Summary
एक सरल तरीका सेल प्रकार की एक किस्म में mesenchymal संक्रमण (EMT) को उपकला के शामिल होने के लिए वर्णित है. Immunocytochemistry द्वारा EMT राज्यों में कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए तरीके शामिल हैं.
Abstract
Mesenchymal संक्रमण (EMT) को उपकला विकास के दौरान उचित morphogenesis के लिए आवश्यक है. इस प्रक्रिया के misregulation फाइब्रोसिस में एक महत्वपूर्ण घटना है और एक metastatic राज्य को कार्सिनोमा की प्रगति के रूप में शामिल किया गया है. EMT आबाद कि प्रक्रियाओं को समझना शीघ्र निदान और इन राज्यों रोग के नैदानिक नियंत्रण के लिए आवश्यक है. इन विट्रो में EMT के विश्वसनीय प्रेरण नैदानिक प्रयोजनों के लिए आम जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर की पहचान करने के लिए एक उपयोगी दवाओं की खोज के लिए उपकरण के रूप में भी है. यहाँ हम सेल प्रकार की एक किस्म में EMT के शामिल होने के लिए एक सरल तरीका प्रदर्शित करता है. कोशिकाओं immunocytochemistry से पूर्व और बाद EMT प्रेरण के विश्लेषण के लिए तरीके भी शामिल किए गए हैं. इसके अतिरिक्त, हम एंटीबॉडी आधारित सरणी विश्लेषण और माइग्रेशन / आक्रमण assays के माध्यम से इस विधि की प्रभावशीलता को प्रदर्शित.
Introduction
Mesenchymal संक्रमण (EMT) को उपकला एक polarized उपकला कोशिका एक अत्यधिक गतिशील, fibroblast तरह mesenchymal सेल में जिसके परिणामस्वरूप परिवर्तन की एक किस्म से होकर गुजरती है जिसके द्वारा प्रक्रिया है. इस प्रक्रिया को विस्थापित करने और आक्रमण करने के लिए एक वृद्धि की क्षमता में जिसके परिणामस्वरूप, जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन और adherens जंक्शनों की गिरावट के माध्यम से, भाग में होता है. Physiologically, EMT भ्रूण विकास और घाव भरने के दौरान महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. EMT पर सही नियंत्रण की हानि फाइब्रोसिस और कार्सिनोमा 1,2 मेटास्टेसिस को जन्म दे सकता है.
उपकला कोशिकाओं की सतह पर ई cadherin की कमी EMT 3,4 के माध्यम से एक सेल की प्रगति में एक महत्वपूर्ण कदम है. ई cadherin सीधे सन्निकट कक्षों पर cadherin प्रोटीन के साथ सूचना का आदान प्रदान कि एक एकल पास transmembrane प्रोटीन है. सेल आसंजन में अपनी भूमिका के अलावा, ई cadherin प्रभावों सेल ई cadherin एक के cytoplasmic पूंछ के बीच बातचीत के माध्यम से संकेतनियामक प्रोटीन की दा विविधता, विशेष रूप से β-catenin. β-catenin adherens जंक्शनों के स्थिरीकरण में एक भूमिका निभाता है. विहित WNT सिगनल के दौरान, β-catenin ई cadherin से जारी है और यह Wnt मार्ग 3,4,5 में एक बहाव प्रतिलेखन कारक के रूप में कार्य करता है जहां नाभिक में स्थानांतरित हो. नाभिक में, β-catenin ट्विस्ट, स्लग, fibronectin, और मैट्रिक्स metalloproteases 3,6 की एक किस्म सहित कई EMT से संबंधित कारकों की प्रतिलेखन बढ़ाने के लिए दिखाया गया है.
Wnts के अलावा, TGF-β संकेतन सामान्य विकास के दौरान और रोगग्रस्त राज्यों 7,8,9 में दोनों EMT प्रेरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा दिखाया गया है. TGF-β तालू गठन के दौरान और विकासशील दिल 10 में होता है कि EMT में शामिल है. यह भी फाइब्रोसिस में और मेटास्टेसिस 7 को कैंसर की प्रगति में फंसा दिया गया.
