare nei polmoni. Invece, re-inserire l'ago e provare delicatamente di nuovo.
    • Fase 3.1 è opzionale e topi può essere orale gavaged senza anestesia a seconda della politica di benessere degli animali istituti.
    • Sgabelli devono essere placcato il giorno in cui sono stati raccolti. C. rodentium crescerà anche se lasciata a 4 ° C per una notte in PBS e farà sì che la quantificazione del ufc / g feci a non essere corretto.

4. Quotidiano composito 3D diffondere la luce Imaging Tomografia con μCT Imaging (DLIT-μCT) di topi infetti

Di benessere degli animali: DLIT-μCT comporta l'imaging ottico DLIT integrato con una scansione veloce, bassa dose di radiazioni μCT (~ 23 mGy per una scansione di due topo, ~ 53 mGy per una singola scansione del mouse) di un animale immobilizzato. Questa dose si accumula con ogni sessione di imaging, quindi l'obiettivo è mantenere la dose, come low possibile (e sempre ben al di sotto del DL _50/30) mentre ancora realizzare lo studio. In alcuni casi, se non vi è alcun segno di infezione in una scansione BLI convenzionale di topi, la scansione μCT può essere evitato per ridurre ulteriormente la dose. Anche se la dose è mantenuto il più basso possibile, in studi prolungati se c'è qualche preoccupazione per esposizione a radiazioni, topi verranno abbattuti al primo segno di sintomi negativi o alla fine del periodo di imaging μCT.

1. Prima di imaging, inizializzare il IVIS Spectrum CT e verificare che gli interruttori di sicurezza a raggi X stanno lavorando e che la fase di riscaldamento è alla giusta temperatura (37 ° C) per l'imaging. Successivamente, controllare il livello del isoflourane nel sistema anestesia e il peso dei decontaminanti anestetici. Se necessario, aggiungere più isofluorano e se gli spazzini hanno guadagnato più di 50 g dal loro primo utilizzo, eliminarle e sostituirle con spazzini freschi.
2. Impostare il Spectrum CT in modo che i parametri di imaging cheeseguire la funzione di esposizione automatica in Living 4.3.1 immagine sono ottimizzati per l'imaging luciferasi batterica. Selezionare Modifica> Preferenze> Acquisizione e finestra di esposizione automatica. Quindi selezionare> Valori Gamma> Exp. Tempo (secondi) e impostare il> max. a 300s. Infine, selezionare> Obiettivo Conte (minimo)> luminescenti e impostare a 10.000 conteggi.
3. Inserire la piattaforma di imaging un topo nello spettro TC e piombo in anestesia.
4. Accendere l'interblocco di sicurezza a raggi X e inizializzare le IVIS.
5. Una volta che il IVIS Spectrum CT è stata inizializzata, anestetizzare i topi con il 3% di isofluorano utilizzando un XGI-8 Anestesia sistema per fornire moderazione umana.
6. Per determinare se è necessario eseguire una scansione DLIT-μCT, pre-immagine dei topi utilizzando BLI come descritto in precedenza ^1, nella piattaforma di imaging un mouse. Se si ottiene un segnale robusto il mouse è adatto per DLIT imaging. Lasciare il mouse anestetizzato in un topo di imaging platform dopo la scansione BLI pronto per DLIT-μCT.
7. Utilizzare la creazione guidata di imaging nel Living Immagine software 4.3.1 di set-up della scansione DLIT-μCT. La creazione guidata di imaging determina automaticamente il FOV, tempo di esposizione, apertura del diaframma e binning per la DLIT e il FOV, tempo di esposizione, set di filtri e binning per la formazione immagine μCT per dare il miglior rapporto segnale rumore. Quando richiesto dal Imaging guidata, includere solo la 560, 580, 600, e 620 filtri di emissione nm e selezionare la scansione μCT un mouse. Quindi fare clic su> Acquisisci per avviare l'imaging.
8. Ritorna il mouse anestetizzato alla sua gabbia dopo l'imaging, rimuovere la piattaforma di imaging un mouse dalla Spectrum CT e disinfettare con 1% di Tri-gene. Se necessario, sostituire il tampone di schiuma che il mouse è posizionato su per minimizzare il rischio di contaminazione incrociata tra topi.
9. Topi immagini giornaliere fino al giorno 8 dopo l'infezione (PI) utilizzando DLIT-μCT, come descritto nei passaggi 4,1-4,8, per generare i dati di imaging longitudinali necessari per fare un 4D movie di infezione.
   Nota:
   • Nel passo 4.7, si consiglia l'uso dei filtri di emissione 560-620 nm a immagine bioluminescenza batterica. Anche se il picco di bioluminescenza batterica è di circa 485 nm, dovuto ottiche tissutali (la significativa attenuazione dei fotoni blu / verde da tessuto murino), è importante utilizzare i fotoni arancione / rosso per ricostruzioni 3D quanto facilitano il calcolo del segnale di profondità .
   • Le 'auto' impostazioni di esposizione in Living 4.3.1 Immagine per DLIT devono essere adeguate per ottimizzare la quantità di fotoni catturati e il tempo massimo di imaging utilizzata per ogni set di filtri.
   • È solo necessario per eseguire la BLI pre-formazione immagine descritta nel passaggio 4.6 quando il ricercatore non è sicuro se vi è un segnale bioluminescente rilevabile, ad esempio quando si utilizza un nuovo modello di infezione.

