Summary
Abstract
סרקומה היא מחלה מאוד נדירה שהיא הטרוגנית בטבע, כל פוגעות פיתוח הטיפולים חדשים. חולי סרקומה הם מועמדים אידיאליים לרפואה אישית לאחר ריבוד, המסבירים את הריבית הנוכחית בפיתוח מודל xenotransplant לשעתק ועלות נמוכה למחלה זו. קרום chorioallantoic החומוס הוא מארח immunodeficient טבעי מסוגלים לקיים רקמות ותאים מורכבים ללא הגבלות מינים ספציפיות. בנוסף, ניתן לגשת בקלות, מניפולציות וצלם באמצעות stereomicroscopy אופטי וקרינה. היסטולוגיה נוספת מאפשרת ניתוח מפורט של אינטראקציות הסלולר heterotypic.
פרוטוקול זה מתאר בפירוט באובו השתלה של קרום chorioallantoic עם רקמות טריות סרקומה הנגזרות סרטניים, השעיות התא בודדות שלהם, וקווים קבועים וארעיים שכותרתו fluorescently הוקמו סרקומה סלולרי (Saos-2 וSW1353). עכברוש הישרדות החומוסes הוא עד 75%. המודל משמש ללמוד שתל (כדאיות, Ki67 מדד התפשטות, נמק, חדירה) ומארח (חדירה פיברובלסטים, ingrowth כלי דם) התנהגות. להשתלה מקומית של השעיות תא בודדות, ECM ג'ל מספק יתרונות משמעותיים על פני חומרי בלימה אינרטי. מדד ההתפשטות Ki67 קשור למרחק של התאים מפני שטח של CAM ואת משך הזמן של יישום ברמ"א, שהאחרון קביעת מסגרת זמן לתוספת של מוצרים טיפוליים.
Introduction
סרקומה היא גידול נדיר של רקמות החיבור עם תמותה גבוהה בשל התנגדות 1,2 הטיפול. התקדמות בהישרדות חולה הקשתה על ידי שכיחותם הנמוכה השנתית, הגיוון הרחב שלהם, ואת העובדה שתאי סרקומה הם דיווחו להיות קשים לתרבות במבחנה 3,4.
השימוש בתאים בתרבית להערכת טיפול קליני גילו כי מולקולות חדשות, ככל הנראה פעילה במבחנה לא תמיד משקפות את התוצאות בסביבה הקלינית. יתר על כן, סטיות הגנום מתגלים על ידי מערכי ביטוי גנים הן לא תמיד קשורות למאפייני התנהגות סרטניים בחולה בודדת 5-7. על מנת לנסות ולפתור את הבעיות הללו, רפואה מותאמת אישית צברה בחשיבותו, אשר באה לידי ביטוי בחיפוש המוגבר לדגמי xenograft 8-12.
ב assay vivo יש את היתרון של המשקף הגומלין המורכב בין גתאי ancer וסביבת רקמת המארח בגידולים מוצקים, הנדרשים להתפשטות הסרטן והפלישה 13. נכון לעכשיו אנחנו לומדים את השימוש של assay ממברנה Chorio-allantoic (CAM-assay) כמודל לשחזור xenograft סרקומה 14,15. assay זה נעשה שימוש נרחב למחקר של אנגיוגנזה גידול 16,17. בספרות, לעומת זאת, מצאנו פרוטוקולים שונים עבור assay זה, בעוד שמחקרים אחרים שנצפו הבדל משמעותי בצמיחה או אנגיוגנזה על פי פרוטוקולים שונים 18,19.
במאמר זה אנו לחקור את ההשפעה של משתנה תנאים של CAM-assay על התנהגות תא סרטניים, באמצעות שתלי השעיות תא בודדות שמקורם בגידול בתרביות תאי סרקומה ומבוססות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ראה איור 1 לסקירה
חומר גידול
1. קבלת והכנת דגימות גידול
לשימוש בחומר בחולה, האישור של ועדת האתיקה הוא הכרחי, ויש לו הסכמה מדעת שמתקבלת מהמטופל.
- חומר קציר נציג (מינימום 1 ס"מ 3) בזמן של התערבות, או ביופסיה או כריתה של סרקומה. האתר הנכון של ביופסיה מוגדר באמצעות דינאמי ניגוד MRI.
- הנח את החומר באופן מיידי בבקבוקון המכיל סטרילי DMEM בתוספת 1,000 U פניצילין ו1 מ"ג / מיליליטר סטרפטומיצין.
