Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Published: July 17, 2013 doi: 10.3791/50522
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 2, 2
1Department of Orthopaedic Surgery and Traumatology, Ghent University Hospital, 2Department of Radiation Oncology and Experimental Cancer Research, Ghent University, 3Department of Virology, Parasitology, and Immunology, Ghent University, 4Pathlicon

Summary

Abstract

Саркома очень редкая болезнь, которая неоднородна по своей природе, все тормозящие развитие новых методов лечения. У пациентов с саркомой являются идеальными кандидатами для персонализированной медицины после стратификации, объясняя текущую заинтересованность в развитии воспроизводимым и недорогие модели ксенотрансплантации для этого заболевания. Мембрана хорионалантоисной является естественным иммунодефицитных хозяина способны поддерживать привитых тканей и клеток без видоспецифической ограничений. Кроме того, он легко доступен, манипулировать и визуализируют с помощью оптических и флуоресценции стереомикроскопия. Гистологии в дальнейшем позволяет детальный анализ гетеротипические клеточных взаимодействий.

Этот протокол подробно описывает в ово прививки хориоаллантоисную мембраны со свежими саркомы полученных опухолевых тканей, их одноклеточных суспензий, и постоянные и переходные флуоресцентно меченых создана саркомы клеточных линий (Saos-2 и SW1353). Крыса куриных выживанияES являются до 75%. Модель используется для изучения трансплантат (жизнеспособность, Ki67 индекс пролиферации, некроза, инфильтрация) и хост (инфильтрация фибробластов, сосудистый врастание) поведение. Для локализованных прививки одноклеточных суспензий, ECM гель обеспечивает значительные преимущества по сравнению с инертными материалами сдерживания. Ki67 индекс пролиферации связано с расстоянием клеток от поверхности САМ и длительность применения на САМ, последнее определение временных рамок для того терапевтических продуктов.

Introduction

Саркома редкая опухоль соединительной ткани с высокой смертностью из-за терапии 1,2 сопротивление. Прогресс в выживаемости пациентов затрудняется их низкой ежегодной заболеваемости, их широкое разнообразие, а также тот факт, что клетки саркомы, как сообщается, трудно культуры в пробирке 3,4.

Использование культивируемых клеток на доклинической оценки терапии показали, что новый, по-видимому активных молекул в пробирке не всегда отражают результаты в клинических условиях. Кроме того, геном аберраций, выявленных массивов экспрессии генов не всегда коррелирует с опухолью характеристик поведения в отдельных пациента 5-7. Для того, чтобы попытаться решить эти проблемы, персонализированная медицина значение приобретает, которое отражается в увеличении поиск ксенотрансплантатом 8-12 моделей.

В анализе естественных условиях имеет то преимущество, отражающие сложное взаимодействие между сANCER клетками и окружающей средой ткани хозяина в солидных опухолях, необходимые для распространения рака и вторжения 13. В настоящее время изучаются использование Хорье-аллантоисных Мембрана анализа (CAM-анализ), как воспроизводимые модели ксенотрансплантата саркомы 14,15. Этот тест широко используется для изучения опухолевого ангиогенеза 16,17. В литературе, однако, мы нашли различные протоколы для этого анализа, в то время как другие исследования наблюдалось заметное различие в росте или ангиогенез в соответствии с различными протоколами 18,19.

В этой статье мы исследуем влияние изменения условий CAM-анализа на поведение клеток опухоли использованием трансплантаты, полученные из опухоли одноклеточных суспензий и сложившейся культуры клеток саркомы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

См. рисунок 1 для обзора

Опухоль материала

1. Получение и подготовка образцов опухолей

Для использования материала пациента, утверждение этического комитета необходимо, и осознанное согласие должно быть получено от пациента.

  1. Урожай репрезентативном материале (минимум 1 см 3) во время вмешательства, либо биопсии или резекции саркомы. Надлежащее место биопсии определяется с помощью динамической контрастности МРТ.
  2. Поместите материал непосредственно в стерильную пробирку, содержащую DMEM дополнена 1000 U пенициллина и 1 мг / мл стрептомицина.
  3. Транспорт флакона немедленно (30 - 90 мин) в лабораторию.