5. Ricostruzione 3D di DLIT-μCT Imaging dati

1. Aperto Living Immagine software 4.3.1 e selezionare>, Sfoglia e aprire la cartella contenente i file DLIT-μCT.
2. Aprire il file DLIT-μCT nel Living Image Browser, ad esempio C. rodentium Giorno 1 PI facendo clic su Carica.
3. Nella palette degli strumenti selezionare> topografia di superficie> del mouse Nude, regolare la soglia, e quindi fare clic su> Genera superficiale. Se la ricostruzione della superficie è successo un contorno di superficie viene visualizzata nella finestra di visualizzazione 3D.
4. Per visualizzare la scansione μCT reso nella finestra di visualizzazione 3D, nascondere il contorno della superficie (clicca> strumenti ottici 3D e deselezionare> Display oggetto di superficie), o diminuire l'opacità superficiale (clicca> strumenti ottici 3D e regolare il> cursore opacità).
5. Per fornire dettagliata localizzazione anatomica della ricostruzione DLIT 3D è necessario modificare i dati volumetrici 3D (scansione μCT) in modo che solo scheletro del mouse è visibile e che ha il contrasto ottimale. Fare clic su Strumenti> multimodalità 3D e Istogramma selezionare> logaritmica, Ggardiente Illuminazione, Qualità e Denoise. Infine, regolare il cursore istogramma a destra e guardare i dati volumetrici cambiamento contrasto 3D. Continuare a correggere i dati fino a quando solo le ossa sono chiaramente visibili. Se lo si desidera, cambiare il colore per i punti funzione di trasferimento sull'istogramma.
6. Avanti selezionare> DLIT Ricostruzione 3D nella Palette strumenti e fare in modo che solo la 560, 580, 600, e 620 nm set di filtri, che sono necessari per l'imaging luciferasi batterica in vivo, sono stati selezionati. Fare clic su> Start. Il menu Finestra Anteprima dati apparirà mostrando i segnali di BL spettralmente filtrati dal mouse che è stato ripreso in 2D. Questi segnali vengono thresholded automaticamente dal software, ma possono essere regolati manualmente, se necessario utilizzando schede nella parte inferiore del menu. La soglia determina l'intensità dati minima (rappresentata come percentuale del massimo segnale nell'immagine) che sarà incluso come dati nella ricostruzione.
7. Avanti selezionare> DLIT Ricostruzione 3D nella tavolozza degli strumenti e verificare che le proprietà ottiche utilizzate per la ricostruzione DLIT siano corrette. Selezionare> scheda Proprietà e verificare che le impostazioni per la proprietà del tessuto è impostato su tessuto del mouse, Fonte Spectrum è impostato su batteri.
8. Fare clic su> Ricostruire per eseguire la ricostruzione DLIT.
9. Per generare il DLIT-μCT 3D film click> Strumenti> Animazione 3D e selezionare> Preset Animazioni> CCW asse Y e> Durata totale> 10 sec (25 fotogrammi al secondo). Una volta che le impostazioni per l'animazione 3D sono corretti premere> registrare e salvare le ricostruzioni 3D DLIT-μCT come. File avi etichettati con punto di esperimento, di gruppo e di tempo in una cartella separata.
   Nota:
   • E 'importante quando si eseguono ricostruzioni 3D di dati DLIT-μCT di utilizzare un PC con Living 4.3.1 Immagine e pacchetto di servizi 1 installato e che il PC ha una scheda grafica adatta per l'esecuzione del software di imaging multi-modalità. Thè il software può essere scaricato e specifiche GPU sono contenuti nelle note di rilascio ( http://www.caliperls.com/support/software-downloads.htm ).
   • Se le ricostruzioni 3D DLIT-μCT appaiono indietro dopo essere stato salvato, il vostro computer è in esecuzione una versione del proprio driver grafico e questo può essere risolto scaricando un aggiornamento dal sito del produttore.
   • Nel passaggio 5, presentiamo le nostre impostazioni preferite per la generazione di ricostruzioni 3D DLIT-μCT. Tuttavia, ci sono più punti durante le ricostruzioni 3D in cui i parametri che non sono discussi in questo protocollo possono essere modificate. Per una guida completa per ricostruzioni 3D con Living Immagine 4.3.1 fare riferimento al manuale di istruzioni dei costruttori.
   • E 'importante creare le ricostruzioni 3D utilizzando le medesime impostazioni nel tool di imaging multi-modalità in modo che siano comparabili. Oltrequesto, quando si creano le ricostruzioni 3D DLIT-μCT, è importante per rendere i video utilizzando lo stesso numero di fotogrammi al secondo e la durata totale (lunghezza), in caso contrario i tempi del video 4D non è omogeneo.