जनसंपर्क यहाँ वर्णित प्रक्रियाovides आनुवंशिक हेरफेर के लिए आवश्यकता के बिना सेल प्रकार की एक किस्म में EMT के अनुरूप प्रेरण. यह प्रक्रिया ई cadherin के एक कॉकटेल का उपयोग करता है, sFRP-1, और DKK -1 अवरुद्ध एंटीबॉडी और Wnt -5 ए और TGF-β1 पुनः संयोजक प्रोटीन. इस कॉकटेल Wnt और TGF-β संकेतन बढ़ाने, जबकि ई cadherin आधारित आसंजन ब्लॉक करने के लिए बनाया गया है. मजबूत EMT शामिल होने के लिए क्षमता इस प्रक्रिया के जीव विज्ञान और कैसे चिकित्सकीय प्रयोजनों के लिए यह हेरफेर करने के लिए समझने के लिए महत्वपूर्ण है. EMT की वर्तमान सामान्य मार्कर, ई cadherin (EMT में downregulated) और (EMT में upregulated) vimentin, कैंसर में सह व्यक्त पाया जा सकता है और इस प्रकार संभावित metastatic कोशिकाओं 12 का सबसे अच्छा नैदानिक मार्कर प्रदान नहीं करते हैं. महत्वपूर्ण बात है, EMT आया है कि सेल प्रकार की एक किस्म का विश्लेषण कैंसर और फाइब्रोसिस 11 में नैदानिक उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि आम जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर विकसित करने के लिए उपयोगी है. इसके अलावा, हाल के अध्ययनों से दिखा दिया है कि ईमीट्रिक टन EMT आया है कि कोशिकाओं इन कोशिकाओं को 13 लक्षित कर सकते हैं कि यौगिकों की पहचान करने के लिए दवा स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी हो सकता है, सुझाव है कि कैंसर स्टेम कोशिकाओं के निर्माण में एक भूमिका निभा सकते हैं.
Protocol
1. EMT की प्रेरण
- एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म संस्कृति मीडिया. इस्तेमाल किया संस्कृति मीडिया ब्याज की अपनी कोशिकाओं के मानक संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया मीडिया के रूप में ही है. उदाहरण के लिए, A549 मानव फेफड़ों कार्सिनोमा सेल लाइन 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 2mm glutamine के साथ पूरक Kaighn के F12 में उगाया जाता है.
- एक हदबंदी समाधान (जैसे TrypLE एक्सप्रेस) का उपयोग ब्याज की फसल कोशिकाओं.
- एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में पूर्व गर्म संस्कृति मीडिया में कोशिकाओं को निलंबित.
- 5 मिनट के लिए 400 XG पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र.
- ध्यान से बर्बादी कंटेनर में गिरने से सतह पर तैरनेवाला हटायें.
- पूर्व गर्म संस्कृति मीडिया में सेल गोली निलंबित.
- Trypan ब्लू का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना. सेल निलंबन का एक नमूना निकालें और 0.4% Trypan ब्लू समाधान में पतला. एक hemocytometer पर पतला नमूना के 10 μl प्लेस और व्यवहार्य कोशिकाओं (नीला बारी नहीं है कि सेल) गिनती. सेल डी निर्धारित करने के लिए कोशिकाओं की गिनती का प्रयोग करेंअपने समाधान में ensity.
- टिशू कल्चर पर प्लेट कोशिकाओं 2 सेमी प्रति 0.9-1.0 x 10 4 कोशिकाओं पर प्लेटों या बोतल का इलाज किया. उदाहरण के लिए, 0.5 x 10 6 कोशिकाओं 1X EMT उत्प्रेरण मीडिया अनुपूरक (6 मिलीग्राम Media 100 मिमी प्रति प्लेट) युक्त संस्कृति मीडिया में एक 100 मिमी प्लेट में चढ़ाया.
- संस्कृति एक 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में कोशिकाओं चढ़ाया. दैनिक सेल आकारिकी मॉनिटर.
- तीन दिन चढ़ाना के बाद, मीडिया को हटाने और 1X EMT उत्प्रेरण मीडिया अनुपूरक युक्त ताजा पूर्व गर्म संस्कृति मीडिया के साथ की जगह. एक 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में संस्कृति के लिए आगे बढ़ें.
- पांच दिनों चढ़ाना के बाद, कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए तैयार हैं. सेल आकारिकी औंधा प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा कल्पना है.
2. Immunocytochemistry द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण
- 95% इथेनॉल युक्त एक पेट्री डिश में coverslips रखकर एक 24 अच्छी तरह से थाली के लिए बाँझ 12 मिमी coverslips तैयार करें. धीरे हमें इथेनॉल से coverslips निकालेंएक सुई और घुमावदार संदंश और लौ बाँझ आईएनजी. 24 अच्छी तरह से थाली में से एक कुएं में बाँझ coverslip जगह. शेष coverslips के साथ दोहराएँ.
