Summary
Mänskliga neuroprogenitor celler (NPC) expanderades enligt prolifererande betingelser. NPC var differentierade i neuron-rika kulturer i närvaro av en kombination av neurotrofiner. Neuronala markörer detekterades genom immunofluorescens-färgning. För att isolera en ren population av nervceller, var NPCs differentieras på PEN-membran diabilder och laser capture microdissection utfördes.
Abstract
Neuroprogenitor celler (NPC) som isolerats från human fetal hjärna expanderades enligt proliferativa betingelser i närvaro av epidermal tillväxtfaktor (EGF) och fibroblast-tillväxtfaktor (FGF) för att tillhandahålla en riklig tillförsel av celler. NPC differentierades i närvaro av en ny kombination av nervtillväxtfaktor (NGF), hjärn-härledd neurotrofisk faktor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) och vitamin A-syra på skålar belagda med poly-L-lysin och muslaminin för erhållande av neuron- -rika kulturer. NPC också differentieras i frånvaro av neurotrofiner, DBC och retinsyra och i närvaro av ciliär neurotrofisk faktor (CNTF) för att ge astrocyternas rika kulturer. Differentierade NPCs karakteriserades av immunofluorescens färgning för en panel av neuronala markörer inklusive Neun, synapsin, acetylkolinesteras, synaptophysin och GAP43. Gliafibrillärt surt protein (GFAP) och STAT3, astrocyternas markörer, upptäcktes i 10-15% av differentierade NPCs. För att underlättacell-typ specifik molekylär karakterisering, var laser capture microdissection utförs för att isolera nervceller odlade på polyetennaftalat (PEN) membran diabilder. De metoder som beskrivs i denna studie ger värdefulla verktyg för att förbättra vår förståelse av den molekylära mekanismen för neurodegeneration.
Introduction
Livslångt neurogenes är känd för att förekomma i den subventrikulära zonen av de laterala ventriklarna och i subgranular skiktet i gyrus dentatus av den vuxna däggdjurshjärnan 1. Neuroprogenitor celler (NPC) som härstammar från dessa regioner är multipotenta celler som kan differentiera till neuron, astrocyter och oligodendrocyter 2. NPC har genererat intresse på grund av deras potential som skall transplanteras i patienter med olika neurodegenerativa störningar inklusive Parkinsons sjukdom, amyotrofisk lateralskleros, stroke och Alzheimers sjukdom (AD) 3. Studier med NPCs har i allmänhet fokuserat på denna transplantationsvinkel men potentialen av NPC-härledda neuroner som en cellodlingsmodell för att bestämma mekanismen för neurodegeneration har inte utnyttjats fullt ut. Tidigare studier har i allmänhet används efter mitotiska neuroner som isolerats från gnagare hjärnvävnader som behöver isoleras för varje experiment, eftersom de intesjälvförnyande. Även mänskliga neuroblastom cellinjer inklusive SH-SY5Y och SK-N-MC-celler kan expanderas, de inte har karaktär av primära neuroner. Mänskliga NPC, å andra sidan, erbjuder både fördelar eftersom de kan expanderas för flera passager och kan differentieras för att alstra en cellpopulation med egenskaperna hos primära nervceller 4,5. I den aktuella studien, beskriver vi en ny differentiering protokoll för att få en konsekvent neuron-rika befolkningen från kommersiellt tillgängliga NPCs isolerade från human fetal hjärna. Eftersom dessa kulturer inte innehåller en liten procent av gliaceller, behöver vi ytterligare metoder för att isolera en ren population av neuroner för molekylär karakterisering. Laser capture microdissection (LCM) är en ny teknik med vilken en homogen population av celler från ett avsnitt vävnad kan selektivt fångas för genuttrycksanalys 6. Hjärnan är en heterogen vävnad som består av nervceller, glia och andra cell types. LCM har använts för att bestämma nervspecifikt genuttryck analyser 7-10. Vi har tidigare utfört LCM av hippocampus nervceller från AD (Tg2576) mus hjärnan sektioner för att visa minskat uttryck av cykliskt AMP svarselement bindande protein (CREB) och BDNF specifikt i hippocampus nervceller 11. I den aktuella studien beskriver vi rutiner för utbyggnaden av mänskliga NPC, neuronal differentiering, immunofluorescens färgning för neuronala markörer och LCM för isolering av nervceller odlade på PEN-membran diabilder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utbyggnad av mänskliga NPC: er (Figur 1)
- Återuppliva den frusna lager av mänskliga NPCs från fostrets hjärna (Lonza, Walkers, MD, USA) och kultur dem i suspension i T-75 kolvar som neurosfärer (Figur 1A) i Neurobasal-medium som innehåller spridnings kosttillskott, EGF (10 ng / ml) och FGF (10 ng / ml).