- להעביר את הבקבוקון באופן מיידי (30-90 דקות) למעבדה.
כל הנהלים הבאים מבוצעים תחת הזרימה למינרית.
- יוצקים את התוכן של הבקבוקון לתוך צלחת פטרי סטרילית.
- שים מדגם הגידול לחלקים קטנים של מקסימאלי 1 מ 'מ '3 באמצעות אזמל סטרילי. הסר את כל החלקים המסוידים כפי שהם נוטים לפגוע בעיבוד נוסף של הרקמה.
- באופן אקראי לקחת 10 שתלי גידול ליישום ברמ"א.
2. הכנת השעיות תא בודדות שמקורם בגידול
משך משוער: 3 שעות
- לשקול את הרקמה הנותרת של המדגם.
- לשים 4 - 2 גרם של רקמה בצינור Dissociator, צינור אחד או יותר עשוי להידרש לעכל את כל רקמת הגידול שנותרה.
- לעיכול של 4 - 2 גרם של רקמה, להוסיף פתרון 2.5 מ"ל DNase (22 KU / מיליליטר RPMI 1640) פתרון 2.5 מ"ל collagenase 2 (500 U / מיליליטר RPMI 1640) ו.
- לעבד את הרקמה פי פרוטוקול h_tumor Dissociator. זה כולל 2 מחזורים של דגירה על 37 מעלות צלזיוס בCO 2 באינקובטור תוך הצינור הוא מזועזע בעדינות במשך 30 דקות.
- סנן את ההשעיה הנותרים דרך מסננת תא 150 מיקרומטר.
- צנטריפוגה lysate ב 1000 סל"ד במשך 5 ק"מn.
- הסר את supernatant.
- Resuspend גלולה ב 10 מ"ל של חיץ תמוגה הכדורית האדומה (ELB), המאפשר 10 דקות של דגירה עם השעיה קבועה.
הערה: מאגר תמוגה כדורית אדומה מיוצר באופן הבא: הוסף 0.037 גרם EDTA, 0.99 גר 'K 2 HPO 4, Cl 4 8.29 גרם NH ל1,000 מ"ל אקווה, השתמש 10 N NaOH כדי להתאים את ה-pH ל 7.3, מסנן תחת לחץ דרך 0.22 מיקרומטר לסנן. חנות ב 4 ° C.
- הוסף 25 מ"ל של מדיום התרבות (DMEM בתוספת 10% בסרום שור עוברי, 100 U / ml פניצילין, וסטרפטומיצין מיקרוגרם / מ"ל 100) כדי לעצור את התגובה.
- צנטריפוגה ההשעיה ב 1000 סל"ד במשך 5 דקות. הצבע של גלולה צריך להיות לבן עכשיו.
- הסר את supernatant.
- הוסף 5 מ"ל של מדיום לגלולה. סנן את ההשעיה דרך מסננת תא 70 מיקרומטר.
- לספור את מספר התאים / מ"ל חיות באמצעות דלפק תא אוטומטי.
3. גשורות תאי ancer
SAOS2 תאי אוסטאוסרקומה (מספר ATCC: HTB-85) לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר היו electroporated ידי וקטור pEGFP-C1 באמצעות הסלולרי קו Nucleofector ערכת V על פי הפרוטוקול של היצרן. כדי לבסס את שורות תאי יציבות, תאי transfected נבחרו בG418 (1 מ"ג / מ"ל) למשך 4 שבועות בקנה אחד עם פרוטוקול קודם הוקם 20. בנוסף מיון נעשה על ידי מיון תאים הופעל פלואורסצנטי (FACS) על פי הוראות היצרן.
תאים משורת תאי SW1353 כונדרוסרקומה (מספר ATCC: HTB-94) או השעיות תא בודדות סרטניים טרי מוכנים מסומנים באמצעות קרום lipophilic ניאון כתם אדום.
- להסיר את התאים מבקבוק התרבות באופן קלסית באמצעות טריפסין (0.5% wt / כרך) חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA; 0.2% wt / כרך) פתרון.
- צנטריפוגה ההשעיה התא במשך 5 דקות ב 1000 סל"ד.
- הסר supernatant.
- הוסף 1 מ"ל של מדיום סרום ללא ו5 DiI μl (Vybrant האדום) / 10 6 תאים.