Все Следующие процедуры выполняются под ламинарного потока.

  1. Залить содержимое флакона в стерильную чашку Петри.
  2. Поместите образца опухоли на мелкие части максимально 1 м.м 3 с использованием стерильным скальпелем. Удалить все кальцинированные частей, поскольку они имеют тенденцию ухудшать дальнейшей обработки ткани.
  3. Случайно занять 10 опухоли трансплантатов для применения на CAM.

2. Подготовка из опухоли одноклеточных суспензий

Приблизительная продолжительность: 3 часа

  1. Взвесить оставшиеся ткани образца.
  2. Поместите 2 - 4 г ткани в диссоциатора трубки, более чем одна трубка может потребоваться переваривать все оставшиеся ткани опухоли.
  3. Для переваривания 2 - 4 г ткани, добавляют 2,5 мл коллагеназы два решения (500 Ед / мл RPMI 1640) и 2,5 мл ДНКазы раствор (22 KU / мл RPMI 1640).
  4. Обработайте ткань в соответствии с протоколом h_tumor диссоциаторе. Это включает в себя два цикла инкубации при 37 ° C в CO 2-инкубаторе при трубки осторожно встряхивали в течение 30 мин.
  5. Фильтр оставшейся суспензии через 150 мкм ячейки фильтра.
  6. Центрифуга лизата на 1000 оборотов в минуту в течение 5 мильN.
  7. Удалить супернатант.
  8. Ресуспендируют осадок в 10 мл буфера для лизиса эритроцитов (УЛК), позволяющие 10 мин инкубации с регулярными подвески.

Примечание: буфера для лизиса эритроцитов изготавливают следующим образом: Добавить 0,037 г ЭДТК, 0,99 г K 2 HPO 4, 8,29 г NH 4 Cl до 1000 мл вода, использовать 10 N NaOH для доведения рН до 7,3, фильтр под давлением через 0,22 мкм процедить. Хранить при температуре 4 ° C.

  1. Добавить 25 мл культуральной среды (DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина), чтобы остановить реакцию.
  2. Центрифуга суспензии при 1000 оборотах в минуту в течение 5 мин. Цвет гранул должен быть белым теперь.
  3. Удалить супернатант.
  4. Добавляют 5 мл среды к осадку. Суспензию фильтруют через сито ячейка 70 мкм.
  5. Подсчет количества живых клеток / мл с помощью автоматического счетчика клеток.

3. CANCER клеточных линий

SAOS2 остеосаркома клетки (АТСС номер: HTB-85) с улучшенными зеленый флуоресцентный белок подвергали электропорации по peGFP-C1 вектора с использованием клеточной линии Nucleofector Kit V в соответствии с протоколом производителя. Чтобы установить стабильные клеточные линии, трансфицированные клетки отбирали в G418 (1 мг / мл) в течение 4 недель в соответствии с ранее установленным протоколом 20. Кроме того сортировки была выполнена с активацией флуоресценции сортировки клеток (FACS) в соответствии с инструкциями производителя.

Клетки SW1353 хондросаркомой линии клеток (АТСС номер: HTB-94), либо свежеприготовленным опухоли одноклеточных суспензий помечены использованием красного флуоресцентного липофильные мембраны пятно.

  1. Удалить клеток от культуральной колбе в классическом способом с использованием трипсина (0,5% вес / объем) этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA, 0,2% вес / объем) раствора.
  2. Центрифуга клеточной суспензии в течение 5 мин при 1000 оборотах в минуту.
  3. Снимите supernatant.
  4. Добавить 1 мл бессывороточной среды и 5 мкл DiI (Vybrant Красный) / 10 6 клеток.
  5. Оберните флакона в алюминиевую фольгу и положить его в CO 2 инкубаторе в течение 10 мин при 37 ° С.
  6. Центрифуга снова в течение 5 мин при 1000 оборотах в минуту и ​​удалить супернатант.