- Efter 3 dagar i odling, överför neurosfärerna till ett 15 ml rör och centrifugera vid 500 rpm under 5 min.
- Kasta bort vätskefasen lämnar efter ~ 100 ^ mediet ovanför cellpelleten och överför till ett Eppendorf-rör. En 100 | il cellpellet är tillräckligt för att delas upp i två T-75-kolvar. Om mindre, minska antalet flaskor som neuroprogenitor celler inte föröka sig om split tunn.
- Denna fördelades i pelleten, med en 200 | il dricks 50x samtidigt hålla 200 pl spetsen mot botten av röret. Fördela cellsuspensionen lika i två delar och lägga till dem i två T-75-kolvar (1-2 split), en för den fortsattaexpansion och en annan för differentiering.
- Fortsätta kulturen av neuroprogenitor celler för expansion (första kolv) genom att ändra medium var 4-5 dagar tills neurospheres når sin ursprungliga storlek på 300-500 nm. Ändra medium genom centrifugering (500 rpm, 5 min), kasta det gamla mediet och lägga nytt medium.
2. Differentiering av Human NPCs i en Neuron-rik kultur (Figur 2)
- För differentiering av neuroprogenitor celler in i en neuron rik kultur, placera ett täckglas i varje brunn i en 24-brunnars platta och päls med 100 pg / ml av poly-L-lysin genom att tillsätta 500 | il i varje brunn. Inkubera skålarna i 30 min vid RT.
- Aspirera poly-L-lysin-lösningen och skölj plattan med sterilt vatten.
- Härnäst belägga brunnarna i plattan med 500 | il av 5 | ig / ml muslaminin och inkubera under 30 min. Efter inkubering tvättas brunnarna med PBS.
- 4 dagar efter splitting cellerna (steg 1.4), överför de små neurosfärer i kolven märkt "för differentiering" in i de belagda rätter vid en densitet av ~ 500 neurosfärer per brunn i en 24-brunnar.
- Efter 6 timmar, när neurosfärerna fästa till skålen, avlägsna spridningen mediet och tillsätt differentieringsmedium bestående av Neurobasal medium, B27 supplement, NGF (20 ng / ml), BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mM), och retinsyra (2 pM).
3. Immunofluorescensfärgning av differentierade NPCs (Figur 3)
- Efter odling av neuroprogenitor celler i neuronal differentiering medium under två veckor, en neuron-rika kultur erhölls. Skölj neuroner gång i PBS och sedan sätta fast dem i 4% paraformaldehyd under 30 min. En gång fast, skölj cellerna tre gånger med PBS.
- Inkubera cellerna med permeabilization buffert (5% BSA och 0,2% Triton X-100 i PBS) vid RT under 60 min.
- Inkubera skålarna O / N vid 4 ° C ina shaker med följande kombination av polyklonala och monoklonala antikroppar i 3% BSA i PBS: Neun (1:250) och synapsin (1:250), acetyl kolinesteras (1:500) och synaptophysin (1:250), BDNF (1 : 500) och GAP43 (1:250), STAT3 (1:500) och GFAP (1:1000).
- Tvätta täckglasen tre gånger med PBS och därefter inkubera dem med anti-kanin-Cy3 och anti-mus-FITC sekundära antikroppar vid RT i mörker under 90 min. Efter inkubering tvättas täckglasen tre gånger med PBS.
- Placera 10 l av monteringsmedium på en glasskiva, ta ut täckglas från odlingsskålen med pincett och placera den upp och ner på monteringsmedium. Försiktigt, torka bort överflödigt monteringsmedium och försegla kanterna med nagellack.
- Undersök immunostained nervceller i ett fluorescensmikroskop.
4. Laser Capture Microdissection av nervceller (Figur 4)
- Differentiera NPCs i en neuron-rik kultur på PEN-membran slidear belagd med poly-L-lysin och muslaminin följa förfarandena beskrivna för Figur 2.
- Utför alla efterföljande steg enligt RNAse-fria betingelser.
- Fläck kulturerna med användning HistoGene Stain (Arcturus) för att visualisera celler.
- Hitta områdena rena neuronala populationer saknar astrocyter använder färdplanen bild av hela bilden med Veritas LCM-systemet. Markera nervceller med hjälp av ritverktygen.