- עטוף את הבקבוקון ברדיד אלומיניום ולשים אותו בCO 2 באינקובטור למשך 10 דקות ב 37 ° C.
- צנטריפוגה שוב במשך 5 דקות ב 1000 סל"ד ולהסיר את supernatant.
assay קרום Chorioallantoic
1. דגירה ביצה
- ביצים מופרות ממדגרה מסחרית מקומית מבטיחה הפריה 95% מהביצים נדרשות.
- ניתן לאחסן ביצים מופרות ב RT עד 10 ימים.
הערה: לפני שמתחילים דגירה, לכלוך, נוצות וצואה יוסרו בזהירות מקליפות הביצים אופן מכאני על ידי ניגוב יבש עם מגבות נייר, אשר יש מחוספסת ולא מבנה משטח רך. מנגב את הביצים עם 70% אתנול מפוגל או כל מגיב ניקוי אחר מפחית באופן משמעותי את שיעור ההישרדות של עוברי האפרוחים.
- שים את הביצים בincubator בצד אחד, מסמן את המשטח העליון. היום שבו הם שמו את הביצים בחממה מיועד 0 יום של התפתחות עוברית.
- הגדר את טמפרטורת ההדגרה ב 37.8 מעלות צלזיוס, ולחות על 47%. ודא שאפשרות הסיבוב האוטומטית כבויה.
2. פתיחה של הביצים
משך: ± 60 דקות במשך 25 ביצים
ביום פיתוח 3, את הביצים נפתחות תחת זרימת אוויר למינרית. פתיחה את הביצים בתוצאות שלב התפתחותי נוספות בניזק לרמ"א, כקרום נוטה להיצמד לקליפה. מנורת אינפרא אדום משמשת כדי לשמור את הביצים חמה במהלך ההליך. כדי לשפר את העקרות, אנו ממליצים על השימוש בכפפות יד.
- מניחים את הביצה בגביע הביצה, עם הצד המסומן יפנה כלפי מעלה.
- להוריד את הרמה של CAM על ידי הסרת שתי מ"ל של חלבון G דרך מחט 18 הוכנסה בקצה של הביצה. אם המחט היא בוטה לאחר הניקוב כמהקליפות ביצים, החליפו את המחט. אם לא, יש לו כוח רב מדי כדי להיות מופעל, וכתוצאה מכך לניזק לחלמון הביצה או שבר של הקליפה. לפעמים המחט חסומה על ידי chalazae, אחד מ2 להקות ספירלה מתלים החלמון בחלבון. זה יכול להיפתר על ידי בעדינות דוחף את הבוכנה חזרה למטה עד לגוש נפתר. אם חלמון הביצה נשאב לתוך המזרק, החלף את המחט, כמו גם את המזרק. לפעמים את העובר מת לאחר אירוע זה. אם כמות מספקת של חלבון מוסרת, CAM יהיה פגום כאשר מסירים את הקליפה.
- החל סרט דבק semipermeable בצד העליון של הקליפה המסומן כדי למנוע שפיכה של חלקיקי קליפה על CAM תוך חיתוך החלון.
- הפוך את חור כניסה עם מרצע קטן על פני השטח של הביצה.
- לחתוך חלון של 1 ס"מ 2 בקליפה, בעזרת זוג מספריים כירורגיות מחודדים סטריליים.
- הלב הפועם של העובר וכלי סמוכים ניתן לצפות במשטח דואר של חלמון הביצה. הסר את הביצים שאינן מופרות או עוברים מתים. היבט קטע של כלי הדם שמאפיין את העוברים מתים.
- לאטום את החלון עם סרט דבק semipermeable. אין זה הכרחי כדי לכסות את האתר לנקב, אלא אם כן את הקליפה נסדקה במהלך החדרת המחט.
3. נוהל חיסון
משך: ± 1 שעות בכל שורת תא
על החומוס עוברי פיתוח יום 9, את הביצים הם מחוסן תחת זרימת אוויר למינרית.
הערכה של תאים סרטניים מתפשטים ברחבי CAM דורשת בלימה של התאים למשטח מוגבל בזמן החיסון. Matrigel הוא מטריצת ג'ל (ECM) תאי מסרקומה עכבר Engelbreth-Holm-הנחיל משמשת לעתים קרובות בתנאי תרבית תאים ניסיוניים. זה נוזל כאשר התקררו, אבל יעבור פילמור הופעל תרמית כאשר הובא ל20 - 40 מעלות צלזיוס, ובכך יוצר ג'ל יציב. במהלךהניסויים, Matrigel נשמר בתיבה המכילה קרח נמס.