Хориоаллантоисную анализа мембраны

1. Инкубация яиц

  1. Оплодотворенные яйца из местных коммерческих инкубатора гарантирует 95% оплодотворения яиц требуется.
  2. Оплодотворенные яйца можно хранить при комнатной температуре до 10 дней.

Примечание: перед началом инкубации, грязи, перья и экскременты тщательно удалены из скорлупы механически путем протирки сухой с бумажными полотенцами, которые имеют грубую а не мягкую структуру поверхности. Очистка яйца с 70% денатурированный этанол или любой другой реагент очистки значительно снижает выживаемость эмбрионов кур.

  1. Положите яйца в incubАТОР, с одной стороны, маркировка верхней поверхности. День, в который яйца помещаются в инкубатор назначенный день 0 эмбрионального развития.
  2. Установка температуры инкубации при температуре 37,8 ° С и влажности 47%. Убедитесь, что опция автоматического вращения выключен.

2. Открывающиеся части яйца

Продолжительность: ± 60 мин для 25 яиц

На 3-й день развития, яйца открыт под ламинарный воздушный поток. Открытие яйца на дальнейшее развитие результатов этапа к повреждению CAM, как мембрана имеет тенденцию прилипать к оболочке. Инфракрасная лампа используется для держать яйца теплой во время процедуры. Для улучшения бесплодие, мы рекомендуем использовать перчатки руки.

  1. Положите яйцо в Eggcup, с отмеченными стороной вверх.
  2. Нижний уровень CAM путем удаления двух мл белка через 18 G иглу на конце яйца. Если игла тупая после перфорации несколькояичная скорлупа, замените иглу. Если нет, слишком много сил должно быть оказано, что приводит к повреждению яичный желток или разрушения оболочки. Иногда игла заблокирован chalazae, один из 2 ленту по спирали приостановлении желток в белке. Эту проблему можно решить, осторожно нажимая на поршень вниз, пока блок не будет устранена. Если яичный желток всасывается в шприц, замены иглы, а также шприца. Иногда эмбрион умирает после этого события. Если недостаточное количество белка удаляется, CAM будет повреждена, когда оболочка удалена.
  3. Применение полупроницаемой клейкой пленки в отмеченных верхней стороне корпуса для того, чтобы предотвратить разбрызгивание частицы оболочки на САМ во время резки окна.
  4. Сделать впускных отверстий с небольшим шило на поверхности яйца.
  5. Вырезать окно 1 см 2 в корпусе, с использованием пары стерильных острыми хирургическими ножницами.
  6. Пульсирующее сердце эмбриона и прилегающих сосудов может наблюдаться при йэлектронной поверхность яичным желтком. Снимите неоплодотворенных яиц или мертвых эмбрионов. Прерванный аспект кровеносных сосудов характеризует мертвых эмбрионов.
  7. Закройте окно с полупроницаемую клейкая пленка. Это не обязательно, чтобы покрыть места прокола, если цистерна не дал трещину во время введения иглы.

3. Прививка процедуры

Продолжительность: ± 1 час на клеточной линии

На куриного эмбрионального развития 9-й день, яйца засевают под ламинарный воздушный поток.

Оценка раковых клеток распространяется по всей CAM требует локализации клеток в ограниченной поверхности в процессе модифицирования. Матригель является внеклеточным матриксом (ECM) гель с Engelbreth-Холма-рой мышиной саркомы часто используется в экспериментальных условиях культивирования клеток. Это жидкость при охлаждении, но будет проходить термически активированного полимеризации при доведен до 20 - 40 ° C, образуя устойчивый гель. Во времяЭксперименты, Матригель хранится в коробке, содержащей таяния льда.

Примечание: Мы настаиваем на том, чтобы не использовать перфорированные покровные. Мы наблюдали прикрепления и роста трансплантированных клеток рака на пластиковый диск таким образом смещение потенциала роста клеток на самой мембраны.