- 1.7 - खंड 1.1 में वर्णित के रूप में सेल निलंबन की तैयारी.
- प्लेट 1.6 x 10 4 कोशिकाओं / अच्छी तरह से 0.5 मिलीलीटर 1X EMT उत्प्रेरण मीडिया अनुपूरक युक्त पूर्व गर्म संस्कृति मीडिया में.
- आगे बढ़ें और वर्गों 1.9 में वर्णित के रूप में कोशिकाओं को खिलाने - 1.11.
- पांच दिनों चढ़ाना के बाद, मीडिया को हटाने और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 1X फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) में 300 μl / अच्छी तरह से 4% paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक.
- लगानेवाला निकालें और कोशिकाओं 1X पीबीएस, 500 μl / अच्छी तरह से 2x कुल्ला.
- अवरुद्ध बफर के 400 μl / अच्छी तरह से कोशिकाओं को सेते कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए (1% गोजातीय सीरम albumin (BSA), 10% सामान्य गधा सीरम, और 0.3% ट्राइटन X-100 युक्त 1X पीबीएस).
- निर्माताओं में प्राथमिक एंटीबॉडी में सेते कमरे temperatur में 3 घंटे के लिए अवरुद्ध बफर की अच्छी तरह से 400 μl / में एकाग्रता की सिफारिश कीई या रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर सीधे एक fluorochrome संयुग्मित एक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करते समय, अंधेरे में नमूने सेते हैं.
- प्रत्येक धोने के 5 मिनट के लिए 0.1% BSA युक्त 1X पीबीएस के 500 μl / अच्छी तरह से कोशिकाओं तीन बार धोएं. सीधे एक fluorochrome संयुग्मित एक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करते समय, 2.12 कदम के लिए सीधे आगे बढ़ना.
- अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 1% BSA युक्त 1X पीबीएस के 400 μl / अच्छी तरह से में निर्माता की सिफारिश की एकाग्रता पर माध्यमिक एंटीबॉडी में कोशिकाओं को सेते हैं.
- प्रत्येक धोने के 5 मिनट के लिए 0.1% BSA युक्त 1X पीबीएस के 500 μl / अच्छी तरह से कोशिकाओं तीन बार धोएं.
- अगर वांछित, DAPI समाधान के साथ नाभिक counterstain.
- विआयनीकृत पानी में कोशिकाओं कुल्ला और coverslips बढ़ते मीडिया का उपयोग कर एक स्लाइड पर नीचे का सामना माउंट.
Representative Results
. T98G glioblastoma कोशिकाओं, HT29 बृहदान्त्र ग्रंथिकर्कटता कोशिकाओं: यहां वर्णित EMT उत्प्रेरण संस्कृति शर्तों सेल प्रकार की एक किस्म में EMT के शामिल होने के लिए एक मजबूत विधि प्रदान 1 और 2 से 4 विभिन्न मानव कोशिका लाइनों के लिए की आकारिकी और मार्कर अभिव्यक्ति के स्तर का प्रदर्शन आंकड़े , A549 फेफड़ों कार्सिनोमा कोशिकाओं, और MCF10A स्तन उपकला कोशिकाओं. एक mesenchymal, धुरी के आकार आकारिकी (- 1H आंकड़े 1E) के लिए - EMT उत्प्रेरण मीडिया के पूरक के साथ इलाज किया गया है कि कोशिकाओं को एक शास्त्रीय उपकला आकारिकी (1 डी आंकड़े 1 ए) से बदल दिया है. EMT प्रेरित कोशिकाओं uninduced कोशिकाओं की तुलना में कम घनी तंग कालोनियों में पैक दिखाई दिया. Uninduced MCF10A नमूने अधिक शिथिल पैक कोशिकाओं से घिरे कसकर बांध समूहों निहित. ये कसकर बांध समूहों (चित्रा 2 डी) ई cadherin सकारात्मक थे और EMT उत्प्रेरण मीडिया suppl के साथ इलाज पर गायब हो गयाement (चित्रा 2H).