הערה: אנחנו מתעקשים לא להשתמש coverslips מחוררת. הבחנו קובץ מצורף וצמיחה של תאים סרטניים מורכבים על גבי דיסק הפלסטיק ובכך הטיית פוטנציאל צמיחה של התאים על הקרום עצמו.
- Resuspend תא גלולה בג'ל ECM מקורר בריכוז של 10 6 cells/100 ג'ל ECM μl. שמור פתרון זה על קרח נמס.
- חלק בלו של הקרום החדיר למחצה עם זוג כירורגית סטרילית תחת זרימת אוויר למינרית. אם הסרט דבק נמחק לחלוטין, זה יגרום לשיעור גבוה יותר של מוות עוברי עקב זיהום.
- גע בזכות CAM מתחת לחלון הקליפה בקלילות עם מוט זכוכית סטרילי, על מנת להסיר את שכבת תאי אפיתל. הנגיעה CAM עם מוט זכוכית סטרילית מוכיחה להיות פחות טראומטי מאשר באמצעות אזמל n ° 11, אשר דורש יותר handiness וניסיון. שטפי דם קטנים עלולים להתרחש.
- dding חומר גידול.
- לשתלים סרטניים: חתיכה בעדינות תחתונה של רקמה על CAM עם זוג מלקחיים סטריליות, בלי לסחוט אותו.
- להליך ג'ל ECM: הוסף 25 μl 4x-ECM של תא ההשעיה ג'ל לרמ"א, על גב אחד את השני, מה שמאפשר את הג'ל לפלמר בECM בין היישומים. בדרך זו פלאק חסיד המכיל את התאים הסרטניים נוצר.
- לאטום את חלון הפגז שוב עם סרט דבק semipermeable.
4. הדמיה וקציר של CAM
משך הפעילות: 2 שעות במשך 25 ביצים
על החומוס עוברי פיתוח יום 16, את המצלמות נקצרים. עבודה תחת זרימת אוויר למינרית היא לא הכרחית.
- להגדיל את החלון עם זוג המספריים כירורגיות. הקפד שלא לחתוך נמוך מדי, אחרת CAM יהיה פגום, וכתוצאה מכך הדימום של כלי הפצועים.
- הוסף 300-500 μl של PBS D עם טפטפת על כת CAMיון המכיל את החומר מחוסן. אם לא משתמשים בבדיקות ניאון, נאגר פורמלין יכול לשמש כזה הופך את הקרום נוקשה, להקל על החיתוך של הממברנה.
- הפוך תצלום של CAM בביצה דרך מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו, מצויד במצלמה דיגיטלית בצבע, הן באמצעות GFP או מסנן DSR, ואין סינון. את השתלים לגידול, כל הצילומים נעשים ללא מסננים. הארה מלמעלה על ידי נורות LED מומלצת מאוד בזמן צילום (איור 2).
- נדידת תאי גידול שיא לתאים שכותרתו. הגבולות של הגידולים עלולים להיות בלתי סדירים ומרופטים. תאים מפוזרים עשויים להיות נוכחים בסמוך לגבולות גידול. בחלק מהדגימות, שורות של תאים סרטניים אפשר לראות (איור 3).
- חותכים את הקרום עם מספריים סטריליים בגבול שוכב נגד הקליפה.
- הנח את CAM נקטף בצלחת פטרי סטרילית מלאה עם PBS D או שנאגרו במשךmaldehyde.
- הפוך את תמונה של שניהם בצד העליון וצד התחתון של רמ"א, עם ובלי פילטר.
- שים את הקרום במכל שכותרתו עם פורמלין שנאגרו במשך לפחות 72 שעות.
- הטמע את המצלמות בפרפין ולהכין אותם לבדיקה היסטולוגית. תשמור על עצמך כדי לחתוך את השתלים הסרטניים במרכזו של הגוש הקטן, כדי לוודא ששטח החתך מקביל לחלקו התחתון של הקלטת. אם לא, את האינטראקציה בין CAM ושתל הגידול לא תהיה גלויה. אותה האסטרטגיה חלה על לוחות ג'ל ECM: פני השטח מול להב החיתוך צריך להיות בניצב ללוח.
