Summary
Мы рассматриваем наши последние результаты по интеграции флуоресцентной микроскопии и обработки изображений инструментов проточной цитометрии на мобильный телефон с помощью компактной и экономически эффективных оптико-жидкостный вложений. Эти сотовый телефон основе анализа микро-устройства могут быть полезны для цитометрии, таких как выполнение различных задач подсчета клеток, а также для высокопроизводительного скрининга, например, пробы воды в условиях ограниченных ресурсов.
Abstract
Флуоресцентная микроскопия и проточной цитометрии широко используемые инструменты в биомедицинских исследованиях и клинической диагностики. Однако эти устройства в целом относительно громоздкие и дорогостоящие, что делает их менее эффективными в условиях ограниченных ресурсов. Для потенциально преодолеть эти ограничения, мы недавно продемонстрирована интеграция широкого поля флуоресцентной микроскопии и обработки изображений инструментов проточной цитометрии на сотовые телефоны с использованием компактного, легкого и экономически эффективных оптико-жидкостный вложений. В нашей конструкции проточной цитометрии, флуоресцентно меченые клетки промыть микрофлюидных канала, который расположен над существующими сотовый телефон камеры. С питанием от батареи светоизлучающих диодов (СИД) являются стыковых связан с этой стороны микрофлюидный чип, который эффективно действует как многомодовый волновод плите, где возбуждающего света направляется к равномерно возбуждения флуоресцентного целей. В сотовом телефоне камера записывает фильм промежуток времени флуоресцентных клеток, протекающего черезмикрофлюидных канала, где цифровые рамки этого фильма обрабатываются для подсчета количества меченых клеток в рамках целевой решение интереса. Используя аналогичный оптико-жидкостный дизайн, мы можем также изображения этих флуоресцентно меченых клеток в статическом режиме, например, сэндвич флуоресцентные частицы между двумя предметные стекла и захватив их флуоресцентные изображения с помощью мобильного телефона камеры, которая может достичь пространственного разрешения, например ~ 10 мкм на очень большой поля-зрения ~ 81 мм 2. Этот сотовый телефон основе флуоресцентной проточной цитометрии изображений и микроскопии платформа может быть полезно, особенно в условиях ограниченных ресурсов, например, для подсчета CD4 + Т-клетки к мониторингу ВИЧ + пациентов или для обнаружения водного паразитов в питьевой воде.
Introduction
Микроскопии и проточной цитометрии широко используются методы 1-12 в биомедицинских и научных исследований, а также клинический диагноз для подсчета и характеристика различных типов клеток. Однако, обычные микроскопы и проточной цитометрии инструменты являются относительно сложными и дорогостоящими, что ограничивает их использование в основном устоявшихся центральной лаборатории. Недавно мы разработали компактный и легкий флуоресцентные цитометрии изображений и микроскопии устройства интегрированы на сотовый телефон, 13,14, который показывает обещание экономически эффективно переводить флуоресцентной микроскопии, проточной цитометрии и связанные с ними микро-анализ методов ограниченных ресурсов среды для различных приложений телемедицины воздействия глобального здравоохранения.
В optofluidic проточной цитометрии конфигурации (см., например, рис 1С и 1D), специально разработанный polydimethysiloxane (PDMS) на основе микрофлюидных канал positioneD перед сотовый телефон камеры блока, где светоизлучающие диоды (СИД) являются стыковых связаны с краями канала. Это микрофлюидных чипов, вместе с жидкостью внутри образца, образует оптико-жидкостный планарного волновода (состоит из, например, PDMS-жидкость-PDMS), что возбуждающего света направляется к равномерно перекачивать помечены флуоресцентным образцов внутри микро-каналов. Флуоресцентное излучение от этих объектов помечены, например, клетки, далее отображаемого через дополнительную линзу помещают сразу после сотовый телефон камерой устройства и отображается на сотовый телефон комплементарных металло-оксидных полупроводников (CMOS) сенсор изображения. Так как флуоресцентное излучение собирается перпендикулярно пути света возбуждения, недорогой пластиковый фильтр поглощения достаточно, чтобы удалить рассеянного света возбуждения и может обеспечить достойную темном поле фоне необходимых для флуоресцентных изображений. Используя аналогичный оптико-жидкостный дизайна, мы также можем изображений флуоресцентных объектов в статIC режиме (см. рис 1А и 1В), в которых флуоресцентные частицы зажата между двумя стеклами, а протекающий через микрофлюидных каналов и флуоресцентное излучение от этих флуоресцентные частицы захватываются сотовый телефон CMOS датчик изображения для подсчета частиц и характеристике. На основании различных требований приложений, проточной цитометрии или широким полем флуоресцентной микроскопии могут быть выбраны. Например, сотовый телефон проточной цитометрии устройство может быть особенно полезным для скрининга больших объемов жидких проб (например, несколько мл) для обнаружения редких клеток или патогенных микроорганизмов.