EMT भी उपकला मार्करों और mesenchymal मार्करों की upregulation के डाउनरेगुलेशन द्वारा मूल्यांकन किया गया था. ई cadherin अभिव्यक्ति की डाउनरेगुलेशन आम तौर पर विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 3,4 में EMT प्रेरण निम्नलिखित मनाया जाता है 2 अनुपचारित कोशिकाओं का बहुमत (आंकड़े 2A - 2 डी, लाल) में ई cadherin की सतह अभिव्यक्ति को दर्शाता है चित्रा. के बाद अपनी अनुपस्थिति की तुलना में EMT प्रेरण (आंकड़े 2 ई - 2H, लाल). एक सेल लाइन, T98G, पहले अपने विश्लेषण रोका जो EMT प्रेरण, ई cadherin के एक अत्यंत कम बेसल स्तर है पाया गया था. Mesenchymal मार्कर, fibronectin की upregulation, EMT उत्प्रेरण मीडिया अनुपूरक (; हरे - - 2 डी आंकड़े 2 ई बनाम 2H आंकड़े 2A) के साथ शामिल होने के बाद भी दिखाई दे रहा था.
ई cadherin और fibronectin की अभिव्यक्ति के स्तर immunocytochemistry द्वारा देखाआगे कुल सेल lysates के पश्चिमी सोख्ता (चित्रा 3) के माध्यम से की पुष्टि की थी. वेस्टर्न ब्लॉट ई cadherin और immunocytochemistry द्वारा देखा Fibronectin अभिव्यक्ति की upregulation के डाउनरेगुलेशन की पुष्टि की. बैंड EMT प्रेरण निम्नलिखित रिश्तेदार गुना परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए densitometry और GAPDH के लिए सामान्यीकृत का उपयोग quantitated गया. ई cadherin के स्तर क्रमश: A549 और MCF10A कोशिकाओं में 6.4 और 3.4 गुना कम हो गई थी. Fibronectin का स्तर क्रमश: 4.1, 4.6 की वृद्धि हुई, और 2.3 T98G में गुना, A549, और MCF10A कोशिकाओं थे. वेस्टर्न ब्लॉट HT29 कोशिकाओं के बाद EMT प्रेरण में ई cadherin प्रोटीन के स्तर की महत्वपूर्ण कमी प्रदर्शित नहीं करता है, immunocytochemistry परिणाम में प्रतिष्ठित किया जा करने में असमर्थ है, जो ई cadherin (2 एफ बनाम चित्रा 2 बी), की सतह अभिव्यक्ति में कमी का प्रदर्शन कुल सेल lysates के पश्चिमी सोख्ता.
आगे EMT स्थिति, अतिरिक्त ज्ञात मार्कर का मूल्यांकन करने के लिएEMT के लिए पूर्व और बाद EMT प्रेरण विश्लेषण किया गया. पिछले परिणामों के साथ संगत, ई cadherin EMT प्रेरित किया गया था यह दर्शाता है कि सभी की जांच की सेल लाइनों में downregulated गया था. इसके अलावा, mesenchymal मार्करों, vimentin और घोंघा, EMT उत्प्रेरण मीडिया के पूरक के साथ इलाज (चित्रा 4) निम्नलिखित A549, T98G, और MCF10A कोशिकाओं में upregulated थे. HT29 सेल लाइन इन कोशिकाओं EMT शामिल होने के लिए वैकल्पिक रास्ते का उपयोग का संकेत हो सकता है, जो (नहीं दिखाया डेटा) के साथ या EMT प्रेरण के बिना या तो इन mesenchymal मार्करों की अभिव्यक्ति नहीं दिखा था.