6. Generazione di un film 4D di C. rodentium Infezione

1. Chiaramente etichettare tutte le ricostruzioni 3D DLIT-μCT con l'esperimento giusto, punto di tempo e di gruppo in una cartella facilmente accessibile.
2. Creare un nuovo file in Windows Live Movie Maker e inserire le ricostruzioni DLIT-μCT in ordine cronologico a partire dal giorno 1 PI utilizzando la scheda strumenti dalla cartella preparato al punto 6.1.
3. Aggiungi didascalie alle all'inizio di ogni video che descrive il punto di tempo, ad esempio Giorno 1 PI selezionando il video DLIT-μCT appropriata e selezionando Home> Aggiungi didascalia. Viene visualizzata una casella di testo sullo schermo, dove viene aggiunta la leggenda appropriato. Regolare la dimensione del carattere, lo stile, il colore, e la giustificazione come desIred utilizzando schede identiche a Microsoft Word sulla barra degli strumenti del software. Infine, spostare la didascalia in alto a sinistra del video.
4. Ripetere il punto 7.3 per tutti i video DLIT-μCT.
5. Aggiungi una pagina di titolo, per esempio C. rodentium giorni dall'infezione 1-8 cliccando Inizio> titolo. Viene visualizzata una casella di testo sullo schermo in cui è inserito il titolo appropriato per una diapositiva vuota. Regolare la dimensione del carattere, lo stile, il colore, e la giustificazione a piacere utilizzando le schede identiche a Microsoft Word sulla barra degli strumenti del software.
6. Salvare il progetto come progetto di movie maker * MMP in una cartella appropriata con il titolo del film. Questo passaggio è fondamentale se si vuole modificare il filmato.
7. Salvare il filmato come file. Wmv. Fare clic sul menu Movie Maker> Salva filmato> per computer.
8. Convertire il file Movie Maker utilizzando un convertitore di file in. Avi o un altro tipo di file adatto compatibile con il computer.
   Note:
   • Si raccomanda che il cinema 4Dsono generati su un PC con Windows Live Movie Maker installato ( http://windows.microsoft.com/en-GB/windows7/products/features/movie-maker ) e un buon programma multimediale in grado di riprodurre. wmv o. avi tipi di file.