В этой рукописи мы рассмотрим некоторые из наших последних результатов по интеграции флуоресцентной микроскопии и обработки изображений инструментов проточной цитометрии на мобильный телефон с помощью компактной и экономически эффективных оптико-жидкостный вложений. Эти мобильного телефона на основе микро-анализа, визуализации цитометрии и зондирования платформы могут предоставить различные возможностидля телемедицины и точка-в-санитарной диагностики, особенно жителей нашей борьбе против глобальных проблем здравоохранения в условиях ограниченных ресурсов регионов мира.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
В этом разделе мы рассмотрим экспериментальные протоколы для наших мобильных телефонов основе широкого поля флуоресцентной микроскопии 13 и оптико-жидкостной цитометрии изображений платформе 14. Мы будем использовать флуоресцентные шарики и флуоресцентно меченые белые клетки крови, чтобы проверить эти изображения платформ.
А. Подготовка сотового телефона основании Широкие поля флуоресцентного микроскопа и оптико-жидкостный поток изображений Цитометр
Сотовый телефон на базе широкого поля флуоресцентного микроскопа или проточной цитометрии состоит из двух основных частей: камеры телефона и компактный оптико-жидкостный дополнительных вложений.
1. Камера телефона
В то время как представленные методы применимы практически к любой камере телефона, мы выбрали Sony Erickson Aino в качестве основы для этих устройств. Этот сотовый телефон имеет ~ 8-мегапиксельная КМОП-матрица RGB установленной на нем и встроенный в объектив, который имеет фокусное расстояние (F 1), ~ 4,65 мм. 2. Оптико-жидкостный Приложение для широкого поля флуоресцентной микроскопии
Оптической привязанности разработан Autodesk и печатается измерение Elite 3-D принтер с помощью ABSplus термопластичного материала. В этом процессе печати, модель и вспомогательные материалы нагревают в экструзионной головки в принтере и наносят слой за слоем по моделированию базы. Когда этот этап будет завершен, вспомогательных материалов может быть распущен, оставив надежную 3D модель желаемого прототип Наша оптическая конструкция вложения состоят из светодиодов (длина волны центра при ~ 470 нм, Интегральные микросхемы), пластиковый фильтр (# NT54-46, Эдмунд Оптика), образец лоток и плоско-выпуклой линзы F 2 = 15 мм (# NT45-302, Эдмунд оптики). Все светодиоды и пластиковые фильтры могут быть легко изменены на основе спектров флуорофоров. Шаги для сборки этого оптико-жидкостный вложения включают в себя:
- Поместите линзу в приложении в пределах своей конкретной позиции держателя линзы.
- Поместите пластиковый фильтр на фильтр лотка и вставьте ее в привязанности, или ленты пластиковый фильтр в передней части мобильного телефона объектив камеры.
- Вставьте лоток в светодиодных вложения.
- Поместите слайды образца стекла в образец лоток. Вставьте образец лоток в приложении. Лицом светодиодов к образцу.
- Клип вложений на мобильный телефон, так что дополнительный объектив непосредственно в контакте с мобильного телефона объектив камеры.
- С помощью переключателя на вложение, чтобы включить светодиоды.
- Изображение образца интересов с мобильного телефона камеры устройство с помощью своей "ночной режим".