TGF-β निश्चित सेल में EMT प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है 7,8,9 संदर्भों हालांकि, अन्य प्रकार की कोशिकाओं TGF-β 14 के अलावा करने के लिए पूरी तरह से जवाब नहीं है. MCF7 मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं और PANC -1 मानव अग्नाशय कार्सिनोमा कोशिकाओं दोनों अकेले 14 संकेतन TGF-β का जवाब नहीं दिया जाता है. दोनों लाइनों vitr में EMT गुजरना सकता है कि यह निर्धारित करने के लिएओ, कोशिकाओं EMT उत्प्रेरण मीडिया अनुपूरक की उपस्थिति में सुसंस्कृत थे. कोशिकाओं EMT उत्प्रेरण मीडिया अनुपूरक भीतर एकाग्रता में, अकेले पुनः संयोजक TGF-β1 साथ प्रेरित किया गया. इन कोशिकाओं को नियंत्रण कक्षों में देखा उन लोगों के लिए इसी तरह कसकर बांध कोशिकाओं की कालोनियों (डेटा) नहीं दिखाया और सतह ई cadherin के स्तर के थे मिलकर उनके उपकला आकारिकी बनाए रखा (आंकड़े 5C और 5D आंकड़े 5A बनाम और 5 ब). इसके विपरीत, EMT उत्प्रेरण मीडिया के पूरक के साथ उत्तेजित कोशिकाओं की सतह ई cadherin के स्तर में भारी कमी (आंकड़े 5E और 5F) से पता चला है. कोशिकाओं को कम कॉम्पैक्ट बन गया है और अधिक धुरी की तरह (नहीं दिखाया डेटा) के रूप में इन कोशिकाओं को भी एक और अधिक mesenchymal आकारिकी प्राप्त की. इन परिणामों यहाँ वर्णित EMT उत्प्रेरण विधि EMT आकारिकी और TGF-β-I के लिए आम तौर पर प्रतिरोधी कोशिकाओं में मार्कर अभिव्यक्ति परिवर्तन को बढ़ावा देने के लिए सक्षम है कि दिखानाnduced EMT.
मार्कर अभिव्यक्ति में परिवर्तन के अलावा, mesenchymal कोशिकाओं की एक और बानगी विस्थापित और आक्रमण करने की क्षमता है. प्रवासन और निर्माता के निर्देशों के अनुसार 96 बीएमई सेल आक्रमण परख का उपयोग विश्लेषण किया गया साथ या EMT उत्प्रेरण मीडिया पूरक के बिना सभ्य कोशिकाओं के आक्रमण. संक्षेप में, कोशिकाओं 8.0 माइक्रोन pores के साथ फिल्टर आवेषण युक्त (50,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) 96 अच्छी तरह से प्लेटों पर वरीयता प्राप्त थे. 48 घंटे के बाद, माइग्रेशन फिल्टर के माध्यम से चले गए कि कोशिकाओं की पूर्वाह्न धुंधला calcein द्वारा मूल्यांकन किया गया था. प्रत्येक नमूना इसी तरह के परिणाम के साथ दो बार तीन प्रतियों में परीक्षण किया गया था. एक प्रयोग से प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 6A में दिखाया गया. सेल प्रवास में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण बढ़ जाती है (पी मूल्य <0.003) EMT प्रेरण निम्नलिखित दोनों A549 और PANC-1 कोशिकाओं के साथ देखा गया था. (यानी बाह्य मैट्रिक्स के माध्यम से विस्थापित) पर आक्रमण करने के लिए इन कोशिकाओं की क्षमता का आकलन करने के लिए, एक ही परख थाएक तहखाने झिल्ली निकालने में लिपटे फिल्टर के साथ प्रदर्शन किया. EMT प्रेरित कोशिकाओं चित्रा 6B के रूप में देखा अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में आक्रमण क्षमताओं में एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण (पी मूल्य <0.001) में वृद्धि देखी गई.
EMT की मजबूत प्रेरण इन कोशिकाओं में जगह लेने के जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन और संकेतन के विश्लेषण के लिए उपयोगी है. और इलाज दोनों कोशिकाओं से lysates का उपयोग एंटीबॉडी आधारित सरणी विश्लेषण में एक भी नमूना अणुओं की एक किस्म की अभिव्यक्ति के स्तर का विश्लेषण करने के लिए एक विधि है. एक उदाहरण के रूप में, हम संयुक्त राष्ट्र प्रेरित और Proteome Profiler मानव Phospho-MAPK सरणी किट का उपयोग कर MCF7 और A549 कोशिकाओं EMT प्रेरित से lysates में phosphorylated MAPK परिवार के सदस्यों के स्तर का विश्लेषण किया. सरणी इसी तरह के परिणाम के साथ स्वतंत्र EMT प्रेरण उपचार से दो बार चलाया गया था. 7 एक सरणी से प्रतिनिधि डेटा से पता चलता है. दोनों प्रकार के सेल CREB (S133) की वृद्धि की phosphorylation का प्रदर्शन किया, ERK1 (टी 2 02/Y204), और EMT प्रेरित कक्षों में ERK2 (T185/Y187) नियंत्रण की तुलना में. संकेत घटनाओं में मतभेद के रूप में अच्छी तरह से दो प्रकार की कोशिकाओं के बीच मनाया गया. MCF7 कोशिकाओं की वृद्धि हुई p70S6K (T421/S424) phosphorylation दिखाया जबकि A549 कोशिकाओं, जीएसके -3 β (S9) phosphorylation में वृद्धि देखी गई.