Representative Results

Infezione di topi C57BL/6J con 5 x 10 ⁹ cfu C. rodentium è un modello di infezione batterica ben descritto e si traduce in una infezione gastrointestinale autolimitante che picchi compresi tra 6-8 giorni dopo l'infezione e dura da 3 a 4 settimane ^2,14. L'infezione è confinata al lume intestinale da parte del sistema immunitario murino e di conseguenza, i batteri sono continuamente escreto nelle feci. La colonizzazione di topi di C. rodentium può essere monitorato in modo non invasivo per enumerazione batterica diretta da feci o di imaging bioluminescenza ^2,3.

Questo manoscritto descrive un protocollo ottimizzato per l'esecuzione di 3D e 4D multimodalità di imaging di C. rodentium all'interno di topi per monitorare carica batterica e la localizzazione durante l'infezione. I risultati presentati in Figura 1 dimostrano i controlli necessari per il successo di imaging 4D. Prima l'infezione di topi è essenziale dissuaderemia che l'inoculo batterico usato è bioluminescente (Figura 1A) e che in seguito alla sonda gastrica di un topo con bioluminescente C. rodentium, che il segnale può essere osservato nello stomaco dell'animale e non nei polmoni (Figura 1B) ^16.

Oltre al monitoraggio colonizzazione batterica utilizzando l'imaging bioluminescenza, è buona norma quantificare numeri batterici nelle feci; che viene utilizzato come una misura indiretta di colonizzazione batterica della mucosa gastrointestinale Figura 2 dimostra la tipica carica batterica nelle feci tratto da 8 C57BL6 / J. i topi che sono stati infettati con ~ 5 x 10 ⁹ cfu ICC180 e monitorati per 8 giorni PI colonizzazione aumenta dal giorno 2 PI fino a 6-7 giorni in cui i picchi di infezione a ~ 5 x ¹⁰ 10 ufc / g, che è in linea con le precedenti relazioni ^2,3,17.

Per sottolineare l'importanza della valutazioneting la diffusione dell'infezione in un singolo mouse, figure 1b e 3, così come il video 1 sono state generate dallo stesso topo seguendo C. infezione rodentium, come descritto sopra. Quotidiano DLIT-μCT stato utilizzato per valutare la distribuzione spaziale dei batteri bioluminescenti all'interno di questo mouse, usare lo scheletro come un riferimento anatomico. Figura 3 dimostra la ricostruzione DLIT-μCT di un mouse C57BL/6J infettati con ICC180 a 3 punti chiave di volta PI A giorno 3 PI piccolo bioluminescente foci può essere osservato nel colon, che presentano un moderato aumento dell'intensità bioluminescenza di giorno 5 PI con modeste variazioni distribuzione spaziale. Al giorno 7 PI abbiamo osservato un significativo aumento della bioluminescenza e il bioluminescente focolai sparsi in tutto il colon.

Video 1 è una raccolta di ricostruzioni 3D DLIT-μCT da giorni 1-8 proporzionale con ICC180 e illustra C.rodentium all'interno del tratto gastrointestinale prossimale tra i giorni 1-2 PI che si estende per i due punti al giorno 3 PI Da giorni 4-6 PI il numero di batteri presenti nel colon si espandono fino ad un massimo del 7 ° giorno PI dove i fuochi batterica copre l'intero colon. Al giorno 8 PI soli due fuochi distinti batteriche sono presenti nel colon prossimale e distale. La possibilità di visualizzare la ricostruzione 3D completa in ogni punto in ordine cronologico, rappresenta un potente strumento per analizzare le interazioni patogeno ospitanti ed è più facile da interpretare che un 3D ancora dello stesso insieme di dati.