3. Оптико-жидкостный Приложение для люминесцентных цитометрии изображений
Когда есть необходимость скрининга больших объемов жидких проб для выявления редких событий, optofluidic устройстве проточной цитометрии можно было бы предпочтительнее. Мы можем изменить наши широким полем флуоресцентного микроскопа дизайн и превратить его в проточной цитометрии, шЗдесь PDMS на основе микрофлюидных канал используется для постоянного доставить жидкого образца через визуализация объема. Оптической привязанности также разработан Autodesk и печатается измерение Elite 3-D принтер. Она также состоит из светодиодов (длина волны центра при ~ 470 нм, Интегральные микросхемы), пластиковый фильтр (# NT54-46, Эдмунд оптики), образец лоток и асферические линзы (F = 4,5 мм) (продукт # C230TME-A; Thorlab). Шаги для сборки этого оптико-жидкостный вложения включают в себя:
- Поместите асферических линз в приложении.
- Поместите пластиковый фильтр на фильтр лотка и вставьте ее в привязанности, или ленты пластиковый фильтр перед объективом камеры мобильного телефона.
- Вставьте микрофлюидных канал в то же оптико-жидкостный вложений.
- Клип вложений на сотовый телефон такой, что дополнительные линзы непосредственно в контакте с мобильного телефона объектив камеры.
- С помощью переключателя на вложение, чтобы включить светодиоды.
- Подключите микрофлюидныхИК канал в шприцевой насос, и поставлять жидкого образца в микрофлюидных устройства с постоянной скоростью потока.
- Захват фильм флуоресцентных клеток / частиц, протекающей через микрофлюидных канал с помощью режима видео в мобильный телефон камеры.
B. Подготовка проб
4. Подготовка флуоресцентные микрочастицы Образцы
- Флуоресцентные бусины с диаметром 10 мкм (красные шарики: продукт # F8834 возбуждение / излучение 580nm/605nm, зеленый бисер: продукт # F8836: возбуждение / излучение 505nm/515nm) приобретены у Invitrogen (Карлсбад, Калифорния).
- Смешать 10 мкл зеленого флуоресцентного бисером, 10 мкл красного флуоресцентного бусины с 40 мкл дистиллированной воды.
- Place10 мкл этой смеси шарик на стекле помощью микропипетки и положить другого стекло в верхней части его, чтобы сделать бутерброд структуры.
- Вставьте эту структуру сэндвича в образец лоток и вставьте ее в мобильный телефон приложение.
5. Подготовка флуоресцентно меченые белые клетки крови
- Возьмите SYTO16 нуклеиновой кислоты флуоресцентные маркировки Kit (# S7578, Life Technology) и фосфатным буферным раствором (PBS) из холодильника и довести их до комнатной температуры.
- Передача 200 мкл пробы цельной крови с EDTA трубки для сбора крови до 1,5 мл полистирола трубки (# 05-408-129, Fisher Scientific).
- Добавить 1 мл эритроцитов лизирующего буфера (# R7757, Sigma-Aldrich) в 200 мкл пробы цельной крови и тщательно перемешайте.
- Через 5 мин, центрифугируют лизированных образцов крови и удалить супернатант решение.
- Ресуспендируют белых кровяных клеток гранулы в 200 мкл буфера PBS и осторожно смешать их.
- Добавьте 5 мкл 1 мМ SYTO16 решение белые образцы клеток крови. Оберните образца с алюминиевой фольгой и выдержите в темном окружающей среды в течение ~ 30 мин.
- Центрифуга образца снова. Супернатант удаляют и меченые белые клетки крови, осадок повторноВзвешенных в буфере PBS.
- Поместите 5-10 мкл меченых белых кровяных клеток жидкого образца для покровного стекла, и разместить второй скольжения крышки на верхней части образца.
- Вставьте зажат образца слайдов в лоток образца и изображения, используя сотовый телефон флуоресцентного микроскопа.