चित्रा 1. EMT उत्प्रेरण मीडिया के पूरक के साथ उत्तेजना के बाद mesenchymal आकारिकी प्रेरण (ए - डी). चार प्रकार की कोशिकाओं में उपकला आकारिकी EMT उत्प्रेरण मीडिया पूरक के बिना मानक संस्कृति मीडिया में 5 दिनों के लिए संस्कृति निम्नलिखित संकेत (ई - एच). में Mesenchymal आकारिकी चार प्रकार की कोशिकाओं के 5 दिनों के लिए EMT उत्प्रेरण मीडिया के पूरक के साथ सुसंस्कृत संकेत दिया.
चित्रा 2. उपकला मार्कर अभिव्यक्ति और EMT प्रेरित कोशिकाओं में mesenchymal मार्कर अभिव्यक्ति की upregulation के डाउनरेगुलेशन. कोशिकाओं उपकला मार्कर, ई cadherin (लाल) की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए immunofluorescence द्वारा दाग रहे थे, और mesenchymal मार्कर, fibronectin (हरा). (ए - डी) 5 दिनों के लिए EMT उत्प्रेरण मीडिया पूरक के बिना सभ्य नियंत्रण कक्ष (ई -. एच) 5 दिनों के लिए EMT उत्प्रेरण मीडिया के पूरक के साथ संवर्धित कोशिकाओं. सभी कोशिकाओं DAPI (नीला) के साथ counterstained रहे हैं.
चित्रा 3. पश्चिमी धब्बा एक साथ उपकला और mesenchymal मार्कर अभिव्यक्ति की पुष्टि . (-) 5 दिनों के लिए EMT उत्प्रेरण मीडिया अनुपूरक चार प्रकार की कोशिकाओं की कुल सेल lysates की alysis वेस्टर्न ब्लॉट (EMT) के साथ या बिना इलाज, संकेत दिया. बाईं तरफ संकेत के रूप में ई cadherin, fibronectin, और GAPDH लोडिंग नियंत्रण के लिए बैंड हैं. सही पर संकेत के रूप में आकार मार्कर है.
चित्रा 4. Mesenchymal मार्करों, EMT प्रेरित कोशिकाओं में vimentin और घोंघा के upregulation. कोशिकाओं उपकला मार्कर, ई cadherin (ग्रे) की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए बहुरंगा immunofluorescence द्वारा दाग रहे थे, और mesenchymal मार्करों, vimentin (हरा) और घोंघा (लाल) . (एक - सी) के 5 दिनों के लिए EMT उत्प्रेरण मीडिया के पूरक के बिना सभ्य नियंत्रण कक्ष. (डी - एफ) 5 दिनों के लिए EMT उत्प्रेरण मीडिया के पूरक के साथ संवर्धित कोशिकाओं.
चित्रा 5. 5 दिनों के लिए TGF-β1 की 10 एनजी / एमएल युक्त मीडिया में सुसंस्कृत 5 दिनों के लिए अकेले मीडिया के साथ सुसंस्कृत TGF-β1 गैर जिम्मेदार कोशिकाओं में EMT की प्रेरण. (ए और बी) कक्ष. (सी और डी) कोशिकाओं. (ई और 5 दिनों के लिए EMT उत्प्रेरण मीडिया अनुपूरक में सुसंस्कृत एफ) कक्ष. सभी कोशिकाओं ई cadherin अभिव्यक्ति (लाल) के लिए दाग और DAPI (नीला) के साथ counterstained रहे हैं.
चित्रा 6. EMT प्रेरित कोशिकाओं प्रवास और आक्रमण क्षमता में वृद्धि हुई है. 48 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद एक 8 माइक्रोन ताकना फिल्टर के माध्यम से चले गए कि कोशिकाओं की ए औसत संख्या. बी औसत संख्या की48 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद तहखाने झिल्ली निकालने के साथ लेपित एक 8 माइक्रोन ताकना फिल्टर के माध्यम से आक्रमण करने में सक्षम थे कि कोशिकाओं. त्रुटि सलाखों 3 कुओं पर मानक विचलन का संकेत मिलता है.