5. ערכה היסטולוגית
מכתים hematoxylin-Eosin וקי 67 אימונוהיסטוכימיה בוצעו לבירור נוסף, במידת צורך. אימונוהיסטוכימיה בוצעה בסעיפי רקמות פרפין מוטבעים פורמלין-קבועים של 3.5 מיקרומטר בעובי, באמצעות שקופית Stainer אוטומטי על פילהוראות יצרן. נוגדן חד שבטי עיקרי עכבר כדי Ki-67 (שיבוט MIB-1, דילול 1/100) היה בשימוש. חום-Induced epitope אחזור בוצע באמצעות מיזוג 1 סלולרי, ויזואליזציה הושגה עם ערכת זיהוי DAB האוניברסלית, על פי הוראות יצרן. Dehydratation מסעיפי הרקמות בוצעה באמצעות coverslipper אוטומטי.
לSW1353 את שורות תאי SAOS2 ו, מספר תא nuclei/100 מיקרומטר 2 Ki67 החיובי והשלילי Ki67 נספר בשלושה אזורים: אחד קרוב לגבול של רמ"א, אחד לסגור את פני השטח ואחד במרכז פלאק ג'ל ECM. הליך זה חזר על עצמו 6x עבור כל שקופית קי 67 מוכתמת. המדד של התפשטות נקבע עבור כל שקופית על ידי חלוקת מספר התאים Ki67 חיובי במספר הכולל של תאים נספרו.
נמק מוגדר על ידי אובדן של פיזור העדין של הכרומטין בגרעין התא, בליווי פאדיng של שולי תא נפרדים. לxenografts, נמק הוא הבקיע כמלא, חלקי (לעתים קרובות על פני השטח), או ייעדר. חדירה של תאי גידול לCAM מוגדרת על ידי התצפית של תאים סרטניים בתוך המזודרם של רמ"א, והוא הבקיע כמו להיות נוכח או ייעדר.
שלושה פריטים מקבלים נקודות על התנהגות מארחת. חדירת פיברובלסטים מוגדרת כתאים מוארכים עוזבים CAM ופולש השתל / פלאק גידול, והוא הבקיע כמו להיות נוכח או ייעדר. ingrowth כלי דם יכול להיות שנצפה כingrowth של מתרבה כלי חומוס, מאופיינים על ידי הנוכחות של אריתרוציטים חומוס nucleated.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הערכה של רמ"א
שתלי גידול הפכו חסיד לרמ"א (איור 2 א). השעיות תא בודדות מחומר שהמטופל להציג שלט מיובש, מוגבה מעט (איור 2 ד) לעתים קרובות. לאחר הכריתה של רמ"א, סימן קימוט של הקרום מתרחש (איורים 2E ו2F).
לשורות התאים המסחריות פלאק הופך אטום יותר בזמן, מה שמעיד שגשוג תאים. שורות תאים שונות בECM ג'ל יש דפוס צמיחה מובהק ברמ"א. SAOS2 יוצר פלאק מתפשט, עם עלייה מובהקת של פני השטח מהיום 7 לאחר חיסון, בעוד שאות ה-GFP נותרת חזקה, המעיד על תאי קיימא. הגירה של תאי SAOS2 יכולה להיות מקבילה דמיינו לכלי השיט של CAM (איור 3). כאשר נצפה דרך stereomicroscope, ניתן לראות כאשר לא נעשה שימוש במסנן כלי דם. לא ניתן להבחין בתאים סרטניים, כאשר אף Filter משמש. לא ניתן לדמיין את כלי הדם כאשר מסנן ה-GFP מוכנס. על ידי סיבוב המסנן לסירוגין, ניתן לראות את הקשר ההדוק בין התאים הנודדים וכלי הדם. דימום Punctiform ניתן לצפות באמצעות השלט (איור 4, שורות 1 ו -2). את הפלאק המכיל תאי SW1353 להראות ירידה במשטח ונוטה להתכווץ רמ"א, וכתוצאה מכך קרום מקומט לאחר קצירתו (איור 4, שורות 5 ו -6). אות DSR פוחתת ככל שבדיקת הניאון הופכת להיות מדוללת לאחר חלוקות תא רבות. מיום 7, דימום הוא ציין בתדירות גבוהה. אם דימום מתרחש, אות DSR גם פוחתת.