  1. Ресуспендируют осадок клеток в охлажденный гель ECM при концентрации 10 6 клеток/100 мкл гель ECM. Имейте это решение на тающем льду.
  2. Акцизной части полупроницаемую мембрану с парой стерильные хирургические под ламинарным потоком воздуха. Если клей пленка удаляется полностью, это приведет к большей доли эмбриональной смерти из-за загрязнения.
  3. Прикоснитесь к CAM прямо под окна оболочки слегка стерильной стеклянной палочкой, чтобы удалить слой эпителиальных клеток. Прикосновение к CAM стерильную стеклянную палочку, оказывается, менее травматично, чем с помощью скальпеля № 11, которая требует больше удобство и опыта. Мелкие кровоизлияния могут произойти.
  4. dding опухоли материала.
  5. Для опухолевых трансплантатов: осторожно нижнюю часть ткани на САМ с парой стерильным пинцетом, не сжимая его.
  6. Для процедуры гель ECM: Добавить 4x 25 мкл клеточной-ECM суспензия геля на CAM, в верхней части друг с другом, позволяя гель ECM для полимеризации между приложениями. Таким образом, прилипшие налета содержащие раковые клетки создан.
  7. Закройте окно оболочки снова полупроницаемую клейкая пленка.

4. Изображениями и уборки CAM

Продолжительность: 2 часа на 25 яиц

На куриного эмбрионального развития 16-й день САМ собирают. Работая под ламинарным потоком воздуха не требуется.

  1. Увеличить окна с парой хирургическими ножницами. Убедитесь в том, чтобы не порезать слишком низко, иначе CAM будет повреждена, в результате чего кровотечение из поврежденных кровеносных.
  2. Добавить 300 - 500 мкл PBS D с помощью пипетки на секту CAMион содержащий привитый материал. Если ни флуоресцентных зондов не используются, буферном растворе формальдегида могут быть использованы как это делает мембраны жесткой, что облегчает резку мембраны.
  3. Сделайте фотографию CAM в яйце через стерео флуоресцентный микроскоп, оснащенный цифровой камерой цвета, используя как GFP или DSR фильтр, а фильтр. Для опухолевых трансплантатов, все фотографии сделаны без фильтров. Освещение сверху светодиод настоятельно рекомендуется во время фотографирования (рис. 2).
  4. Запись опухолевых клеток миграции меченых клеток. Границы опухоли могут быть нерегулярными и изношен. Переменная клетки могут присутствовать вблизи границы опухоли. В некоторых образцах, рядами опухолевых клеток может наблюдаться (рис. 3).
  5. Cut мембраны с парой стерильными ножницами на границе лежащей против оболочки.
  6. Поместите собраны CAM в стерильную чашку Петри с PBS, D или буфер дляформальдегид.
  7. Сделать фотографией и верхнюю сторону и нижнюю сторону CAM, так и без фильтра.
  8. Поместите мембраны в маркированный контейнер с буферном растворе формальдегида в течение по крайней мере 72 часов.
  9. Вставить камеры в парафин и подготовить их для гистологического исследования. Позаботьтесь, чтобы вырезать трансплантаты опухоли в центре узелков, убедившись, что поверхность разреза параллельна нижней части кассеты. Если нет, то взаимодействие между CAM и опухоль трансплантат не будут видны. То же самое относится и к стратегии бляшек ECM гель: поверхности, обращенной к режущим лезвием должна быть перпендикулярна бляшки.

5. Гистологическое исследование

Гематоксилин-эозином и Ki-67 иммуногистохимию проводились для дальнейшего уточнения, если это необходимо. Иммуногистохимия проводили на фиксированных формалином парафин срезах тканей 3,5 мкм в толщину, с использованием автоматического слайд ситечко в соответствиис инструкциями производителя. Мышь первичный моноклональные антитела к Ki-67 (клон MIB-1, разбавление 1/100) был использован. Тепло-индуцированный Эпитоп поиск проводился с помощью мобильного кондиционирования 1 и визуализация была достигнута с Универсальный комплект обнаружения DAB, в соответствии с инструкциями производителя. Обезвоживание в срезах тканей проводили с использованием автоматизированной Coverslipper.