EMT प्रेरण का आंकड़ा 7. एंटीबॉडी आधारित सरणी अभिव्यक्ति विश्लेषण. A549 (ए और सी) से lysates और साथ या EMT उत्प्रेरण मीडिया पूरक के बिना सभ्य MCF7 (बी और डी) कोशिकाओं के proteome Profiler मानव Phospho-MAPK सरणी किट का उपयोग सरणी के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया. स्पॉट एक में डाला और बी तो densitometry का उपयोग quantitated गया. संयुक्त राष्ट्र प्रेरित करने के लिए EMT प्रेरित lysates की तुलना (सी और डी) नीचे इसी बार रेखांकन में दिखाए जाते हैं. बड़ा आंकड़ा <देखने के लिए यहां क्लिक करें/ A>.
Discussion
EMT शामिल होने के लिए पिछला तरीकों आम तौर पर TGF-β उत्तेजना या आनुवंशिक संशोधन का इस्तेमाल किया है. अकेले TGF-β कुछ प्रकार की कोशिकाओं में EMT प्रेरित दिखाया गया है, यह अब TGF-β EMT के लिए आवश्यक है कि प्रदर्शन किया गया है, लेकिन यह सभी प्रकार की कोशिकाओं 6,14 में पर्याप्त नहीं है. EMT शामिल होने के लिए आनुवंशिक संशोधन का उपयोग समय लगता है और श्रम गहन है. यहाँ वर्णित विधि, विरोधी मानव ई cadherin, विरोधी मानव sFRP-1, विरोधी मानव DKK -1, पुनः संयोजक मानव Wnt-5 ए, और मज़बूती से EMT प्रेरित करने के लिए पुनः संयोजक मानव TGF-β1 सहित कारकों के संयोजन का उपयोग करता है. कारकों के इस संयोजन ई cadherin आधारित आसंजन, EMT प्रेरण 4 के लिए एक महत्वपूर्ण कदम ब्लॉक करने के लिए तैयार है, और Wnt -5 ए प्रोटीन जोड़ने के साथ ही Wnt inhibitors के लिए अवरुद्ध एंटीबॉडी का उपयोग करके WNT सिगनल बढ़ाने की है, sFRP-1 और DKK -1. Wnt और TGF-β संकेतन mesenchymal सेल स्टेट प्रेरित करने और बनाए रखने के लिए एक autocrine पाश में कार्य करने के लिए दिखाया गया हैई 6. इस प्रेरण विधि आनुवंशिक हेरफेर से बचा जाता है और अकेले TGF-β का उपयोग कर से अधिक प्रभावी है. महत्वपूर्ण बात है, हम पहले से (चित्रा 5) 14 TGF-β उत्तेजना को पूरी तरह से प्रतिक्रिया करने में नहीं दिखाया गया है कि MCF7 और PANC-1 कोशिकाओं, सहित प्रकार की कोशिकाओं में EMT के शामिल होने का पालन करने में सक्षम हैं.
EMT उत्प्रेरण मीडिया अनुपूरक शो कम कॉम्पैक्ट और वृद्धि की धुरी के आकार आकारिकी (चित्रा 1) के साथ इलाज किया कोशिकाओं. इसके अतिरिक्त, EMT (आंकड़े 2 और 3) की पहचान कर रहे हैं जो Fibronectin अभिव्यक्ति में वृद्धि के साथ सतह ई cadherin अभिव्यक्ति समवर्ती में कमी, वहाँ है. ऐसे vimentin और घोंघा के रूप में अतिरिक्त mesenchymal मार्करों भी uninduced नियंत्रण की तुलना में EMT प्रेरित कोशिकाओं (चित्रा 4) में upregulated हैं. बढ़ी हुई प्रवास और आक्रमण क्षमताओं mesenchymal कोशिकाओं के मुख्य कार्यात्मक लक्षण हैं. इन विट्रो में (चित्रा 6) की ओर पलायन और आक्रमण करने के लिए एक काफी वृद्धि की क्षमता का प्रदर्शन किया.