Figura 1. Bioluminescenza immagini 2D di A) Bioluminescent C. rodentium ICC180 inoculo e B) un mouse a seguito di sonda gastrica, con 200 ml di inoculo. Punta di freccia (>) illustra bioluminescenti C. rodentium em> nello stomaco.

Figura 2. C. dinamiche di colonizzazione rodentium. Quantificazione di C. rodentium unità formanti colonia di feci per 8 giorni PI

Figura 3. Diffuse luce di imaging tomografia-μCT scansione di bioluminescenti C. infezione rodentium da un topo monitorata al giorno 3, 5 e 7 PI Arrowhead (>) illustra la colonizzazione del colon. Clicca qui per ingrandire la figura .

Video 1.p :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/50450/LAB_MEDIA_50450_Frankel_Video1.wmv "target =" _blank "> Clicca qui per vedere il video. cinema 4D di infezione da C. rodentium da un topo monitorato da giorni 1-8 PI

Discussion

Il film 4D di infezione batterica fornisce un utile strumento per visualizzare e interpretare grandi quantità di dati di immagini in multimodalità modo rapido e semplice. Questa tecnica facilita l'analisi dettagliata di come una infezione diffonde attraverso un individuo mouse e può essere usato per studiare come ospite o delezione di geni batterici o particolare intervento strategie effetto carica batterica, distribuzione e localizzazione durante uno studio longitudinale ^7. Questi video offrono anche strumenti didattici utili e strumento di diffusione delle informazioni al pubblico.

Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo che potrebbero influenzare la qualità dei dati ottenuti da DLIT-μCT imaging e la possibilità di compilare un video 4D di infezione. La parte più importante di questo protocollo è l'infezione di successo e omogenea di topi con C. rodentium. E 'essenziale che i topi utilizzati per lo studio sono tra 18-20 g, e che il bacteinoculums rial sono preparati al momento e di circa 5 x 10 ⁹ cfu, come descritto in precedenza ^2,3. Prima dell'infezione dei topi, è importante controllare che l'inoculo è bioluminescente usando l'Spectrum TC e una volta che l'inoculo è stato preparato, esso deve essere continuamente omogeneizzata prima di ogni topo è gavaged per assicurare che i topi ricevono dosi infettive simili. La formazione immagine DLIT-μCT di topi è stato ottimizzato in modo che la funzione di esposizione automatica in Living software 4.3.1 Immagine determina automaticamente i parametri di imaging ottimizzati per il segnale di essere ben al di sopra del rumore. Tuttavia, la funzione di esposizione automatica si basa su impostazioni definite dall'utente ei parametri che devono essere modificati come descritto nella procedura. In caso contrario, questo si tradurrà in immagini povere, con un basso numero di fotoni raccolti che non si traduca in una progressione evidente l'infezione, come sono programmate le impostazioni di fabbrica della Spectrum CT per esposizione automatica per i tumori di imaging espressionelucciola luciferasi. Ricostruzioni eseguite utilizzando 560-620 nm danno il miglior accordo tra i dati simulati e misurati e, pertanto, sono i dati più affidabili per includere nella ricostruzione.

Una limitazione all'uso di DLIT-μCT è che le radiazioni ionizzanti dalla scansione μCT provoca danni da radiazioni sub-letale che 'cumulativo in uno studio longitudinale ^18. Esposizione a radiazioni sub-letale può indebolire la risposta immunitaria, causare danni al DNA e apoptosi in organi interni ^19. In definitiva, i danni da radiazione sub-letali cumulativo può causare la morte se il DL _50/30 per le radiazioni ionizzanti è superato, che è tra i 5-7 Gy a seconda del ceppo del mouse e l'età dei topi utilizzati ^18,20,21. Anche se alcuni dei danni molecolari dalle radiazioni ionizzanti può guarire, in quanto il principio generale è quello di stimare la dose conservativamente, questo non è in genere rappresentato nella pianificazione studio. Invece, l'obiettivo è quello di rimanere il più below questi limiti possibile, pur compiendo gli obiettivi di studio. Ciò è particolarmente importante in questo studio perché la normale risposta immunitaria all'infezione, la frequenza delle immagini, e il fatto che transgenico, immuno-composto, o fortemente infettati animali può essere più suscettibile a radiazioni ionizzanti.

