Summary
기본 세포 배양은 특히 특정 발달 단계에서 유전자 변형 마우스 배아에서 세포의 특정 인구를 분석하기위한 유용한 기술이다. 여기서, 배아 심실는 해부와 해리, 항체가 결합 된 구슬 인식하고 자세한 분석을 위해 내피 세포를 분리한다.
Abstract
세포 배양 크게 수많은 배양 조건에서 세포의 개별 인구를 평가하는 능력을 강화했다. 불후의 세포 라인 사용의 용이성에 상당한 이점을 제공하지만, 이러한 세포 라인은 모든 잠재적 세포 유형에 사용할 수 없습니다. 특히 형질 전환 마우스의 관심의 특정 지역의 일차 전지를 분리하여,보다 미묘한 연구를 수행 할 수 있습니다. 기본 기술은 장기 또는 그 일부 장기 (심장 또는 심장의 특정 지역 등) 해부 및 단일 세포로 장기 해리 포함한다. 이 세포는 그 관심의 세포 유형을 인식하는 항체 복합 자석 구슬로 배양한다. 그 세포는 그 구슬에서 세포를 해리 짧은 트립신 보육과, 자석의 사용으로 격리 할 수 있습니다. 이 고립 된 세포는 다음 배양하고 원하는 분석 할 수 있습니다. 이 기술은 원래 성인 마우스의 장기를 위해 설계되었습니다들하지만, 쉽게 여기에서 알 수 있듯이, 배아 장기 사용하기 위해 아래로 확장 할 수 있습니다. 우리의 관심을 개발하는 관상 동맥 혈관에 있기 때문에, 우리는 특정 배아 단계에서 세포의이 인구를 공부했습니다. 따라서, 원래의 프로토콜은 배아 심실의 작은 크기와 이러한 발달 단계에서 내피 세포의 낮은 잠재적 인 수확량과 호환되도록 수정해야했습니다. 이 스케일 다운 방식 활용, 우리는 유전자 변형 배아 심실 내피 세포의 관상 동맥 신경 얼기 리모델링을 평가했다.
Introduction
불후의 세포 라인의 출현은 기본적인 세포 생물학 1 혁명을 일으켰다. 현재 세포주 기관의 다양한에서 파생 된 모든 주요 세포 유형을 포함하고 있습니다. 그러나 설립 세포 라인은 몇 가지 제한이 있습니다. 불멸화 과정은 분명히 특히 수명과 확산에 대해, 세포의 동작을 변경하지만, 또한이 세포 골격 단백질과 같은 예기치 않은 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있습니다. 많은 다른 세포 라인을 사용할 수 있지만 또한, 전체 유기체 내에서 단 한 번의 세포 유형 간의 유의 한 다양성이있다. 특히 쇼 다양한 행동의 내피 세포는 동맥이나 정맥 흐름의 종류는 용기 3에 존재하는 그들은 선 여부에 따라. 발달의 관점에서 훨씬 더 시급한 그러나, (참조, 예를 들면 t 사용할 수있는 세포 라인의 대부분이 성인 조직에서 파생 된 것입니다ATCC 통해 사용할 그가 컬렉션). 이러한 성인 세포주 가능성이 자신의 배아 전구체의 동적 특성을 요점을 되풀이하지 않습니다. 개발하는 동안 관찰 빠르게 변화하는 시공간 유전자 발현 패턴은 특정 발달 단계에서 하나의 기관에서 내피 세포가 다른 발달 단계에서 동일한 기관에서 내피 세포와 같은 방식으로 작동하지 않을 수 있습니다하는 것이 좋습니다.
시중 불후의 세포 라인을 사용하는 대신, 일차 전지는 관심의 특정 조직에서 분리 할 수 있습니다. 이 기술의 장점 가운데 이러한 기본 세포도 특정 기관이나 특정 발달 단계에서 기관의 부분으로부터 격리 할 수 있습니다. 또한, 이러한 기본 세포는 유전자 녹아웃 등의 transfection 효율성과 같은 다른 문제를 피하면서 노크에서의 체외 연구에서 허용 가능한 형질 전환 동물의 다양한 격리 할 수 있습니다. 되지 놀랍게도, 많은기술은 특정 세포 유형 4,5 분리하는 방법에 대해 자세히 발표되었다. 일반적으로,이 기술은 세포 태그 관심의 특정 세포 유형을 해리하고 추가 분석을 위해 그 세포를 분리, 관심의 영역을 모으는 포함한다.