- Utför laser avskiljning av dessa områden med hjälp av datorstyrda precisions och automatisering i en två-stegsprocess. Först IR (infraröd) sköt på flera ställen med en lasereffektinställning på 70 mW och en puls av 2,500 ^ sek att få membranet fäster locket. Därefter markeras område excideras med användning av en UV-skärverktyg vid en inställning låg nivå på 10 mV.
- Kombination av dessa processer fångar selektivt de markerade områdena från PEN-membran på CapSure LCM makro mössor. När locket lyfts membranet med den n:eurons häftar vid locket.
- Isolera total-RNA från LCM-prover med användning av en PicoPure RNA-isoleringskit (Arcturus) och behandla med DNas.
- Förstärk det isolerade RNA med hjälp RiboAMP RNA förstärkning kit efter instruktioner från satsen.
- Utföra realtids-RT-PCR-analys med användning av TaqMan-prober för att detektera humant neurofilament tunga kedjan (hNFHc).
Förkortningar:
AD, Alzheimers sjukdom, BDNF, hjärn-härledd neurotrofisk faktor, CREB, cyklisk AMP-responselement-bindande protein; DBC, dibutyryl cyklisk AMP, EGF, epidermal tillväxtfaktor; FGF, fibroblasttillväxtfaktor, GFAP, glia fibrillärt surt protein, LCM, laser fånga mikrodissektion, NGF, nervtillväxtfaktor, NPC, neuroprogenitor cell; PEN, polyetennaftalat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Expansion av NPC (Figur 1)
När neurosfärer bryts ned till en enkelcellsuspension genom triturering, måste pipettspetsen vidröra botten av röret så att det finns ett visst motstånd när suspensionen pipetteras upp och ner. Antalet tider av finfördelning varierar mellan individer och måste avgöras genom försök och misstag genom att undersöka den resulterande cellsuspension i mikroskop. Det är kritiskt för att tillhandahålla tillräcklig täthet av cellsuspension, eftersom spridningen kommer att vara vid en högre hastighet när NPC komma i nära kontakt. Om NPC inte växer, bör celltätheten ökas genom att minska antalet kolvar. Vi har kunnat utöka neurospheres för upp till 10-15 passager. Kan genereras alltså rikligt utbud av mänskliga NPCs, minska användningen av mänsklig fostervävnad. För en fortsatt leverans av NPC: er och nervceller, är det önskvärt att utvidga dem till en början för 3-4 passager och därefter, Hälften av NPCs kan utökas som neurosfärer och den andra hälften kan differentieras för pågående experiment. Alternativt kan NPC skall också expanderas för flera passager, frystes i flytande kväve som i fallet av cellinjer för att generera större utbud av lagren, och återupplivas vid behov. Det är också önskvärt att utföra experiment med neuroner härledda från olika satser av NPC.
Neuronal differentiering av NPC (Figur 2)
NPCs är multipotenta celler, och kan delas in i neuron, astrocyter och oligodendrocyter beroende på odlingsbetingelser. Vår differentiering protokoll inblandade sådd av 4 dagar gamla neurosfärer i belagda rätter (Figur 2A). Vi konstaterade att det är nödvändigt att utsäde tillräcklig täthet av neurosfärer, så att differentierande nervceller spridda runt och bildar ett tätt nätverk av neuronala processer. Bilder efter 1 (Figur 2B) och 4 dagar (Fig.ure 2C) av sådd visas. Neuron-rika kulturer som ger 80-90% neuroner och 10-15% astrocyter, erhölls efter differentiering av NPC i närvaro av en kombination av NGF, BDNF, DBC och retinsyra i två veckor (fig. 2D). Så vitt vi känner till, det protokoll som beskrivs i denna studie för neuronal differentiering har inte tidigare rapporterats av andra. I områden med låg densitet, NPC differentieras till astrocyter (fig 2e). För att erhålla en astrocyt-rik kultur, kan NPC odlas i närvaro av CNTF (10 ng / ml) och i frånvaro av NGF, BDNF, DBC och retinsyra. Således neuron-astrocyte sammansättning kan manipuleras under differentiering beroende på syftet med försöket.