Поочередно
- Постоянно доставить флуоресцентно меченые белые клетки крови через микрофлюидных каналов с использованием автоматизированной шприцевой насос, а также захват флуоресцентные микроскопических фильм течет клетки, используя сотовый телефон камеры в режиме видео. Мы также должны подчеркнуть, что портативные батарейках насоса шприца или даже сила тяжести может быть использован для управления потоком через микрофлюидных каналов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С нашей оптико-жидкостный накачки / возбуждение схеме (рис. 1С и 1D), флуоресцентно меченых клеток может быть непрерывно доставляется в микрофлюидных канала с помощью шприца в то время как сотовый телефон камера записывает покадровой флуоресцентные микроскопических фильм течет клеток. Эти флуоресцентные фильмы могут быть быстро проанализированы с помощью контура обнаружения и отслеживания алгоритмов 14,15 автоматически определить абсолютное число и плотность клеток, протекающей через микрофлюидных каналов, с функцией флуоресцентных изображений потока цитометрии. На основании описанной выше платформы (рис. 1С и 1D) и протоколы подготовки проб, мы показали, точный подсчет общего белой крови клеток (лейкоцитов) в образцах крови человека, достижения сопоставимых результатов от стандартных гематологического анализатора 14. Кроме того, мы можем Также изображений флуоресцентных клеток / частицв статическом режиме, 13 таких, что без жидкостного потока, достижение очень большая выборка поля-обзора, например, ~ 81 мм 2 с пространственным разрешением ~ 10 мкм, как показано, например, в рисунках 2 и 3. Источники оптических аберраций может быть уменьшен путем разработки более сложной системы линз. Кроме того, она также может быть частично устранены с помощью цифровой обработки изображения, характеризующие источник аберрации и их пространственных моделей.
Рисунок 1. (A) схематическое и (Б) изображение мобильного телефона на основе широкого поля флуоресцентного микроскопа. 13 (C) Схематическое изображение и (D)картина сотовый телефон на основе цитометра изображений 14. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
На рис. 2 производительность наших мобильных телефонов на основе флуоресцентного микроскопа 13, характеризуются изображений флуоресцентных бусин (10 мкм в диаметре зеленые и красные бусы, красный шарик возбуждение / излучение: 580 nm/605 нм, зеленый шарик возбуждения: 505 нм nm/515 ). Достойное качество изображения достигается за поля-зрения ~ 81 мм 2, см. (A, B, C). Ближе к краям этого центрального поля-обзора, есть аберрированных регионов; см., например, (DE).
Рисунок 3 Top изображений. Мобильный телефон изображения флуоресцентно меченые белые кровяные клетки 13 (А-1). Цифровое увеличение мобильного телефона образ флуоресцентно меченые белые кровяные клетки обрезана сверху изображения. (А-2): сжатие декодирования результатов 18 для сотового телефона изображение, показанное на (A-1). (A-3): Обычные флуоресцентный микроскоп (10X цель, NA = 0,25) сравнение изображений одного и того же поля зрения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы представили наши последние результаты на сотовый телефон основе широкого поля флуоресцентной микроскопии и оптико-жидкостный изображений проточной цитометрии с использованием легкого и компактного оптико-жидкостный вложения в мобильный телефон камеры. Использование этой технологической платформы мы отображаемого флуоресцентных объектов, включая микро-частицы и надписью белых кровяных клеток в образцах цельной крови. Таким образом, этот компактный и экономически эффективный мобильный телефон на основе флуоресцентных инструментов визуализации может быть полезно для точка-в-санитарной диагностики, особенно в условиях ограниченных ресурсов регионов для борьбы с различными глобальными проблемами со здоровьем, такими как мониторинг ВИЧ + пациентов для их CD4 + Т-лимфоцитов считается .
Кроме анализа жидкостей организма, так же сотовый телефон на основе оптико-жидкостной цитометрии платформа также может быть полезным для других нужд зондирования, таких как количественного флуоресцентного иммуноанализа, например, для мониторинга воды / качества продуктов питания в условиях ограниченных ресурсов. С этой целью мы недавно демо-nstrated чувствительных, конкретных и быстрое обнаружение кишечной палочки O157: H7 (кишечная палочка) в воде и молоке образцы, используя тот же оптико-жидкостный мобильный телефон приложение 16. Мы использовали поверхности функционализированных стеклянных капилляров конкретно и чутко улавливать E. палочки частиц в жидких пробах, которые были перелетела через каждый капилляр. Они захватили E. палочки частиц дальнейшем помечены квантовых точек (КТ), сопряженных вторичными антителами. Флуоресцентное излучение от этих функционализированных капилляров тогда, обнаруженных с применением оптико-жидкостный сотовый телефон платформы визуализации и комплексного интенсивности флуоресценции вдоль длины капилляра была использована для оценки плотности захваченных E. палочки частиц в мишени решение. Благодаря этому оптико-жидкостный подход, мы показали, предел обнаружения ~ 5-10 КОЕ / мл в воде и молоке образцы 16.