תגובת כלי דם יכולה להיות דמיינו לאחר כריתה של CAM בתצוגה הנמוכה, מראה כלי מפותלים המקיפים את השתל או פלאק (איור 2). תגובת כלי דם של CAM הוא ציין בקבוצת Tumorgraft, קבוצת ההשעיה התא בודדת (<חזק> איור 2 ג ו2F) וקבוצת ECM ג'ל השליטה (איור 2G), אך לא בקבוצות ביקורת פתרון תא (איור 2H). ניתן לראות כלי מפותלים חדשים שנכנסו למדגם, הסתעפות (איור 2I, ראשי חץ) וanastomosing (איור 2I, כוכביות) אחד עם השני; גם אזורים קטנים של דימום מתרחשים (איור 2I, חיצים). Neovascularization של הגידול ניתן לכמת בשקופיות H & E באזורים של פלאק הגידול / גידול השונים.
ראיות היסטולוגית מראה כי תאי SAOS2 לשמור על מראה תא בודד לאורך היקף ECM ג'ל השלם, וגרמו עובי וקוטר של פלאק מוגבר. הם פולשים לשכבת mesodermal של CAM (איור 5 א, חץ), ובכך להגדיל את המרחק בין שכבות ectodermal של CAM endodermal וכמו רוכסן פתיחה (איור 5 א (איור 5, חץ). מספר התאים ואשכולות סלולריים לעלות בהתמדה בזמן, ומספר תאים שאינם מגביר את שגשוג מיום 7, בעיקר על פני השטח של השלט. לSW1353, ההתכווצות של CAM יכולה גם להיות מוערכת על שקופיות H & E בהשוואה לשקופיות H & E של SAOS2.
על אף אתר חוץ רחמיהם של צמיחה, מצאנו כי תכונות חיוניות ומאפייני immunohistochemical של גידולי סרקומה המקוריים נשמרו ברמ"א. בנוסף את השתלים הסרטניים הפכו revascularized כפי שמעידים על ידי הופעתו של אריתרוציטים חומוס nucleated, את השתלים הסרטניים הופכים הסתננו fibroblasts החומוס ותאים סרטניים מהשתל חדר את רקמת מארח רמ"א, הממחיש את האמינות וRobustness של assay רמ"א (איור 6, הבלעה שמאלית תחתון). למידע מפורט נוסף שאנחנו מתייחסים לציוד התקשורת ואח'. 14.
זמן קציר
ספירת תאים של תאי Ki67 חיוביים ושליליים Ki67 מציגה עלייה מתמדת במספר הכולל של תאים מהיום 4 לשני קווים סלולריים. אחרי היום הזה במספר הכולל של תאים נשאר יציב. שבעה ימים לאחר חיסון, מספר התאים Ki67 החיוביים והמספר הכולל של תאים מתחיל לרדת. בנוגע למספר של תאים, קיים קשר מובהק בין שלושת האזורים. עם זאת, שיעור גבוה יותר של תאים Ki67 חיוביים קרובים לרמ"א, ושיעור גבוה יותר של תאי Ki67 שליליים על פני השטח של השלט הם נצפו (איור 4, 3 שורות, 4, 7 ו -8).
המדד של התפשטות נשאר יציב יחסית עד שבעה ימים לאחר חיסון, whereafter זה גם מתחיל לרדת. Proliferatioמדד n של שורת תאי SW1353 הוא נמוך באופן משמעותי (p <0.05) בהשוואה לשורת תאי SAOS2.
למרות שיש קשר מובהק בין שלושת האזורים, זה חיוני לספור שדות בכל שלושת האזורים בשלט ג'ל ECM, כפי שאנו רואים חלק גדול יותר של תאי Ki67 חיוביים קרובים לרמ"א ושיעור גבוה יותר של Ki67 שלילי תאים על פני השטח של השלט (איור 7).