Pianificare l'esperimento per generare un film 4D di infezione, è importante considerare la durata dell'esperimento, il numero di scansioni μCT richiesto durante questo periodo e la DL _50/30 per la radiazione ionizzante per il ceppo mouse utilizzato. Un altro limite potenziale DLIT-μCT è la forza dell'espressione giornalista all'interno del ceppo batterico utilizzato, come questo influirà limiti di rivelazione batteriche e tempi di imaging. E 'altamente raccomandato che i ricercatori utilizzano convalidati ceppi batterici che sono completamente virulento, ma ottimizzato per la massima espressione operone lux, come dimostrato in precedenza per BLI2,3.

Un avvertimento per il design attuale del imaging 4D è che ogni film è composto da singole scansioni DLIT-μCT che hanno diversa scalatura fotone. Questo può rendere le immagini di difficile interpretazione se le modifiche alla localizzazione del BL focolai, o la sua intensità sono sottili, o se c'è un fuoco intenso BL circondato da focolai multipli debole. Pertanto, per visualizzazioni longitudinali, è importante mantenere le barre di colore coerente di tutti i punti di tempo.

Il concetto di un film 4D di infezione può essere applicato a qualsiasi agente patogeno batterico opportunamente etichettato. Il futuro sviluppo di questa tecnica avrà lo scopo di utilizzare la tomografia imaging di fluorescenza (FLIT), così come DLIT per facilitare la ricerca di risposte dell'ospite alle infezioni utilizzando una combinazione di agenti patogeni batterici bioluminescenti e iniettabili fluorescenti vicino i raggi infrarossi per indagare risposta dell'ospite alle infezioni. , Abbiamo solo Oltre a questo in questo protocollodescrivere l'uso di batteri bioluminescenti per creare 4D film di infezione. Tuttavia, in alcuni casi, può essere necessario utilizzare fluorescenti batteri etichettati, per esempio con i tag IRFP, in modo che il reporter bioluminescenza può essere usato per studiare la genetica ospitanti durante l'infezione. È importante sottolineare che l'uso di immagini multi-modalità che combina DLIT / FLIT-μCT ci permetterà di studiare in modo non invasivo più parametri nel corso di una infezione batterica, che contribuirà in modo significativo alla riduzione, perfezionamento, e di sostituire l'uso degli animali nella ricerca scientifica come delineato nella iniziativa del NC3R ( http://www.nc3rs.org.uk/ ).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bioluminescent C. rodentium	Frankel lab	ICC180	Wiles et al., 2004
Veet	Boots		Optimal depilation time is 7 min. Depilation works better if the cream is rubbed in well.
Isofluorane (100% v/v)	Abbott	B506
Medical Oxygen	BOC Medical		Size F Cylinder. Note: an appropriate regulator is required.
Luria Bertani broth	Merck	1.10285.0500	25 g in 1L Demineralised water.
Luria Bertani agar	Merck	1.10283.0500	37 g in 1L Demineralised water.
Kanamycin sulphate	Sigma (Fluka)	60615
50 ml Polypropylene conical Falcon tubes	BD (Falcon)	352070
Universals	Corning (Gosselin)	E5633-063
1 ml syringe	BD (Plastipak)	300013
Oral dosing needle (16G x 75 mm) curved	Vet Tech	DE005
Microbanks (Cryovial)	Pro-Lab Diagnostics	PL.170/Y
IVIS Spectrum CT	Caliper- a PerkinElmer Company	133577 Rev A/ Spectrum CT
6kVA UPS	Caliper- a PerkinElmer Company
XGI-8 anesthesia system	Caliper- a PerkinElmer Company	118918
XAF-8 Anaesthesia filter charcoal	Caliper- a PerkinElmer Company	118999/00
Living Image v4.3.1 SP1	Caliper- a PerkinElmer Company
Benchtop shaking incubator	New Brunswick Scientific	Innova 44