Наконец, мы должны отметить, что в зависимости от тОн потребностями приложений, оптическое увеличение и разрешение этой платформе могут быть настроены путем изменения F / 2, где F является фокусное расстояние сотового телефона объектив камеры и F 2, фокусное расстояние объектива внешние (рис. 1А) . В дополнение к системе увеличением, мы также должны отметить, что светодиодные панели задач и фильтр связанного могут быть легко изменены в разные цвета, чтобы приспособить для различных флуорофоров или даже иммунохроматографического анализа, который может быть использован в конкретных приложениях 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Доктор Озджан является основателем старт-ап компании, которая направлена на коммерциализацию вычислительной визуализации и микроскопии инструментов.
Acknowledgments
А. Озджан благодарит за поддержку Президента Ранняя карьера премии для ученых и инженеров (PECASE), армии Research Office (ARO) премия для молодых следователь, Национальный научный фонд (NSF) КАРЬЕРА Award, Управления морских исследований (ОНР) премия для молодых следователь и Национального института здоровья (NIH) Новый Новатор директора премии DP2OD006427 из канцелярии директора Национального института здоровья.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell-phone | Sony | Sony Ericsson Aino | |
| Plano-convex lens | Edmund Optics | # NT45-302 | |
| Aspherical lens | Thorlab | # C230TME-A | |
| Filter | Edmund Optics | #NT54-46 | |
| Blue LED | Digikey | #365-1201-ND | |
| Battery | Digikey | #P032-ND | |
| Polystyrene tube | Fisher Scientific | #05-408-129 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma Aldrich | R7757 | |
| SYLGARD 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dow Corning | ||
| Red fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8834 | |
| Green fluorescent beads (10 μm) | Life Technologies | #F8836 | |
| SYTO16 nucleic acid fluorescent labeling | Life Technologies | # S7578 |
References
- Sklar, L. A. Flow Cytometry for BioTechnology. , Oxford University Press Inc. (2005).
- Nunez, R. Flow cytometry for research scientists: principle and applications. , Horizon Press. Wymondham, UK. (2001).
- Mertz, J. Introduction to optical microscopy. , Roberts and company publishers. Colorado, USA. (2010).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nature Methods. 7, 603-614 (2010).
- Hell, S. W.
- Gustafsson, M. G. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 102, 13081-13086 (2005).
- Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM. Nature Methods. 3, 793-796 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophysical Journal. 91, 4258-4272 (2006).
- Ma, Z., Gerton, J. M., Wade, L. A., Quake, S. R. Fluorescence near-field microscopy of DNA at sub-10 nm resolution. Physical Review Letters. 97, 260801 (2006).
- Chung, E., Kim, D., Cui, Y., Kim, Y., So, P. T. Two-dimensional standing wave total internal reflection fluorescence microscopy: superresolution imaging of single molecular and biological specimens. Biophysical Journal. 93, 1747-1757 (2007).
- Greenbaum, A., Luo, W., Su, T. -W., Göröcs, Z., Xue, L., Isikman, S. O., Coskun, A. F., Mudanyali, O., Ozcan, A. Imaging without lenses: achievements and remaining challenges of wide-field on-chip microscopy. Nature Methods. 9, 889-895 (2012).
- Zhu, H., Yaglidere, O., Su, T. -W., Tseng, D., Ozcan, A. Cost-effective and compact wide-field fluorescent imaging on a cell-phone. Lab on a Chip. 11 (2), 315-322 (2011).
- Zhu, H., Mavandadi, S., Coskun, A. F., Yaglidere, O., Ozcan, A. Optofluidic fluorescent imaging cytometry on a cell phone. Analytical Chemistry. 83, 6641-6647 (2011).
- Suzuki, S., Abe, K.
- Zhu, H., Sikora, U., Ozcan, A. Quantum dot enabled detection of Escherichia coli using a cell-phone. Analyst. 137, 2541-2544 (2012).
- Mudanyali, O., Dimitrov, S., Sikora, U., Padmanabhan, S., Navruz, I., Ozcan, A. Integrated Rapid-Diagnostic-Test Reader Platform on a Cellphone. Lab on a Chip. 12 (15), (2012).
- Candes, E. J., Romberg, J. K., Tao, T. Stable signal recovery from incomplete and inaccurate measurements. Communication of Pure and Applied Mathematics. 59, 1207-1223 (2006).