Для SAOS2 и SW1353 клеточных линий, количество Ki67-положительных и Ki67-отрицательные клетки nuclei/100 мкм 2 подсчитывали в три зоны: один близко к границе CAM, одна закрыть поверхность и один в центре доска ECM геля. Эту процедуру повторяли 6 раз для каждого Ki-67 окрашенный препарат. Индекс пролиферации определяли для каждого слайда путем деления количества Ki67-позитивных клеток на общее число подсчитанных клеток.

Некроза определяется потерей тонкой дисперсии хроматина в ядре клетки, сопровождается Фадинг различных полей ячейки. Для ксенотрансплантатов, некроз оценивается как полные, частичные (часто на поверхности), или отсутствует. Проникновение опухолевых клеток в CAM определяется наблюдение опухолевых клеток в мезодерме CAM, и оценивается как присутствовать или отсутствовать.

Три пункта забил за хозяином поведение. Фибробластов инфильтрации определяется как удлиненные клетки оставляя CAM и вторжение опухолевых трансплантата / доска, и забил как присутствовать или отсутствовать. Сосудистые врастание может наблюдаться как врастание пролиферирующих цыпленок сосудов, характеризуется наличием ядерных эритроцитов цыпленка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Оценка CAM

Опухоль трансплантатов стать приверженцем CAM (рис. 2А). Одноклеточных суспензий от пациента материала часто отображают сушеные, слегка приподнятые бляшки (рис. 2D). После удаления CAM, отмечены складок мембраны происходит (рис. 2E и 2F).

Для коммерческих клеточных линий налета становится более непрозрачной во времени, что указывает на пролиферацию клеток. Различные клеточные линии в ECM гель имеют различные модели роста на САМ. SAOS2 образует распространение зубного налета, с отчетливым увеличением поверхности 7-й день после посева, а сигнал GFP остается сильным, указывающий жизнеспособных клеток. Миграция SAOS2 клетки могут быть визуализированы параллельно сосудов CAM (рис. 3). При наблюдении через стереомикроскоп, кровеносные сосуды можно увидеть, когда ни один фильтр не используется. Опухолевые клетки не могут быть обнаружены при отсутствии FILTER используется. Это не позволяет визуализировать кровеносные сосуды, когда GFP фильтр вставлена. При повороте фильтра и выключается, тесный контакт между мигрирующих клеток и кровеносных сосудов могут быть видны. Точечные кровотечения можно наблюдать через доску (рис. 4, строки 1 и 2). Бляшек содержащие клетки SW1353 показывают уменьшение поверхности и, как правило, контракт CAM, в результате чего мембрана морщинистой после уборки его (Рисунок 4, строки 5 и 6). Сигнал DSR уменьшается флуоресцентного зонда становится разбавляют после многих клеточных делений. 7-й день, кровотечение часто наблюдается. Если кровотечение происходит, сигнал DSR также уменьшается.

Сосудистые реакции могут быть визуализированы после удаления CAM в нижней зрения, показывающий извилистый сосудов, окружающих трансплантат или бляшки (рис. 2). Сосудистая реакция CAM наблюдается в Tumorgraft группы, одна группа суспензии клеток (<сильная> фиг.2С и 2F) и ECM гель контрольной группе (рис. 2G), но не в клеточных групп контрольного раствора (рис. 2H). Новый извилистый суда можно наблюдать, входя в образец, ветвящиеся (рис. 2I, наконечники стрел) и анастомоз (рис. 2I, звездочки) друг с другом, также небольшие участки кровотечения происходят (рис. 2I, стрелки). Неоваскуляризации опухоли может быть определена количественно на H & E слайдов в различных зонах опухоль / опухоль бляшки.

Гистологические данные показывают, что SAOS2 клетки поддерживать один вид клетки в течение полного объема ECM гель, что приводит к увеличенной толщины и диаметра бляшки. Они проникают в слой мезодерма, из CAM (5А, стрелка), тем самым увеличение расстояния между энтодермальных и эктодермальный слоев CAM, как раскрытия молнии (5А (фиг. 5В, стрелка). Число клеток и клеточных кластеров неуклонно возрастать во времени, и количество не пролиферирующих клеток увеличивается от 7 день, особенно на поверхности зубного налета. Для SW1353, сокращение CAM также может быть оценена на H & E слайды по сравнению с H & E слайды SAOS2.