איור 1. סקירה כללית של הפרוטוקול. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 2. תמונות צולמו במהלך מסיק חששות שורה העליונה של קצירת Tumorgraft מכונדרוסרקומה:. = באתרו, B = תצוגה עליונה בצלחת פטרי, C = תצוגה נמוכה יותר בצלחת פטרי. חששות בשורה אמצעיים קצירת של השעיה תא בודד בECM ג'ל: D = באתר = תצוגה עליונה בצלחת פטרי, F = E תצוגה נמוכה. שורה תחתונה G = matrigel שליטה, H = שליטת תא פתרון, אני = תצוגה תחתונה מציגה כלים ודימום הסתעפות. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. תמונה של ה-GFP SAOS2 
איור 4. נתון זה מראה תמונות של שניהם SAOS2 (4 שורות העליונות) וSW1353 (תחתונה 4 שורות) ביום 1 עד 8 לאחר חיסון. השורה 1 (שורת 2 מ"מ בקנה מידה) מציגה את התמונות של CAM באתר באמצעות stereomicroscope עם GFP מסנן. השורה 2 (מ"מ בקנה מידה בר 2) מציגה את אותן דגימות באמצעות stereomicroscope תוך מוארת על ידי נוריות מלמעלה. שורת 3 ו -4 להראות H & E (3 רציפות, סרגל קנה מידה 200 מיקרומטר) וKi67 מוכתם (שורת 4, סרגל קנה מידה 200 או 500 מיקרומטר) תמונות היסטולוגית מדגימות אותו. השורה 5 (מ"מ בקנה מידה בר 2) מציגה את התמונות של CAM באתר דרך stereomicroscope עם DSR מסנן. שורת 6 (יםקייל הבר 2 מ"מ) מציג את אותן דגימות באמצעות stereomicroscope תוך מוארת על ידי נוריות מלמעלה. שורת 7 ו -8 להראות H & E (שורת 7, סרגל קנה מידה 200 מיקרומטר) וKi67 מוכתם (השורה 8, סרגל קנה מידה 200 ו 500 מיקרומטר) תמונות היסטולוגית מהדגימות אותו. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה. 
איור 5. השוואה של התפשטות תאי גידול של SAOS2 וSW1353. צמיחה של SAOS2 = B = צמיחה של SW1353. 
איור 6. ניתן לצפות אריתרוציטים חומוס nucleated בנימים לאורך Tumorgraft liposarcoma ציון גבוה (הוא, 100X), שיבוץ נמוךעזב. 
איור 7. גרף מראה Ki67 + וKi67-תאים לאורך זמן בהתאם למרחק מCAM עבור שתי שורות התאים. אזור = נגד רמ"א, אזור C = פני השטח של השלט, אזור B = שבין אזור A ו-C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זמן של חיסון וקציר
תזמון היום של חיסון בוצע באמצעות SAOS2 בECM ג'ל (36 מצלמות) ונע בין יום התפתחות העוברי 5 ו -10.
לפני הדגירה יום 9, CAM לא באופן עקבי היה גדול מספיק כדי לתמוך ג'ל ECM אנחנו מוחלים. בקציר, תאים סרטניים לפעמים היינו צריכים להישלף מCAM העמוק יותר, וכמה דוגמאות ג'ל ECM שכבו רופפת בחלבון או ברמ"א. בימי 5 ו -6, היה קשה להימנע מלהכניס את התאים הסרטניים בעובר האפרוח, וכתוצאה ממומי חומוס או מוות. מהיום 9, רמ"א כיסה לחלוטין את פני השטח מתחת לחלון ברוב הביצים, ולוחות ג'ל ECM הוכיחו חסיד לרמ"א ברגע של קציר. לכן, מצאנו זמן האידיאלי לחיסון להיות יום 9 של התפתחות עוברית.
לקביעת הזמן האידיאלי של קצירת, וSAOS2 SW1353 נקצרו לאחר respectivelY 1, 2 (SAOS2-GFP בלבד), 4, 5, 6, 7 ו -8 ימים לאחר חיסון, או בין יום התפתחות עוברי 10 ו -17. בעקבות שינויים אלה, הבדל באורך של יישום ברמ"א צוין 1-12 ימים.
Knighton פורסם הבדלים ניכרים בצמיחת גידול וגידול revascularization לפי יום ההתפתחות העוברי ברגע של יישום לדוגמא גידול 17. תא ספירה של תאי Ki67 חיוביים ושליליים Ki67 הראה עלייה מתמדת במספר הכולל של תאים מהיום 4 לשני קווים סלולריים. זו שתואמת את הממצא של Ausprunk et al. בן 21, שקבעו כי התקופה הדרושה לrevascularisation לוקחת 72 שעות. לאחר ספירת מספר התאים ואופן חישובו של המדד של שגשוג, אנו יכולים להניח כי התאים הפזורים בג'ל ECM באופן פעיל הם מתרבים מיום 4 עד 6 ימים לאחר חיסון. בהתבסס על הקוטר של השלט, המספר הכולל של תאים ומדדשגשוג, אנו מציעים שהזמן האידיאלי לקציר הוא יום 16 של התפתחות עוברית, או שבעה ימים לאחר חיסון.
