Summary
Sono descritti metodi per creare tessuti tumorali 3D umani come sistemi di test. Queste tecnologie si basano su un decellularized biologica vascolarizzato impalcatura (BioVaSc), cellule umane primarie e una linea di cellule tumorali, che possono essere coltivate in condizioni statiche e in condizioni dinamiche in un bioreattore flusso.
Abstract
Il cancro è una delle principali cause di morte nel mondo. Strategie terapeutiche attuali sono prevalentemente sviluppate in sistemi di coltura 2D, che riflettono adeguatamente le condizioni fisiologiche in vivo. Matrici biologiche 3D forniscono cellule un ambiente in cui le cellule possono auto-organizzarsi, permettendo lo studio dell'organizzazione dei tessuti e la differenziazione cellulare. Tali ponteggi possono essere seminati con una miscela di diversi tipi di cellule per studiare cellula-cellula-interazioni dirette 3D. Per simulare la complessità 3D dei tumori del cancro, il nostro gruppo ha sviluppato un sistema di test 3D in vitro del tumore.
I nostri modelli 3D sistema di test tessuto la situazione in vivo di tumori maligni dei nervi periferici guaina (MPNSTs), che abbiamo instaurato con la nostra decellularized suina segmento digiunale derivata scaffold vascolarizzato biologico (BioVaSc). Nel nostro modello, abbiamo reseeded una matrice BioVaSc modificato con fibroblasti, cellule endoteliali microvascolari (mvECs) e la linea cellulare tumorale S462. Per la cultura statica, la struttura vascolare del BioVaSc viene rimosso e l'impalcatura rimanente viene tagliato aperto su un lato (Small Intestinal Sottomucosa SIS-MUC). La matrice risultante viene poi fissato tra due anelli in metallo (corone cellulari).
Un'altra opzione è quella di coltura la cellula-seminato SIS-Muc in un sistema di bioreattore flusso che espone le cellule a sollecitazioni di taglio. Qui, il bioreattore è collegato ad una pompa peristaltica in un incubatore autocostruito. Un computer regola l'ossigeno arterioso e di nutrienti attraverso parametri come la pressione sanguigna, temperatura e portata. Questa configurazione consente una cultura dinamica sia con pulsatile-regolato pressione o flusso costante.
In questo studio, abbiamo potuto stabilire con successo sia un sistema di coltura 3D statico e dinamico per MPNSTs. La capacità di modellare i tumori del cancro in un ambiente più naturale 3D consentirà la scoperta, la sperimentazione e la validazione difuturi farmaci in un modello umano-simili.
Introduction
Nuovi farmaci devono essere validati in relazione alla loro qualità, sicurezza ed efficacia prima autorizzazione alla commercializzazione. Ad oggi, la sperimentazione animale sono il metodo standard per droga test e validazione. Tuttavia, a causa delle differenze specie-specifici, esperimenti sugli animali spesso non globalmente valutare l'effetto dei composti nell'uomo 1. Per questa ragione, è importante generare modelli di tessuto umano che possono essere utilizzati per le prove in vitro di nuovi farmaci e sostanze.
Uno dei punti focali del nostro gruppo è la creazione di modelli in vitro test con il nostro scaffold vascolarizzato biologica (BioVaSc) 2,3. Il BioVaSc può essere utilizzato come un sistema a matrice 3D statico o dinamico. Per la cultura statica, il porcino segmento digiunale decellularized (Small intestinale Sottomucosa SIS-Muc) è collocato in un inserto in metallo per la risemina delle cellule. Varie cellule, come il cancro e cellule endoteliali possono essere coltivate sulla forca.
E 'inoltre possibile utilizzare scaffold per la establishment di un modello vascolarizzato causa delle strutture tubolari conservati, che includono l'arteria alimentazione, vena, e il letto capillare collegamento. Tutte le cellule suina devono essere rimossi da decellularization chimica, meccanica ed enzimatica, e l'impalcatura gamma-sterilizzato. Le strutture vascolari tubolari restaurati possono essere successivamente reseeded con le cellule endoteliali microvascolari umane usando un ricircolo perfusione bioreattore 7, che imita i parametri biomeccanici e / o biochimici come pH, temperatura, pressione, apporto di sostanze nutritive e la rimozione dei rifiuti 6. La ri-endotelizzazione delle strutture tubolari crea un equivalente umano all'interno del vaso sanguigno scaffold 3,7 collagene. Nella fase successiva, la superficie degli ex lumen (mucosa) può essere seminato con cellule umane primarie per stabilire co-culture 3,7,8.
In questo studio un sistema di test tumore 3D è impostato mediante co-coltura di una linea cellulare di tumore primario stcellule Romal in condizioni statiche e dinamiche sul SIS-Muc.
Protocol
1. Decellularization del BioVaSc
- Sciacquare il sistema vascolare del segmento digiunale suina tramite accesso arterioso cannulato e lume intestinale con PBS -. Ripetere l'operazione fino a quando non è completamente pulito.
- Preparare un serbatoio di vetro 200 mm di diametro con 4 adattatori e collegarli tramite tubi in silicone alla pompa peristaltica (Ismatec). La pressione di controllo unità può essere monitorato tramite un sensore di pressione collegato ad una cupola monouso sterile (vedi Figura 1).
- Riempire bottiglie serbatoio con la soluzione decellularization (DZ) e controllare il sistema di tubi per eventuali bolle d'aria.
- Collegare lume intestinale con fascette ai connettori di vetro per il flusso luminale. Pompa 500 ml soluzione DZ in accesso arterioso rosso (Figura 1B) del sistema vascolare. Interrompere il processo di pompaggio ogni 15 minuti a poco a premere manualmente l'intero lume intestinale.
- Durante la decellularizatisul processo, la pressione della soluzione tampone deve essere compresa tra 80 - 100 millimetri Hg, sul modello della naturale pressione sanguigna.
- Lavare il BioVaSc con PBS - finché non è privo di residui cellulari ("completamente bianchi").
- Riempire il BioVaSc completamente con la soluzione DZ ed incubare immergere in una soluzione DZ tutta la notte a 4 ° C sul dondolo shaker.
- Ripetere passo 1.6.
- Posizionare il BioVaSc in soluzione DNasi e incubare per tutta la notte a 4 ° C su agitatore a dondolo.
- Rimuovere la soluzione di DNasi e risciacquare con tampone di lavaggio.
- γ-sterilizzazione con 25 kGy
2. I diversi tipi di cellule
2.1 L'isolamento di cellule primarie umane dermica microvascolare endoteliali (mvECs) e fibroblasti
- Tagliare biopsia della pelle (preferibilmente preputium), in strisce di 2-3 mm di larghezza con bisturi e risciacquare li 3x con PBS - soluzione.
- Coprire il tessuto con la soluzione dispasi e incubare per 16-18 ore a 4 ° C.
- Epidermide separate dal derma con 2 pinze e trasferire sia separatamente che in capsule di Petri riempite con PBS +.
- Derma Sciacquare strisce 1x con Versene.
- Aggiungere 10 ml di soluzione Tripsina / EDTA al derma strisce e incubare in incubatrice per 40 min.
- Fermare la reazione enzimatica immediatamente con 1% FCS.
- Trasferimento strisce di pelle per una piastra di Petri riempita con VascuLife e graffiare fuori ogni striscia con il bisturi 8x ogni lato, aggiungendo un po 'di pressione.
- Trasferire la sospensione cellulare prodotto attraverso un colino cellule in una provetta da centrifuga e risciacquare 3x colino cella con VascuLife.
- Centrifugare la provetta a 1.200 xg per 5 minuti e risospendere il pellet cellulare con VascuLife.
- Per isolare i fibroblasti, derma chop nastri in piccoli pezzi con il bisturi.
- Aggiungere 10 ml di soluzione di collagenasi al derma pezzi.
- Incubare per 45 min in incubatrice, quindi centrifugare e rimuovere con attenzione supernatant.
- Lavare 1x pellet con DMEM + 10% FCS +% PenStrep, centrifugare e rimuovere con attenzione il surnatante.
- Risospendere il pellet in terreno di coltura e trasferirlo in un pallone di coltura T75 per permettere alle cellule di crescere fuori del tessuto.
Linea 2.2 Tumore cellulare S462
La linea di cellule tumorali S462 (gentilmente fornito dal Dr. Nikola Holtkamp, Charité Università di Medicina di Berlino) è stata generata da un nervo periferico guaina tumore maligno di una paziente con la sindrome di predisposizione ereditaria di tipo tumorale neurofibromatosi 1 9. S462 sono coltivate in DMEM supplementato con 10% FCS. Piano deve essere cambiato ogni 2-3 giorni. Una volta alla settimana le cellule devono essere divisi.
3. Tumore Sistema di prova: statici Culture Condizioni Rispetto Cultura dinamico In bioreattori Sistemi
- Tagliare il tubolare SIS-MUC aperto su un lato e fissarlo tra due anelli in metallo (corone cellulari, diametro 10 mm, angolo constructed). Coprire il SIS-Muc nella cella terreno di coltura durante la notte.
- Cellule sementi isolato in numero di cellule definite (vedi sotto) su uno o entrambi i lati del SIS (mono o co-coltura di set-up).
- Seme 8.000 cellule / cm 2 di mvECs primarie in un volume totale di 100 microlitri sulla superficie basolaterale della SIS (ex sierosa). 3 ore dopo riempire la vasca con il mezzo per assicurare una cultura sommersa.
- Consentono alle cellule endoteliali di aderire per 3 giorni. Capovolgere il sistema di coltura statica di 180 ° e trasferirlo in un 12-pozzetti.
- Inizializzare una miscela di fibroblasti dermici primari (8.000 cellule / cm 2) e cellule tumorali (15.000 cellule / cm 2) in un volume totale di 500 microlitri sulla superficie apicale della SIS (il lato delle ex lumen).
- Consentono alle cellule di aderire per 3 ore e riempire il pozzo di fluido (coltura sommersa, medio: 50% Vasculife + 50% DMEM supplementato con 10% FCS).
- Il sistema di prova tumore è coltivato in condizioni statiche aT 37 ° C, 5% CO 2 in incubatrice per ulteriori 14 giorni. Cambiare mezzo di coltura ogni 2 - 3 giorni.
- Per la cultura dinamica, fissare il SIS-Muc tra due anelli di metallo e sementi mvECs primari come descritto in 3.2.1. Dopo 3 giorni rimuovere il SIS-MUC dagli anelli metallici e inserire la membrana nel reattore a flusso (vedere Figure 2C e 2D). Applicare la fibroblasti dermici e cellule tumorali primaria con una siringa e cannula sulla matrice nel bioreattore, e permettono alle cellule di aderire per 3 ore prima di riempire il bioreattore con mezzo di coltura.
- Nelle seguenti condizioni di coltura dinamici giorno con costante flusso medio (3,8 ml / min, 37 ° C e 5% CO 2) può essere avviato. La cultura dinamica viene mantenuta per 14 giorni, mezzo di coltura viene cambiato dopo 7 giorni.
- La configurazione di prova dinamica è colta in un incubatore di auto-costruito che fornisce un flusso multimediale tramite una pompa e la temperatura necessaria e CO 2
4. Metodi di caratterizzazione per l'analisi
4.1 Fissaggio e inclusione in paraffina della matrice di collagene seminato
- Per (immuno-) caratterizzazioni istologici rimuovere il terreno di coltura e fissare il tessuto con paraformaldeide 4% per 2 ore.
- Rimuovere paraformaldeide al 4% e trasferire il SIS dalla inserto metallico di una cassetta tessuto incorporamento. Innaffiare il tessuto per rimuovere restante fissativo e disidratare per l'infiltrazione di paraffina.
- Prima di incorporare in un blocco di paraffina, tagliare il SIS in 2 - 3 fette e metterle in uno stampo di base metallica di paraffina pieno in modo che le superfici di taglio rivolti verso il basso. Aggiungere la cassetta tessuto sulla parte superiore dello stampo come supporto.
- Tagliare 5 micron fette e galleggiare su un bagno di acqua a 40 ° C per la raddrizzatura, quindi montare i vetrini sulla adatti vetrini. Vetrini non patinati sono utilizzati per H & E macchie, diapositive polilisina rivestita per la colorazione immunoistologico per migliorare allegato.Lasciate asciugare bene le fette.
- Melt paraffina, rimuoverla con xilene e reidratare le fette con il seguente colorazione.
4.2 Colorazione
- Le fette reidratati possono essere colorati con ematossilina / eosina come una panoramica colorazione standard.
- Per la colorazione immunhistological, fissa e fette di tessuto paraffina-infiltrati devono essere sottoposti ad un recupero di un antigene per consentire anticorpi riconoscono e si legano a loro epitopi specifici. Pertanto, deparaffinati e reidratati vetrini sono posti in un forno a vapore con tampone citrato riscaldata (pH 6,0) per 20 min.
- Trasferire i vetrini a tampone di lavaggio (0,5 M tampone TBS + 0,5% Tween) e fette cerchio con una penna PAP ridurre al minimo il volume richiesto per soluzioni coloranti.
- Mettere il vetrino in una camera di umidità. Per garantire una determinata visualizzazione perossidasi di rafano-mediata di antigene-anticorpo vincolante, la perossidasi endogena deve essere saturato con 3% di perossido di idrogeno.
- ANTIB primariadiluizioni ody vengono applicati alle fette, incubate per 1 ora a RT e accuratamente lavati con tampone di lavaggio.
- Per il rilevamento di specifiche associazioni antigene-anticorpo Ultra Vision Quanto Detection System HRP DAB (Thermo Scientific) viene usato secondo il protocollo raccomandato.
- I nuclei sono di contrasto con ematossilina per 1 min.
- I vetrini sono montati con un mezzo acquoso, essiccato e ripreso con un microscopio inverso.
Representative Results
Come mostrato nella Figura 1B, si decellularized segmento digiunale suini (circa 2 m di lunghezza e 20 mm di diametro) con strutture tubolari conservati della rete capillare. Dopo chimica, enzimatica e meccanica decellularization, abbiamo ottenuto un ponteggio collagene I / III, che può essere utilizzato per colture cellulari 3D. Un test Feulgen è stata eseguita per dimostrare la purezza (non presentano residui di DNA) della matrice (dati non mostrati).
Figure 2A e 2B mostrano la coltura statica di SIS-MUC assicurata dalle corone cellulari. Abbiamo fissato il SIS-MUC in un bioreattore in-casa progettata (Figura 2C) per cultura dinamica. Figura 2D illustra il flusso dinamico simulato attraverso la camera del bioreattore. Il bioreattore è posto in un incubatore sistema autocostruito e collegato con una pompa peristaltica. Questa configurazione consente una cultura dinamica sia con-regolato pressione di flusso pulsatile o c flusso onstant.
Figura 3 fornisce una panoramica della linea cellulare in coltura staticamente S462 tumore in monocoltura 2D (Figura 3A) e in 3D coculture (figure 3B-3D). Figura 3B mostra la cultura tripla di cellule tumorali S462 e fibroblasti primari sul lato apicale SIS -Muc (ex squadra lume interno) e MVEC sul lato basolaterale (ex squadra sierosa). L'identificazione di tipi cellulari diversi è possibile mediante colorazione marcatori specifici di tipo a cella, come fattore di von Willebrand etichettare MVEC (Figura 3C). Le cellule S462 p53-positive possono essere distinte dai fibroblasti primari p53-negativa (Figura 3D) e la distribuzione 3D di cellule può essere analizzato. Figura 4 mostra colorazioni equivalente alla figura 3 della cultura tripla colta dinamicamente.
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Figura 1. Decellularization set-up. (A) bioreattore e pompa di set-up per decellularizing il BioVaSc, controllato da un PC. (B) decellularized BioVaSc in vasca di vetro. Il lume e l'ingresso arterioso sono collegati agli adattatori. .
Figura 2. Più di vista delle diverse culture set-up. (A) vista in sezione CAD del sistema di coltura statica in pozzetti delle micropiastre, (B) inserti metallici per coltura statica, (C) simulazione del flusso medio (velocità [m / sec]) per coltura dinamica del coperchio superiore del bioreattore flusso , (D) bioreattore flusso per cultura dinamica collegato alla pompa peristaltica. Clicca qui per ingrandire la figura
Figura 3. Panoramica della caratterizzazione immunoistologico del modello di tumore 3D statico. (A) colorazione con ematossilina del staticamente colta cultura mono 2D di cellule S462 su un vetrino Permanox, (B) H & E macchia della cultura tripla 3D staticamente colta, frecce indicano le cellule endoteliali, (C) colorazione immunoistochimica per il fattore di von Willebrand, (D ) colorazione immunoistochimica per p53. Clicca qui per ingrandire la figura
Discussion
Quando si confrontano i sistemi di coltura 2D e 3D nella ricerca del tumore, sistemi 3D, pur essendo il metodo più costoso, hanno dimostrato di simulare le condizioni di microambienti biologiche meglio. È stato dimostrato che alcune cellule tumorali crescono molto più lento in una cultura 3D che in una cultura 2D comune 12, che è in accordo con la situazione in un vero tumore. Bissell e collaboratori hanno dimostrato nel loro lavoro che il comportamento delle cellule mammarie cancerogene riflette la situazione in vivo, compresi morfologia e segnalazione cellulare, più precisamente quando una cultura 3D all'interno di una matrice offre interazioni cellula-ECM. Inoltre, hanno sottolineato l'importanza dell'ambiente extracellulare in 3D dimostrando che cambiamenti nelle interazioni ambientali hanno portato alla reversione delle cellule maligne ad un fenotipo normale. Inoltre, e cosa più importante, questi risultati potrebbero anche essere confermate in modelli animali in vivo 10,11.
ONTENUTO "> Il confronto diretto di esperimenti in vivo e in modelli animali in vitro di tessuto rivela vantaggi e svantaggi in entrambi i sistemi. Un vantaggio di modelli in vitro è l'autorizzazione di una migliore tempo reale o immagini fisse mediante microscopia. Una limitazione è che imitano condizioni statiche o di breve durata, mentre i sistemi in vivo spesso progrediscono. L'attuale mancanza di vascolarizzazione e normale trasporto di piccole molecole, ospiterà le risposte immunitarie, e altre interazioni cellula-cellula sono ulteriori svantaggi dei modelli in vitro 12. Pertanto, 3D sistemi in vitro, come presentato in questo studio offrono una promettente Oltre alla sperimentazione animale. Essi forniscono una migliore comparabilità per l'organismo umano e quindi ridurre al minimo fraintendimenti sperimentali. Biomimetic in sistemi modello in vivo sarà quindi diventerà più rilevante per studiare come il cancro e la diffusione metastatica dipende sulle condizioni microambientali che regolano tumorigenesis 11.Il nostro studio mostra che l'ambiente 3D fornito dal SIS-MUC porta ad una maggiore formazione di tessuto tumorale della cellule, che non si osserva nella cultura comune cella 2D (Figura 3A). Inoltre, l'uso di cellule primarie derivate da biopsie tumorali è un passo molto importante verso medicina personale, una disciplina che mira ad individuare il miglior trattamento a seconda delle esigenze individuali del paziente. Incorporando cellule tumorali paziente-specifiche primari isolati da materiale bioptico consentirà di sperimentazione in vitro di strategie terapeutiche. Tali sistemi di test consentiranno di indagare diversi farmaci e loro combinazioni in un tempo e high-throughput screening di risparmio di costi. Inoltre, l'integrazione di cellule stromali del tumore-associato, come mostrato in questo studio è importante per l'approccio personalizzato, poiché progressione influenze microambiente del tumore tumore 13 e potrebbe rivelarsi come AdattaLe obiettivo terapeutico.
In alternativa ad un approccio personalizzato, il nostro modello di tumore può essere modificato per servire come sistema di test tumore generalizzato dall'incorporazione di linee cellulari tumorali stabiliti. Questo è un adattamento promettente per scopi di ricerca di base. Per entrambi droga test avvicina alla presenza di una struttura vascolare è richiesto di verificare la distribuzione e l'assorbimento delle sostanze terapeutiche. La matrice SIS-Muc permette la semina basolaterale con primario MVEC per gli studi barriera di assorbimento, la risemina delle strutture vascolari conservati della BioVaSc migliorerà ulteriormente lo studio della consegna della droga.
Al fine di creare modelli di tessuto, una matrice biodegradabile 3D può essere utilizzato come struttura per una co-coltura di diversi tipi di cellule 14. L'uso di tali matrici 3D è spesso limitato dalla mancanza di vascolarizzazione funzionale. Questo problema può essere risolto con l'uso del BioVaSc, che offre conservato str vaso sanguignoutture, che può essere reseeded con le cellule endoteliali. Inoltre, il BioVaSc fornisce componenti extracellulari, che garantiscono l'adesione delle cellule e facilitano la differenziazione dei tessuti. Esso consente anche la funzione specifica del tessuto di lunga data di tessuti 3D bioartificiali 7,8,15. Il presupposto per l'ingegneria dei sostituti vascolari funzionali è il mimetismo della fisiologica umana e delle condizioni biomeccaniche. Pertanto, bioreattori, che possono implementare questi requisiti in vitro, sono di estremo interesse per la creazione di modelli tumorali biologici.
La combinazione del BioVaSc, la tecnologia bioreattore e co-coltura di diversi tipi di cellule è un metodo molto promettente per generare tessuti tumorali vascolarizzati, che permetteranno lo studio dei meccanismi rilevanti per la progressione del cancro come angiogenesi e metastasi. Vediamo tali modelli tumorali come un approccio promettente per integrare gli studi sugli animali, fornendo un equivalentealla fisiologia tumore umano.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Jan Hansmann (Fraunhofer IGB, Stuttgart) per il suo supporto tecnico per sviluppare bioreattori e l'incubatrice bioreattore.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase solution | SERVA | 17454 | (500 U/ml) |
| Dispase solution | Gibco | 17105-041 | (2.0 U/ml) |
| DMEM, high-glucose | PAA | G0001,3010 | |
| DNase | ROCHE | 10104159001 | 200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep |
| DZ solution | Roth | 3484.2 | 34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water |
| FCS | LONZA | DE14-801F | |
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| medical pressure transducer | MEMSCAP | SP844 | |
| monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor | DAKO Cytomation | M0616 | Clone F8/86 0.12 μg/ml |
| mouse monoclonal anti-human p53 | DAKO Cytomation | IS616 | Clone DO-7 ready-to-use |
| peristaltic pump | Ismatec | ||
| sterile disposable dome | MEMSCAP | 844-28 | |
| Trypsin / EDTA solution | PAA | L11-003 | 0,05% |
| VascuLife (VEGF-Mv) | Lifeline | LL-0003 | |
| Versene | Gibco | 15040-033 |
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