Несмотря на их месте внематочной роста, мы обнаружили, что существенные признаки и иммуногистохимических характеристик исходного опухолей саркомы выдерживали в САМ. Кроме того, опухолевые трансплантаты стать реваскуляризированных о чем свидетельствует появление ядерных эритроцитов цыпленок, опухоль трансплантатов становятся проникли куриных фибробластов и опухолевых клеток трансплантата проникли в CAM ткани хозяина, иллюстрирующие надежность и Robustness из анализа CAM (рис. 6, вставка внизу слева). Для получения более подробной информации мы ссылаемся на Sys и соавт. 14.

Время сбора урожая

Сотовые подсчета Ki67-положительных и Ki67-негативные клетки показывает устойчивое увеличение общего числа клеток с 4-й день для обеих клеточных линий. После этого день общее количество клеток остается стабильным. Через семь дней после инокуляции количество Ki67-позитивных клеток, а общее число клеток начинает снижаться. Что касается количества клеток, существует значительная корреляция между тремя зонами. Однако большая доля Ki67-позитивных клеток близко к CAM, и большая доля Ki67-отрицательных клеток на поверхности бляшки наблюдаются (рис. 4, строки 3, 4, 7 и 8).

Индекс распространения остается относительно стабильным и до семи дней после прививки, после чего он также начинает снижаться. Proliferatioн индекс SW1353 клеточной линии значительно ниже (р <0,05) по сравнению с SAOS2 клеточной линии.

Хотя существует значительной корреляции между тремя зонами, необходимо рассчитывать поля во всех трех регионах в бляшке гель ECM, как мы наблюдаем большую долю Ki67-позитивных клеток близко к CAM и большую долю Ki67-отрицательных Клетки на поверхности бляшки (рис. 7).

Рисунок 1
Рисунок 1. Обзор протокола. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2 Рисунок 2. Фотографии, сделанные во время сбора урожая Верхняя строка проблемы уборки Tumorgraft от хондросаркомой:. = На месте, B = вид сверху в чашку Петри, C = вид снизу в чашку Петри. Ближний проблемы строка заготовка суспензии отдельных клеток в ECM гель: D = на месте, E = вид сверху в чашку Петри, F = вид снизу. Нижний ряд G = матригель контроль, H = ячейка решение для управления, я = нижняя отображающее ветвления сосудов и кровотечения. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 3
Рисунок 3. GFP фотографию SAOS2

Рисунок 4
Рисунок 4. На этом рисунке показаны фотографии обоих SAOS2 (верхние 4 ряда) и SW1353 (нижние 4 ряда) в день от 1 до 8 после прививки. Ряд 1 (масштаб 2 мм) показывает фотографии CAM на месте через стереомикроскоп GFP с фильтром. Ряд 2 (масштаб 2 мм) показывает те же образцы через стереомикроскоп при освещении светодиодами сверху. Ряд 3 и 4 показывают H & E (ряд 3, масштабной линейки 200 мкм) и Ki67 окрашенных (ряд 4, масштабной линейки 200 или 500 мкм) гистологические изображения из тех же образцов. ряд 5 (масштаб 2 мм) показаны фотографии САМ на месте с помощью стереомикроскопа с DSR фильтра. Ряд 6 (овКейл бар 2 мм) показывает те же образцы через стереомикроскоп при освещении светодиодами сверху. Ряд 7 и 8 показаны H & E (строка 7, масштабной линейки 200 мкм) и Ki67 окрашенных (строка 8, масштабной линейки 200 и 500 мкм) гистологических изображений из тех же образцов. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.

Рисунок 5
Рисунок 5. Сравнение пролиферации опухолевых клеток из SAOS2 и SW1353. Рост из SAOS2 = B = рост SW1353.

Рисунок 6
Рисунок 6. Ядросодержащих эритроцитов куриного можно наблюдать в капиллярах всей высокой Tumorgraft липосаркома класса (HE, 100X), вставка нижнегоосталось.