Karakterisering av differentierade nervceller (Figur 3)
För att ytterligare karakterisera dessa differentierade NPC, utförde vi dubbel immunfärgning för neuronala markörer wed polyklonala och monoklonala antikroppar, följt av exponering för kanin och mus sekundära antikroppar kopplade till Cy3 (röd) och FITC (grön) respektive. Följande neuronala markörer upptäcktes: Figur 3A:. Neun och synapsin Figur 3B:. Acetyl kolinesteras (AChE) och synaptophysin Figur 3C: BDNF och GAP43. Sålunda är de differentierade NPC ha egenskaper som primära neuroner. Dessutom gjordes astrocyternas markörer STAT3 och GFAP detekteras i en liten population av celler (Figur 3A). Därför behövs ytterligare metoder för neuronspecifikt genuttryck analys.
Laser Capture Microdissection (LCM) i nervceller (Figur 4)
Även LCM kan användas för isolering av celler från en odlingsskål, våra inledande försök LCM med nervceller misslyckats eftersom de är fast förankrade de belagda rätter. För att lösa detta problem, differentierade vi NPCs on bilder med PEN-membran skär belagda med poly-L-lysin och muslaminin. Objektglaset placerades inuti en 100 mm cellodlingsskål (Figur 4A). Arrangemangen i PEN-membran bild och LCM lock visas i figur 4B. Kulturerna färgades med HistoGen fläck (Arcturus) för att visualisera celler (Figur 4c). Objektglaset placerades i mikroskopet i Arcturus Veritas instrumentet. De nervceller som ska fångas var märkta med ritverktyg (Figur 4D). CapSure HS Caps placerades på PEN-membran. Genom att använda en kombination av UV-laserskärning och IR-laser capture ades de markerade områdena uppsamlas på locket. De tagna neuroner visas på locket vid låg (Figur 4F) och hög (Figur 4F) förstoring.
Figur 1.Utbyggnad av mänskliga NPCs. A. NPC odlades i suspension i T75-kolvar som neurosfärer. B. När neurosfärerna nått storleken 300-500 um, överfördes de till 15 ml rör och centrifugerades vid 1000 rpm under 5 min. C. Supernatanten kastades och cellpelleten i 200 | il-medium överfördes till Eppendorf-rör och finfördelades. D. Neurosfärer redo att dela visas. E. Trasiga neurosfärer efter triturering visas.
Figur 2. Differentiering av humana NPCs. A. Neuro bröts genom sönderdelning och odlades under fyra dagar för att generera nya neurosfärer. B. Fyra dagsgamla neuro ympades i skålar belagda med poly-L-lysin och muslaminin. C. differentieringtion av NPC observerades i närvaro av NGF, BDNF, DBC och retinsyra i tre dagar efter ympning. D. Neuron-rik kultur erhölls efter två veckor. E. NPC differentieras till astrocyter i områden med låg densitet. F. NPC differentieras till en astrocyt-rik kultur i närvaro av CNTF (10 ng / ml) och i frånvaro av NGF, BDNF, DBC och retinsyra.
Figur 3. Neuronal och astrocyternas markörer i differentierade humana NPCs. NPCs differentierade i två veckor fixerades och dubbel immun för angivna mål med polyklonala och monoklonala antikroppar, följt av exponering för kanin och mus sekundära antikroppar kopplade till Cy3 (röd) och FITC (grön) respektive. Följande neuronala markörer upptäcktes: A. Neun och synapsin.B. Acetyl kolinesteras (AChE) och synaptophysin. C. BDNF och GAP43. Dessutom har följande astrocyternas markörer upptäcks: D. STAT3 och GFAP.
Figur 4. Laser fånga microdissection av nervceller. A. NPCs differentierades på en PEN-membran slide belagd med poly L lysin och muslaminin. Sliden placerades i en 100 mm cellodlingsskål. B. arrangemang av PEN-membran slide och LCM mössa i Arcturus Veritas instrumentet visas. C. Kulturer färgades med HistoGen fläck (Arcturus) för att visualisera celler. D. nervceller som ska fångas var märkta med ritverktyg. De tagna neuroner visas på locket vid låg (E) och hög (F) magnifiering. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver i denna studie en neuron-rik cellodlingsmodell genom differentiering av självförnyande humana neuroprogenitor celler och en metod för att isolera en ren population av nervceller med laser capture mikrodissektion. Vi har använt en kombination av NGF, BDNF, DBC och retinsyra för neuronal differentiering av NPC. DBC används för att aktivera CREB, en transkriptionsfaktor som förstärker neurogenes 12. Retinoinsyra inducerar cellcykel exit och minskar gliaceller befolkning 13. Den metod som beskrivs i denna studie innehåller ändringar över vår tidigare rapport 14. Vi hade tidigare använt steget att finfördelning neurosfärerna till en enda cell fjädring och därefter sådd den i belagda rätter. Detta kan leda till ineffektiv neuronal differentiering i områden med låg densitet (fig. 2E). Vi har nu infört förfarandet för sådd fyra dagar gamla små neurosfärer (Figur 1B) att se till att kontakterna mellan differentieringting nervceller (Figur 1C). Dessutom är differentieringen tillägg (Stem Cell Technologies) ersätts med B27-supplement (Invitrogen), 4-5 dagar efter sådd. Den nuvarande metoden ger 80-90% nervceller konsekvent. Dessa nervceller med ett omfattande nätverk av processer kan hållas i odling under 2-3 månader, en klar fördel jämfört med neuronala modellen till följd av differentiering av neuroblastomcellinjer. Immunfärgning av flera neuronala markörer inklusive NeuN, synapsin, acetylkolinesteras, synaptofysin och GAP43 observerades med differentierade NPC (Figur 3). STAT3 och GFAP, markörer för astrocyter har också upptäckts i en liten population av celler. Genom att öka koncentrationen av retinsyra till 2-5 pM kan astrocyt populationen minskas ytterligare. Däremot kan sådana kulturer inte upprätthållas under en lång tid eftersom gliaceller stöd neuronal överlevnad genom utsöndring av tillväxtfaktorer. Vi har observerat att detär önskvärt att öka vitamin A koncentration 3-5 dagar innan du utför experimenten.
Den heterogena karaktären av differentierade nervceller innebär utmaningar när det gäller att bestämma cell-typspecifika genuttryck profilering. Därför har vi optimerat förutsättningarna för LCM av odlade neuroner (figur 4). I den aktuella studien, differentierade vi NPCs på diabilder med PEN-membran skär och utfört LCM eftersom denna teknik presenterade svårigheter med nervceller odlade på vanliga cellodlingsskålar eftersom de är ordentligt fastsatt. Även om målen för LCM kan uppfyllas genom immunhistokemisk analys, LCM erbjuder flera fördelar, inklusive möjligheten att förstärka signalen på RNA-nivå, utföra multiplex analys och noggrann kvantifiering. I kombination med microarray, låter LCM expressionsanalys av tusentals gener i utvalda celltyper 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter för att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Merit Review bidrag (NEUD-004-07F) från Veterans Administration (SP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neuroprogenitor cells (NPCs) | Lonza | PT-2599 | |
| Neurocult NS-A human basal medium | Stem cell technology | 5750 | |
| Neurocult NS-A Proliferation supplement | Stem cell technology | 5753 | |
| Neurocult NS-A Differentiation supplement | Stem cell technology | 5754 | |
| B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Human epidermal growth factor | Stem cell technology | 2633 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F0291 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Cell signaling | 3897S | |
| Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma | D-0627 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
| Mouse laminin | Sigma | L-2020 | |
| Retinoic acid | Sigma | R-2625 | |
| STAT3 antibody | Cell signaling | 9132 | |
| GFAP antibody | Cell signaling | 3670 | |
| GAP43 antibody | Transduction laboratories | 612262 | |
| BDNF antibody | Millipore | AB1534SP | |
| Acetyl cholinesterase antibody | Santz cruz | Sc-11409 | |
| Synaptophysin antibody | Abcam | ab18008-50 | |
| NeuN antibody | Chemicon | MAB377 | |
| Synapsin antibody | Novus | NB300-104 | |
| Anti mouse FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
| Research Laboratories | |||
| Anti Rabbit Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
| Research Laboratories | |||
| BSA | Sigma | A1653 | |
| Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
| Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
| Coverslip (Big circle cover slip) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
| Mounting medium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
| Pen membrane | Applied biosystems | LCM0521 | |
| Histogene LCM frozen section staining kit | Applied biosystems | KIT0401 | |
| RiboAmp RNA Amplification kit | Applied biosystems | KIT0201 | |
| Picopure RNA Isolation kit | Applied biosystems | KIT0202 | |
| CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |
References
- Doetsch, F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).
- Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. Neural stem cells: an overview. Circ. Res. 92, 598-608 (2003).
- Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review. J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).
- Breier, J. M., et al. Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science. Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).
- Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection. J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).
- Robles, Y., et al. Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning. Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).
- Su, J. M., et al. Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues. Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).
- Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. Downregulation of CREB expression in Alzheimer's brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons. Mol. Neurodegener. 6, 60 (2011).
- Dworkin, S., Mantamadiotis, T.
- Trujillo, C. A., et al. Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics. Cytometry A. 75, 38-53 (2009).
- Pugazhenthi, S., et al. Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells. J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).
- Kamme, F., et al. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity. J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).