관상 동맥 내피 세포의 초기 배아 인구를 연구하기 위해, 우리는 작은 장기 사용하기 위해 이전에 게시 된 기술 4 축소. 이 축소 된 절차로, 우리는 특정 배아 단계에서 배아 마음에서 관상 동맥 내피 세포를 분리 할 수 있습니다. 이러한 세포는 그런 마이그레이션 분석과 같은 전통적인 내피 분석에 사용할 수 있습니다. 초기 배아 세포 라인이 더 널리 될 때까지, 일차 전지 작업을하는 것은 매우 중요한 기술이다.
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Protocol
1. 항체 - 복합 구슬을 준비
- 이전 해부 어느 날, 제조업체의 지침에 따라 해당 Dynabeads (쥐 제기 항체 예를 들어, 쥐의 IgG Dynabeads, 4 × 10 8 구슬 / ㎖)로 선택의 항체를 결합합니다. BD 쥐 항 CD31 항체 (0.5 ㎍ / ㎕의 내피 세포를 분리하는 데 사용)의 경우, 3 μL 항체 최종 1.5 μg 항 CD31 항체의 농도 / 1 × 10 7 비즈를 들어, 매 25 μL 비즈에 추가됩니다 25 μL 버퍼입니다.
- 4 ° C.에 구슬과 밤새 항체를 품어
2. 콜라겐 플레이트를 준비
- 단지 콜라겐 코팅 플레이트에 반대 콜라겐 겔에서 재배 할 때 절연 세포는 더 빠르게 세관을 형성한다. 6에 설명 된대로 따라서 콜라겐 젤은, 해부 전날 밤에 만들어집니다. 조직 문화 후드에서 얼음에 다음과 같은 시약 (충분히 19 우물) 결합 : 206.4 μL 멸균 H를 <서브> 2 O, 140.4 μL 콜라겐 유형 I (4.08 밀리그램 / ML), 38.4 μL 배 M199, 그리고 1.15 μL 5 M NaOH를.
- 384 잘 조직 배양 플레이트의 우물에이 콜라겐 젤의 피펫 20 μL. 30 분 동안 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
- 각 well에 80 μL DMEM을 추가하고 37 15 분 동안 품어 ° C. 배지를 제거하고 두 번 더 반복합니다.
- 최종 헹굼 후, 잘 FBS / DMEM 각각 80 μL 10 %를 추가하고 37 밤새 품어 ° C. 분리 된 세포를 추가하기 전에 배지를 제거합니다.
3. 소비세 심장을 소화
- 승인 안락사 기술을 사용하여 원하는 배아 일에 시간 초과 임신 마우스를 안락사. 모든 실험은 채플 힐에서 노스 캐롤라이나 대학에서 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
- 앙와위에서 마우스로, 자유주의 이전에 70 % 에탄올로 여성의 복부 측면을 살포해부. 내부 장기에서 멀리 하복부 피부와 근육을 들어 올려 집게를 사용하여 내부 장기를 시각화하는 여성의 낮은 복강을 열고 잘라.
- 집게와 자궁 경부를 잡고 조심스럽게 핀셋으로 꼬리 잘라 내기 및 복강에서 자궁을 들어 올려 시작합니다. 자궁을 들어 올리면서 그 자리에 경적을 보유하고있는 결합 조직을 잘라. 자궁을 절개 완료하려면 자궁을 무료로 난관과 자궁의 접합부를 잘라.
- 차가운 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)와 필요에 린스를 포함하는 페트리 접시에 자궁을 놓습니다. 첨부 된 배아 주머니를 노출 정중선을 통해 자궁을 열고 잘라.
- 배아를 절단 실수 방지하고 배아를 검색하는 태반의 교차점에서 배아 주머니와 배아를 자르면. 차가운 PBS로 두 번째 페트리 접시에 배아를 놓습니다. 얼음 자궁 경적 페트리 접시를 돌려줍니다.
- 디가슴 벽에 대한 액세스를 개선하기 위해 배아를 ecapitate. 유전자형이 필요한 경우,이를 제거하고 얼음에 배치 에펜 도르프 튜브에 저장 꼬리를 잘라.
- 그것의 뒤에 배아와, 심장과 폐를 시각화하는 가슴 벽을 열고 잘라. 다음, 부드럽게 방식의 가슴 벽을 당겨 밖으로, 마음을 절단 방지하기 위해, 갈비뼈의 하단에 가로 컷 다음 앞발 근처 흉곽의 측면을 따라 수직 절단,합니다. 최대 약 배아 일 13.5을 통해, 가슴 벽 시각화 은닉, 투명합니다.