7 चित्र में दिखाया एंटीबॉडी सरणी अभिव्यक्ति डेटा का उपयोग कर के रूप में प्रदर्शन EMT शामिल होने के लिए यह सरल विधि EMT संकेतन के अध्ययन के लिए उपयोगी है. विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं ऐसे phosphorylated CREB में वृद्धि और MCF7 और A549 EMT प्रेरित कोशिकाओं दोनों में देखा ERK1 / 2 के रूप में EMT के साथ जुड़े आम अभिव्यक्ति हस्ताक्षर प्राप्त करने के लिए पूर्व और बाद EMT प्रेरण तुलना की जा सकती. CREB के S133 phosphorylation बाध्यकारी डीएनए को उत्तेजित करता है और TGF-β1 प्रेरित EMT 15 के बहाव में कार्य करने के लिए दिखाया गया है. ERK1 / 2 phosphorylation भी TGF-β1 प्रेरित EMT 16 के बहाव में कार्य करने के लिए दिखाया गया है. P70S6 बनाम A549 कोशिकाओं में जीएसके 3β phosphorylation में वृद्धि के साथ देखा के रूप में कोशिकाओं प्रकार के बीच संकेत दे रास्ते में अंतर भी स्पष्ट किया जा सकता हैMCF7 में कश्मीर phosphorylation. सेरीन 9 में जीएसके 3β phosphorylation यह समारोह कम हो जाती है, और जीएसके 3β समर्थक EMT प्रतिलेखन कारक, घोंघा 17 को बाधित करने के लिए दिखाया गया है. इसके विपरीत, p70S6K घोंघा गतिविधि लाती है और इसकी phosphorylation इस प्रोटीन 18 के सक्रियण के साथ जुड़ा हुआ है.
कुल मिलाकर, विशेष रूप से पहले पूरी तरह TGF-β का जवाब नहीं दिखाया कोशिकाओं में EMT, का सीधा और विश्वसनीय प्रेरण, EMT के जीव विज्ञान को समझने शकुन मार्कर के रूप में उपयोग के लिए आम अभिव्यक्ति हस्ताक्षर की पहचान, और कैंसर के लिए उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के विकास और मूल्यांकन के लिए उपयोगी है और fibrotic रोग.
Disclosures
आर एंड डी सिस्टम, Inc एक के लिए लाभ, सार्वजनिक कंपनी है.
उत्पादन और इस लेख के लिए नि: शुल्क प्रवेश के अनुसंधान एवं विकास प्रणाली, इंक द्वारा प्रायोजित है
Acknowledgments
लेखकों उपयोगी चर्चा और पांडुलिपि की समीक्षा के लिए जूलिया Hatler और मार्टिन Ramsden (आर एंड डी सिस्टम) को स्वीकार करना होगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epithelial cells of interest | We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1 | ||
| EMT Inducing Media Supplement | R&D Systems | CCM017 | |
| Recombinant Human TGF-β1 | R&D Systems | 240-B | Used at 10ng/ml |
| Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody | R&D Systems | NL648R | Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry |
| Anti-E-Cadherin | R&D Systems | MAB1838 | Used at 0.1 μg/ml for western blotting |
| Anti-Fibronectin | R&D Systems | MAB1918 | Used at 10 μg/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 μg/ml for western blotting |
| Anti-GAPDH | R&D Systems | AF5718 | Used at 0.2 μg/ml for western blotting |
| Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody | R&D Systems | NL009 | Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry |
| Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody | R&D Systems | HAF109 | Used at 1:2000 for western blotting |
| Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody | R&D Systems | HAF007 | Used at 1:2000 for western blotting |
| EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit | R&D Systems | SC026 | Used according to the manufacturer’s instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail. |
| 96 Well BME Cell Invasion Assay | R&D Systems | 3455-096-K | This kit was used according to the manufacturer's recommendations. |
| Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit | R&D Systems | ARY002B | This kit was used according to the manufacturer's recommendations19. |
| Mounting Media | R&D Systems | CTS011 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15350-061 | |
| 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| 95% Ethanol | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Triton-X-100 | Roche Molecular Biochemicals | 789-704 | Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration. |
| DAPI Solution | Sigma | D9542 | Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS. |
| Fine pointed curved forceps | Thermo-Fisher Scientific | 08-875 | |
| 12 mm coverslips | Carolina Biological | 633009 | |
| Nonfat dry milk | Used at 5% in TBST for blocking in western blotting | ||
| TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20] | For western blotting blocking and washing | ||
| PVDF Membrane | For western blotting | ||
| 4-20% SDS-page gel | For western blotting | ||
| ECL substrate | For western blotting | ||
| 15 ml conical tubes | |||
| Plates/flasks, tissue culture treated | |||
| 24-well plates, tissue culture treated | |||
| Pipettes / pipette tips | |||
| Pipet Aid / pipets | |||
| Hemocytometer | |||
| 37 °C Water Bath | |||
| 37 °C/5%CO2 Incubator | |||
| Centrifuge | |||
| Inverted light microscope | |||
| Fluorescence microscope |
References
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