Рисунок 7
Рисунок 7. График, показывающий Ki67 + и Ki67-клеток в течение времени в соответствии с расстоянием от CAM для обеих клеточных линий. Зона = отношению к САМ, зона С = поверхности зубного налета, зона B = в зоне между А и С.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Время посева и сбора урожая

Выбор времени в день прививки проводили с использованием SAOS2 в ECM гель (36 CAM) и варьировались от день эмбрионального развития 5 и 10.

До дня инкубационного 9, кулачок не был последовательно умещаются гель ECM мы применили. В период сбора урожая, опухолевые клетки иногда должны быть извлечены из глубоких CAM, и некоторые образцы ECM гель лежали свободно в белке или на САМ. В те дни, 5 и 6, было трудно, чтобы не подвергать опухолевых клеток на куриных эмбрионах, в результате пороков развития куриного или смерти. Из 9-й день, CAM полностью покрывающие поверхность под окном в большинстве яйца, и ECM гель бляшек оказалось прилегает к CAM в момент сбора урожая. Таким образом, мы обнаружили, что идеальное время для прививки, чтобы быть 9-й день эмбрионального развития.

Для определения идеальное время сбора урожая, и SAOS2 SW1353 собирали после respectivel1 г, 2 (SAOS2-GFP только), 4, 5, 6, 7 и 8 дней после инокуляции или между день эмбрионального развития 10 и 17. В соответствии с этими изменениями, разница в длине применения на САМ было отмечено с 1 - 12 дней.

Найтона опубликованной заметных различий в росте опухоли и опухолевой реваскуляризации в соответствии с день эмбрионального развития в момент опухоль пример приложения 17. Сотовые подсчета Ki67-положительных и Ki67-негативные клетки показали устойчивое увеличение общего числа клеток с 4-й день для обеих клеточных линий. Это созвучно с выводом Ausprunk соавт. 21, который заявил, что на период, необходимый для реваскуляризации занимает 72 часа. После подсчета количества клеток и расчет индекса пролиферации, мы можем предположить, что клетки диспергированных в геле ECM не активно пролиферирующих со дня 4 до 6-й день после заражения. На основе диаметра бляшки, общее число клеток, а индекспролиферацию, мы предполагаем, что идеальное время для жатвы 16 день эмбрионального развития, или семь дней после заражения.

Указанные сроки оставляет исследователи окно шесть дней по применению средства, поскольку клетки активно пролиферирующие, либо один раз на 4-й день после посева или ежедневно в течение всего периода времени. Для местного введения соединение наносят на поверхность САМ. Этот маршрут является наиболее широко используемым, в связи с доступностью к CAM, просто открыв яичной скорлупы / клейкая пленка 22,23. Хотя IV всегда можно использовать, трудность вставить иглы в сосуды CAM является важным ограничением. Ингибиторы киназы применяются на ежедневной основе 24; химиотерапии один раз в течение эксперимента. Мы предполагаем, что добавления соединения один раз является эквивалентом клиническое лечение с цитотоксическими цитостатических агентов, которые классически вводят один раз каждые 3 недели, при добавлениисоединение на ежедневной основе будет отражать суточную дозу ингибиторов киназы в клинических условиях. Тем не менее, мы должны иметь в виду, что местное применение будет показывать различные кинетики / метаболизм по сравнению с устным или внутривенного введения у пациентов.

Значение техники и возможных будущих приложений

Сохранение морфологии клеток имеет первостепенное значение, когда клеточные культуры используются в доклинических моделях. Использование гомогенных внеклеточной матрицы, такие как коллаген типа I 25 или ECM гель 26 восстанавливает клетки опухоли среды, позволяя более естественный характер роста.

Вопреки в естественных условиях анализов в пробирке анализов не содержит стромальные клетки, такие как ангиогенных сосудистых клеток, проникают иммунные клетки или связанных с раком фибробластов необходимое для восстановления онкогенными микросреды 27. Когда CAM-анализ используют для evaluatион tumorgrafts, мы описали типичный вторжения конуса ходьбы от CAM к tumorgrafts, отражающий набор стромальных клеток из куриных по Tumorgraft 14.