מסגרת הזמן הציע חוקרים משאירה חלון של שישה ימים ליישום של סוכנים בעוד התאים מתרבים באופן פעיל, או פעם אחת ביום 4 לאחר חיסון או יומי במהלך כל מסגרת הזמן. לממשל מקומי, המתחם מוחל על פני השטח CAM. מסלול זה הוא אחד נפוץ ביותר, בשל הנגישות לCAM פשוט על ידי פתיחת קליפת הביצה / סרט 22,23 הדבקה. למרות IV הממשל אינו ריאלי, הקושי להכניס מחטים לתוך כלי CAM הוא מגבלה קריטית. מעכבי קינאז מיושמים על בסיס יומי 24; כימותרפיה פעם אחת במהלך הניסוי. אנו משערים כי הוספת מתחם פעם אחת היא מקבילה של הטיפול הקליני עם ציטוטוקסית של סוכני cytostatic, המנוהלים באופן קלאסי כל 3 שבועות, תוך הוספההתרכובת על בסיס יומי תשקף את המנה היומית של מעכבי קינאז בסביבה הקלינית. עם זאת, עלינו לזכור כי ממשל מקומי יציג קינטיקה / חילוף חומרים שונים בהשוואה לפה או IV ממשל בחולים.
משמעות של הטכניקה ויישומים עתידיים אפשריים
שמירה על המורפולוגיה של תאים היא בעלת חשיבות עליונה כאשר תרביות תאים נמצאות בשימוש במודלים פרה. השימוש במטריצות הומוגניות תאיים כגון קולגן סוג I 25 או ECM ג'ל 26 משחזר את סביבת התאים סרטנית, ומאפשרים דפוס גדילה טבעי יותר.
בניגוד למבחני vivo, במבחני חוץ גופית אינו מכיל תאי סטרומה כגון תאי כלי דם angiogenic, הסתננות תאי מערכת חיסון או תאי fibroblastic הסרטן הקשורים הדרושים כדי לשקם את microenvironment tumorigenic 27. כאשר CAM-assay משמש לevaluatיון של tumorgrafts, שתארנו "קונוס פלישה 'טיפוסי מCAM כלפי tumorgrafts, המשקף גיוס של תאי סטרומה מהחומוס ידי Tumorgraft 14.
CAM-assay מספק שילוב של שיקום על ידי מטריקס ECM ג'ל ומתן תאי מארח לכינונה מחדש של microenvironment הסרטני. כרמ"א וTumorgraft / פלאק הוא נגישים, הממשל של תרכובות קל. בדרך זו, CAM-assay פותח אופקים חדשים להערכה קלינית של סוגים נדירים סרטניים כגון סרקומות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש מחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
תאים משורת תאי כונדרוסרקומה SW1353 נמסרו באדיבותו של פרופ 'ד"ר PCW Hogendoorn ופרופ' ד"ר י בובי של אוניברסיטת ליידן, הולנד. אנו מודים לג' וג' Mestach Wagemans לקבלת סיוע טכני מעולה, וג' דה Bruyne לציור המקצועי של הסקירה של הפרוטוקול שלנו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 | |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 | |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 | |
| G418 | Invitrogen | 11811031 | |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 | |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 | |
| PBS | Invitrogen | 20012019 | |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 | |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 | |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 | |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX | |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 | |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII | |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 | |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA | |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 | |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 | |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
References
- Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution. Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).
- Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas. Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).
- Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M.
- Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin. Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).
- Taylor, B. S., Barretina, J., et al. Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).
- Skubitz, K. M., D'Adamo, D. R.
- Nielsen, T. O., West, R. B. Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm. Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).
- Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).
- DeRose, Y. S., Wang, G., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Bertotti, A., Migliardi, G., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Decaudin, D. Primary human tumor xenografted models ('tumorgrafts') for good management of patients with cancer. Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Sys, G., Van Bockstal, M., et al. Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model. Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).
- Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines. Cancer Research. 42, 1826-1837 (1982).
- Deryugina, E., Quigly, J. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).
- Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J. Vis. Exp. (33), e1620 (2009).
- Balke, M., Neumann, A., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Research Notes. 3, 58 (2010).
- Hendrix, A., Maynard, D., et al. Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis. Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).
- Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels. American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).
- Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).
- Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).
- De Wever, O., Hendrix, A., et al. Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices. International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).
- Albini, A., Benelli, R. The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation. Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).
- Hanahan, D., Coussens, L. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