- 조심스럽게 집게를 사용하여 마음을 들어 올려 아래의 혈관을 잘라. 그런 마음을 해방하는 큰 그릇 위에 잘라. 폐 혈관이 절단되지 않은 경우, 폐는 마음으로 제거 할 수 있습니다. 필요한 경우 따라서, 폐와 같은 불필요한 조직을 제거합니다.
- 분리 심실에서 심방과 큰 혈관을 버립니다. 가위 사용하여 작은 조각 (약 1mm 3 <에 심실을 말하다/>를 한모금) 약 500 μL 콜라게나 제 (멸균 PBS 1 MG / ML)에서 개최. 모든 심실 다진과 콜라에 배치 될 때까지 얼음에 샘플을 유지한다.
- 심실은 별도의 에펜 도르프 튜브에 각각의 마음을 수집, 모든 배아에서 적출 될 때까지 이전 단계를 반복합니다. 모든 배아가 동일한 유전자형이 있다면, 마음은 하나의 에펜 도르프 튜브에 풀링 할 수 있습니다. 한 번에 처리 된 샘플의 수는 분리에 사용되는 자석에 따라 제한 될 수 있습니다; DynaMag (123-21D)는 16 에펜 도르프 튜브의 최대 보유하고 여기에 사용.
- 45 분 동안 흔들 37 ° C에서 다진 심실를 놓습니다. 매 15 분, 부드럽게 샘플을 제거하고 기계적으로 세포를 해리 아래로 피펫.
4. 내피 세포를 분리
- 세포의 나머지 덩어리를 제거하는 필터 70 μm의를 통해 뇌실 - 콜라게나 솔루션을 전달합니다.
- 10 분 400 XG에서 세포를 원심 분리기. 폐기상층 액은 DMEM 약 200 μL 10 % FBS로 교체하고, 세포를 떼어 놓다 아래로 피펫.
- 일단 이전 단계를 반복합니다. 두 번째 10 % FBS / DMEM 세척 후 10 분 400 XG에서 세포를 원심 분리기. 50 μl를 10 % FBS / DMEM에 세포를 resuspend을.
- 최종 원심 분리 단계에서 구슬을 준비합니다.
- 1 분 자석에 항체 비즈를 포함 에펜 도르프 튜브를 놓습니다.
- 자석에 장소 튜브, 상층 액을 제거하십시오. 자석에서 튜브를 제거하고 약 100 μL 10 % FBS / DMEM을 추가합니다.
- 1 분 동안 자석에 튜브를 놓습니다. 상층 액을 제거하고 10 % FBS / DMEM 다시 씻는다. 3 세척의 총 반복합니다.
- 마지막 세척 후, 10 % FBS / DMEM에 항체가 결합 된 비즈 (샘플 당 5 μL)을 resuspend을.
- 각각의 세포 샘플, 항체 결합 된 구슬의 5 μl를 추가합니다. 락 FO와 4 ° C에서 비드 세포 현탁액을 배치R 30 분.
- 층류 후드에서 1 분 자석에 세포와 항체 - 복합 구슬을 포함 에펜 도르프 튜브를 놓습니다. 상층 액을 제거 자석에서 튜브를 제거하고, 약 100 μL 10 % FBS / DMEM으로 세척한다. 5 세척을 반복합니다.
- 마지막 세척 후, 1 분 동안 자석에 튜브를 배치 상층 액을 제거하고 자석에서 튜브를 제거합니다. 약 100 μL DMEM을 추가합니다.
- 1 분 동안 자석에 튜브를 놓고, 상층 액을 제거하고 자석에서 튜브를 제거합니다. 100-200 추가 μL 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 prewarmed. 37 샘플을 품어 ° C와 5 분 5 % CO 2.
- 2 분 자석에 튜브를 놓습니다. 신선한 에펜 도르프 튜브에 세포를 포함하는 상층 액을 조심스럽게 전송할 수 있습니다. 400 X g에서 5 분 원심 분리기.
- 상층 액을 제거합니다. 예상 수익률에 따라, 또는 384 잘 대우 배양 접시 - 80-100 ㎕의 성장 배지 및 플레이트 96에있는 세포를 resuspend을(E14.5 - E16.5 배아의 심실에서 약 450-600 세포). 내피 세포 (아래 정의) 내피 성장 배지를 사용합니다.
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Representative Results
CD31를 인식 내피 세포 특이 항체를 이용하여 내피 세포는 배아 (E) 13.5 (그림 1A) 및 18.5 (피규어 1B-1D) 배아의 심실에서 분리되었다. 치료 배양 접시에 성장하면,이 세포는 둥근 남아 근처 합류 (그림 1A) 만약 조약돌 패턴을 형성한다. 희석 콜라겐은 또한 우물 코트에 사용되어 왔으며, 내피 세포가 (그림 1B)을 준수 할 때, 그들은보다 적은 체인을 형성 할 때 콜라겐 겔에 도금 (그림의 1C 및 1D). 내피 세포는 콜라겐 코팅에 비해 콜라겐 겔에 성장 잘 때 콜라겐 겔 (그림의 1C 및 1D)를 형성 세포 - 세포 상호 작용과 콜라겐을 재배 할 때 분기를 시작 폼 체인이 과정을 포함하여 빠르게 발생의 성장 플레이트. 이 내피 체인 내피 세포 마커 ISO-렉틴과 긍정적 라벨 ( E18.5 심실에서 분리 된 내피 세포는 PECAM (그림 2A) 및 Flk1 (그림 2B)로 긍정적 레이블을 지정합니다. 또한, 고립 된 내피 세포가 내피 특정 형광 염료 SYTO-16을 사용하여 표시 할 수 있습니다 살고 있습니다. 그림 2D는 E14.5 태아의 심실에서 고립 SYTO-16로 표지 된 내피 세포를 보여줍니다. 
그림 1. 콜라겐 겔에서 재배 할 때 배아 마우스 심실에서 분리 된 내피 세포는 체인을 형성한다. E13.5 심장 g의 라이브 고립 된 심실 내피 세포의 (A) 브라이트 배 이미지치료 배양 접시에 rown, 심지어 48 시간 후, 세포는 둥근 유지 (B) E18.5 마음에서 고정 격리 심실 내피 세포의 시야 배 이미지 콜라겐 코팅 접시에 성장;. 24 시간 후, 일부 세포는 시작했다 (화살표) 길게,하지만 그들 중 대부분은. (화살촉) 둥근 유지 (C, D) 시야 (C)에서와 같이 콜라겐 겔에 성장 E18.5 심장에서 고정 격리 심실 내피 세포의 공 촛점 이미지와 ISO로 표시 - 렉틴 (빨간색). 화살표는 렉틴-양성 세포의 일부를 나타냅니다. CD = 50 μm의에서 스케일 바. 
그림 2. 배아 마우스 심실에서 분리 된 내피 세포는 혈관 내피 마커 적극적으로 레이블을 지정합니다.에 성장 E18.5 마음에서 고정 격리 심실 내피 세포 (AC) 공 촛점 이미지 (40X)콜라겐 코팅 접시. 이러한 세포는 PECAM (A)와 FLK-1 (B)에 대한 긍정적 인 레이블, 음성 대조군 (C)은 더 형광을 보여줍니다. AC에서 핵은 DAPI (파란색)로 표시되어 있습니다. (D) E14.5 심장의 라이브 고립 된 심실 내피 세포의 형광 오버레이 (배) 콜라겐 젤에 성장. 세포는 살아있는 내피 세포 마커 SYTO-16 (녹색)로 배양하고, 마이그레이션 시간 경과 현미경을 사용하여 관찰 하였다.
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Discussion
기본 배아 세포와 작업 새로운 실험 개발의 체외 중요한 단계에서 처리 할 수 있습니다. 그러나 분리 절차는 간단하지 않습니다. 세포의 모든 유형을 분리하는 중요한 단계는 세포가 잘 그들이 잘 세척 단계에서 중단되는 다음 콜라 소화에 분리되는 것을 보장 이용하실 수 있습니다. pipetting하여 기계적 박리 크게 콜라 단계에서 세포를 분리하는 데 도움이, 그리고 필터링 단계는 세포의 대단히 짧은 시간을 제거합니다. 이 단계는 인구 순도를 향상시키고 얻을 수 있습니다.
도금 밀도는 작은 기관의 세포를 분리 중요한 관심사입니다. 관 형성 내피는 세포 밀도 7에 의존하고 있기 (위해) 때문에, 우리는 도금 밀도를 높이기 위해 384 잘 조직 배양 플레이트에 의존. 심지어이 고려, 우리는 낮은 세포 밀도 (다이어와 패터슨, 프로의를 수용하기 위해 몇 가지 분석을 수정해야했다) 진행률. 휴대폰 번호가 우려되고있는 경우, 작은 크기의 문화는 잘 문제를 줄일 수 있습니다.
일차 전지를 분리의 또 다른 한계는 항체의 특이성이다. 이러한 CD31로도 인정 내피 세포의 특정 단백질은 때때로 섬유 아세포 (8)에 의해 표현된다. 수확 휴대폰 번호 대신 정렬 FAC를 허용한다면, 내피 세포와 섬유 아세포는 형광 강도로 구분 될 수있다. 그러나 배아 혈관 내피 세포의 최근 FAC 정렬 분석이 기술은 강력하지만, 작은 기관 9 적합하지 않을 수 있습니다 것을 제안, 네 개의 전체 E10.5 배아는 mRNA의 추출을위한 충분한 내피 세포를 생산하는 데 필요한.
FAC 정렬이 가능하지 않을 경우, 따라서 다른 기술은 인구의 순도 향상을위한 고용 할 수 있습니다. 세포가 긍정적 부정적 SEL 다음 하나의 항체에 의해 선정되는 두 단계의 선택 과정,두 번째 항체에 바인딩 실패에 의해 ected 하나의 대안이다. 섬유 아세포 특정 마커 FSP-1은 하나의 특정 후보가 10이 될 것이다. 또한, 배양액은 L-발린없이 주문 될 수 있으며, D-발린 대신 추가 할 수 있습니다, 섬유 아세포는 D-발린을 이용 할 수 없습니다 따라서 11,12 살아남을하지 않습니다.
이러한 제한과 우려에도 불구하고, 주요 배아 세포 인구를 공부하는 것은 개발 과정의 체외 분석에 대한 자세한 할 수 있습니다. 이 기술은 배아의 기관 또는 지역에 적용되고 세포 유형이 서로 다른 배아 단계에 걸쳐 비교 될 수 있도록 할 수 있습니다. 적절한 배율로, 일차 전지의 매우 적은 인구를 얻어 분석 할 수 있습니다. 이러한 분석은 세포의 특정 하위 집합 행동과 시간이 지남에 따라 변경 방법에 대한 중요한 통찰력을 제공 할 것입니다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 중요한 원고 읽기, 시간 경과 이미징 지원 UNC의 현미경 서비스 연구소 및 자금 지원을위한 NIH (부여 # R01HL061656)의 안드레아 포트 베리에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| Anti-mouse CD31 | BD Bioscience | 553370 | |
| Rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110-35 | |
| Collagen | BD Bioscience | 354236 | |
| PBS (1x) | |||
| Collagenase, type I | Worthington Biochemical | LS004196 | |
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Endothelial cell growth medium | (made in lab as described in notes) | DMEM containing 20% FBS, 5 μM β-mercapt–thanol, 50 μg/ml ECG, and 1x penicillin/streptomycin | |
| β-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| ECGS | Biomedical Technologies, Inc. | BT-203 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | |
| 384-well culture plate | Greiner | T-3037-6 | Plate was prepared with a thin collagen gel, as described in 6; working surface area 10 mm2 |
| Collagen type I | BD | 354236 | Use at a final concentration of 1.5 mg/ml |
| M199, 10x | Invitrogen | 11825-015 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
| DynaMag | Invitrogen | 123-21D | |
| Table-top centrifuge | Thermo | 75002430 | |
References
- Landecker, H. Culturing Life: How Cells Became Technologies. , Presidents and Fellows of Harvard College. (2007).
- Kan, C. Y., Wen, V. W., et al. Endothelial cell dysfunction and cytoskeletal changes associated with repression of p16(INK4a) during immortalization. Oncogene. , (2012).
- Dyer, L. A., Patterson, C. Development of the endothelium: an emphasis on heterogeneity. Semin. Thromb. Hemost. 36, 227-235 (2010).
- Dong, Q. G., Bernasconi, S., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 17, 1599-1604 (1997).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Runyan, R. B., Markwald, R. R. Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue. Dev. Biol. 95, 108-114 (1983).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat. Protoc. 5, 628-635 (2010).
- Zeisberg, E. M., Potenta, S. E., Sugimoto, H., Zeisberg, M., Kalluri, R. Fibroblasts in kidney fibrosis emerge via endothelial-to-mesenchymal transition. Journal of the American Society of Nephrology : JASN. 19, 2282-2287 (2008).
- Chang, L., Noseda, M. Differentiation of vascular smooth muscle cells from local precursors during embryonic and adult arteriogenesis requires Notch signaling. PNAS. 109, 5993-6998 (2012).
- Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., DeLisser, H. M. Isolation of murine lung endothelial cells. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, L1095-L1103 (2009).
- Frauli, M., Ludwig, H. Inhibition of fibroblast proliferation in a culture of human endometrial stromal cells using a medium containing D-valine. Archives of Gynecology and Obstetrics. , 241-96 (1987).
- Lazzaro, V. A., Walker, R. J., et al. Inhibition of fibroblast proliferation in L-valine reduced selective media. Research communications in chemical pathology and pharmacology. 75, 39-48 (1992).
- Arima, S., Nishiyama, K., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