CAM-анализа представляет собой сочетание восстановления внеклеточного матрикса ЕСМ гель и предоставление клетки-хозяева для воссоздания онкогенными микросреды. Как кулачком и Tumorgraft / налета были легко доступны, введение соединений легко. Таким образом, CAM-анализ открывает новые перспективы на доклинической оценки редких типов опухолей, таких как саркомы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgments

Клетки из клеточной линии SW1353 хондросаркомой были любезно предоставлены проф PCW Hogendoorn и профессор доктор Дж. Бови Лейденского университета, Нидерланды. Мы благодарим J. Mestach и Г. Wagemans за отличную техническую помощь и Г. Де Брюйне для профессионального рисунок обзор нашего протокола.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Line Nucleofector Kit V Amaxa VCA-1003
collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) Sigma Aldrich C6885
DMEM Invitrogen 41965-039
DMSO Sigma D8418
Dnase solution Sigma Aldrich DN25
G418 Invitrogen 11811031
Matrigel Sigma-Aldrich E1270
mouse primary monoclonal antibody Ki67 Dako Denmark MIB-1
Paraformaldehyde Fluka D76240
PBS Invitrogen 20012019
PBSD Invitrogen 14040083
peGFP-C1 vector Clontech 632470
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140163
RPMI Invitrogen 22409-015
Trypsin-EDTA solution Invitrogen 25300054
Vybrant cell-labeling DiI Lifetechnologies 22885
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10227
digital color camera Leica DFC 340 FX
Digital Egg Incubator Auto Elex Co R-COM 50
FACS BD Biosciences FACSAriaIII
Gentlemacs C-Tube Miltenyi Biotech 130-093-237
Gentlemacs Dissociator Miltenyi Biotech 130-093-235
Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol Miltenyi Biotech
Name Company Catalog Number Comments
semipermeable adhesive film (Suprasorb F) Lohmann&Rauscher 20468
stereo fluorescence microscope Leica M205 FA
Tissue-Tek Film automated Coverslipper Sakura 6400
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana Medical Systems Inc 760-500
Ventana Automated Slide Stainer Ventana Medical Systems Benchmark XT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution. Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).
  2. Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas. Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).
  3. Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M. Cancer statistics, 2001. CA A Cancer Journal for Clinicians. 51, 15-36 (2001).
  4. Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin. Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).
  5. Taylor, B. S., Barretina, J., et al. Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).
  6. Skubitz, K. M., D'Adamo, D. R. Sarcoma. Mayo Clinic Proceedings. 82, 1409-1432 (2007).
  7. Nielsen, T. O., West, R. B. Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm. Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).
  8. Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).
  9. DeRose, Y. S., Wang, G., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
  10. Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
  11. Bertotti, A., Migliardi, G., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
  12. Decaudin, D. Primary human tumor xenografted models ('tumorgrafts') for good management of patients with cancer. Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).
  13. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  14. Sys, G., Van Bockstal, M., et al. Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model. Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).
  15. Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines. Cancer Research. 42, 1826-1837 (1982).
  16. Deryugina, E., Quigly, J. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).
  17. Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).
  18. Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J. Vis. Exp. (33), e1620 (2009).
  19. Balke, M., Neumann, A., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Research Notes. 3, 58 (2010).
  20. Hendrix, A., Maynard, D., et al. Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis. Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).
  21. Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels. American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).
  22. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).
  23. Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).
  24. Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).
  25. De Wever, O., Hendrix, A., et al. Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices. International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).
  26. Albini, A., Benelli, R. The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation. Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).
  27. Hanahan, D., Coussens, L. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
<em&gt; В ово</em&gt; CAM-анализа, как Xenograftmodel саркомы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sys, G. M. L., Lapeire, L., Stevens, … More

Sys, G. M. L., Lapeire, L., Stevens, N., Favoreel, H., Forsyth, R., Bracke, M., De Wever, O. The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522, doi:10.3791/50522 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter