Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Den Published: July 17, 2013 doi: 10.3791/50522
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 2, 2
1Department of Orthopaedic Surgery and Traumatology, Ghent University Hospital, 2Department of Radiation Oncology and Experimental Cancer Research, Ghent University, 3Department of Virology, Parasitology, and Immunology, Ghent University, 4Pathlicon

Summary

Den

Abstract

Sarkom er en meget sjælden sygdom, der er heterogent i naturen, alle hæmmer udviklingen af ​​nye behandlingsformer. Sarkom patienter er ideelle kandidater til skræddersyet medicin efter lagdeling, forklarer den nuværende interesse i at udvikle en reproducerbar og low-cost xenotransplantat model for denne sygdom. Den kyllingechorioallantoinmembranen membranen er en naturlig immundefekt vært stand til at opretholde podede væv og celler uden artsspecifikke restriktioner. Desuden er det let adgang, manipuleres og afbildes ved hjælp af optiske og fluorescens stereomikroskopserien. Histologi tillader endvidere detaljeret analyse af heterotypic cellulære interaktioner.

Denne protokol beskriver detaljeret in ovo podning af fosterhinder med friske sarkom-afledte tumorvæv, deres encellede suspensioner og permanente og forbigående fluorescensmærkede etablerede sarkom cellelinjer (Saos-2 og SW1353). Chick overlevelse rottees er op til 75%. Modellen anvendes til at studere graft-(rentabilitet, Ki67 proliferationsindeks, nekrose, infiltration) og vært (fibroblast infiltration, vaskulær indvækst) adfærd. For lokaliseret podning af encellede suspensioner, giver ECM gel betydelige fordele i forhold inaktive indeslutning materialer. Den Ki67 proliferationsindeks er relateret til afstanden af ​​cellerne fra overfladen af ​​modulet og varigheden af ​​anvendelsen på CAM'en, sidstnævnte bestemmelse en tidsramme for tilsætning af terapeutiske produkter.

Introduction

Sarkom er en sjælden tumor i bindevæv med en høj dødelighed som følge af behandling modstand 1,2. Fremskridt i patientens overlevelse er hæmmet af deres lave årlige incidens, deres brede mangfoldighed, og det faktum at sarcomaceller rapporteres at være svært at kultur in vitro 3,4.

Brugen af dyrkede celler til præklinisk terapi evaluering har vist, at nye, tilsyneladende aktive molekyler in vitro ikke altid afspejler resultater i kliniske omgivelser. Endvidere genom aberrationer afsløret af genekspression arrays er ikke altid korreleret til tumor adfærd karakteristika i den enkelte patient 5-7. For at forsøge at løse disse problemer har skræddersyet medicin fået større betydning, hvilket afspejles i den øgede søgning efter xenograftmodeller 8-12.

Et in vivo-assay har den fordel afspejler komplekse samspil mellem Cancer celler og værtens væv miljø i solide tumorer, der er nødvendige for kræft spredning og invasion 13.. I øjeblikket vi undersøge anvendelsen af Chorio-allantoiske Membran assay (CAM-assay) som en reproducerbar xenograft model for sarkom 14,15. Dette assay er almindeligt anvendt til undersøgelse af tumorangiogenese 16,17. I litteraturen har vi imidlertid fundet forskellige protokoller for dette assay, mens andre studier observeret en markant forskel i vækst eller angiogenese i henhold til forskellige protokoller 18,19.

I denne artikel vil vi undersøge effekten af ​​varierende betingelser for CAM-analysen på celle adfærd ved hjælp af tumor transplantater, tumorafledte encellede suspensioner og etablerede sarkom cellekulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Se figur 1 for en oversigt.

Tumormateriale

1.. Indhentning og forberedelse tumorprøver

Til brug for patientens materiale, er godkendelse af Etisk Udvalg er nødvendigt, og informeret samtykke skal indhentes fra patienten.

  1. Høst repræsentativt materiale (minimum 1 cm3) ved indgreb, enten en biopsi eller en resektion af en sarkom. Den korrekte site af biopsi er defineret ved hjælp dynamisk kontrast MRI.
  2. Anbring materialet straks i en steril hætteglas indeholdende DMEM suppleret med 1.000 U penicillin og 1 mg / ml streptomycin.
  3. Transportere hætteglasset umiddelbart (30 - 90 min) til laboratoriet.

Alle følgende procedurer udføres under laminar strømning.

  1. Hæld indholdet af hætteglasset i en steril petriskål.
  2. Sæt tumorprøven i små dele af maksimalt 1mm 3 ved hjælp af en steril skalpel. Fjern alle forkalkede dele som de har tendens til at forringe yderligere behandling af vævet.
  3. Tilfældigt tage 10 tumor transplantater til applikation på CAM.

2.. Fremstilling af tumorafledte Single cellesuspensioner

Omtrentlige varighed: 3 timer

  1. Vej den resterende væv af prøven.
  2. Put 2 - 4 g væv i en dissociator rør, mere end et rør kan være nødvendigt at fordøje alle de resterende tumorvæv.
  3. For fordøjelsen af ​​2 - 4 g væv tilsættes 2,5 ml kollagenase 2 opløsning (500 U / ml RPMI 1640) og 2,5 ml DNase-opløsning (22 KU / ml RPMI 1640).
  4. Behandl væv ifølge dissociator h_tumor protokollen. Dette indebærer 2 cykler af inkubation ved 37 ° C i CO2-inkubator mens røret rystes forsigtigt i 30 minutter.
  5. Filtrere den resterende suspensionen gennem en 150 um cellefilter.
  6. Centrifuger lysatet ved 1.000 rpm i 5 mi.
  7. Fjern supernatanten.
  8. Pellet resuspenderes i 10 ml erytrocyt lysisbuffer (ELB), så 10 min inkubation med regelmæssig suspension.

Bemærk: erythrocyt lysepuffer fremstilles som følger: Tilsæt 0,037 g EDTA, 0,99 g K 2 HPO 4, 8,29 g NH4Cl til 1.000 ml destilleret, bruge 10 N NaOH for at indstille pH til 7,3, filtreres under tryk gennem et 0,22 um filtrere. Opbevares ved 4 ° C.

  1. Tilsæt 25 ml dyrkningsmedium (DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin) at standse reaktionen.
  2. Centrifugeres suspensionen ved 1.000 rpm i 5 min. Farven af ​​pelleten skulle være hvid nu.
  3. Fjern supernatanten.
  4. Tilsæt 5 ml medium til pelleten. Filtreres suspensionen gennem et 70 um cellefilter.
  5. Tæl antallet af levende celler / ml ved hjælp af en automatisk celle tæller.

3..Cancercellelinier

SAOS2 osteosarcomceller (ATCC nummer: HTB-85) udtrykker forstærket grønt fluorescerende protein blev elektroporeret af pEGFP-C1 vektoren under anvendelse cellelinien Nucleofector Kit V i henhold til producentens protokol. At etablere stabile cellelinier, blev transficerede celler udvalgt i G418 (1 mg / ml) i 4 uger i overensstemmelse med tidligere etableret protokol 20.. Derudover sortering blev udført ved fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) i overensstemmelse med producentens anvisninger.

Celler fra SW1353 chondrosarkom cellelinje (ATCC nummer: HTB-94) eller frisklavet tumor single cellesuspensioner mærket med et rødt fluorescerende lipofil membran pletten.

  1. Fjern celler fra kulturen kolben på en klassisk måde ved hjælp af trypsin (0,5% vægt / volumen) ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA, 0,2% vægt / volumen) opløsning.
  2. Centrifuger cellesuspensionen i 5 minutter ved 1.000 rpm.
  3. Fjern supernatant.
  4. Tilsæt 1 ml serum-frit medium, og 5 pi Dil (Vybrant rød) / 10 6 celler.
  5. Wrap hætteglasset i aluminiumsfolie og sætte det i CO 2 inkubator i 10 min ved 37 ° C.
  6. Der centrifugeres igen i 5 minutter ved 1.000 rpm og supernatanten fjernes.

Chorioallantoiske membran assay

1.. Egg Inkubation

  1. Befrugtede æg fra en lokal kommerciel rugeri garanterer 95% befrugtning af æggene er påkrævet.
  2. Befrugtede æg kan opbevares ved stuetemperatur op til 10 dage.

Bemærk: før inkubering snavs, fjer og ekskrementer omhyggeligt fjernet fra æggeskaller mekanisk ved tør aftørring med papirhåndklæder, som har en ru snarere end en blød overflade struktur. Tørrer æggene med 70% denatureret ethanol eller enhver anden rengøring reagens reducerer overlevelsesraten for kyllingefostre.

  1. Put æggene i inkubator på den ene side, der markerer den øvre overflade. Den dag, hvor æggene er sat i inkubatoren er betegnet dag 0 fosterudviklingen.
  2. Indstil inkubationstemperatur ved 37,8 ° C, og luftfugtigheden på 47%. Sørg for, at automatiske rotation indstillingen er slukket.

2.. Åbning af æggene

Varighed: ± 60 min i 25 æg

På udvikling dag 3, æggene åbnet under laminar luftstrøm. Åbning æggene på yderligere udviklingsstadiet medfører skader på CAM, som membranen tendens til at klæbe til skallen. En infrarød lampe anvendes til at holde æggene varme under proceduren. For at forbedre sterilitet, anbefaler vi brug af hånd handsker.

  1. Placer ægget i eggcup med markerede side opad.
  2. Sænke CAM ved at fjerne to ml albumin gennem en 18 G nål indsat på spidsen af ​​ægget. Hvis nålen er sløv efter perforering flereæggeskaller, udskift nålen. Hvis ikke, har for meget kraft, der skal udøves, hvilket resulterer i skader på æggeblomme eller brud af skallen. Undertiden nålen er blokeret af chalazae, en af ​​2 spiral bands suspension blommen i æggehvide. Dette kan løses ved blidt at skubbe stemplet ned, indtil blokken er løst. Hvis æggeblomme suges ind i sprøjten, udskifte nålen samt sprøjten. Undertiden fosteret dør efter denne begivenhed. Hvis en utilstrækkelig mængde æggehvidestof er fjernet, vil CAM blive beskadiget, når skallen er fjernet.
  3. Påfør en semipermeabel klæbende film på det markerede oversiden af ​​skallen for at forhindre spild af shell partikler på modulet, mens der skæres vinduet.
  4. Foretag en introduktion hul med en lille syl på æggets overflade.
  5. Skær et vindue på 1 cm 2 i skallen, ved hjælp af et par sterile spidse kirurgiske saks.
  6. Fosterets pulserende hjerte og tilstødende fartøjer kan observeres ved than overflade af æggeblommen. Fjern de ikke-befrugtede æg eller døde embryoner. En afbrudt aspekt af blodkarrene karakteriserer døde fostre.
  7. Forsegle vindue med en semipermeabel selvklæbende film. Det er ikke nødvendigt for at dække indstiksstedet, medmindre råtanken er revnet under indføring af nålen.

3.. Inokuleringsproceduren

Varighed: ± 1 time pr cellelinie

På chick fosterudvikling dag 9, æggene podet under laminar luftstrøm.

Evaluering af cancercelle spreder sig ud over CAM kræver indeslutning af celler til et begrænset overflade under podning. Matrigel er en ekstracellulær matrix (ECM) gel fra Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom hyppigt anvendt i eksperimentelle celledyrkningsbetingelser. Det er en væske, når den afkøles, men vil gennemgå termisk aktiveret polymerisation når bragt til 20 - 40 ° C, hvorved der dannes en stabil gel. During forsøgene er Matrigel opbevares i en kasse med smeltende is.

Bemærk: Vi insisterer ikke at bruge perforerede dækglas. Vi observerede fastgørelse og vækst af podede kræftceller på plastskive således påvirke vækstpotentiale cellerne på selve membranen.

  1. Resuspender en cellepellet i afkølet ECM gel ved en koncentration på 10 6 celler/100 pi ECM gel. Hold dette løsning på frysepunktet.
  2. Forbrugsafgifter del af den semipermeable membran med et par steril kirurgisk under laminær luftstrøm. Hvis limen filmen fjernes helt, vil dette resultere i en større andel af fosterdød grund af forurening.
  3. Tryk CAM lige under skallen vinduet let med en steril glasstav, for at fjerne epithelcellelaget. Berøring af CAM med en steril glasstang viser sig at være mindre traumatisk end at bruge en skalpel nr. 11, som kræver mere færdighed og erfaring. Små blødninger kan forekomme.
  4. Tilføjelse tumor materiale.
  5. For tumor transplantater: forsigtigt nederste stykke væv på CAM med et par steril pincet, uden at klemme den.
  6. For ECM gel procedure: Tilføj 4x 25 ul af celle-ECM gelsuspension i CAM, oven på hinanden, så ECM gelen til at polymerisere i mellem applikationerne. På denne måde en klæbende plaque indeholdende kræftcellerne er oprettet.
  7. Seal skallen vinduet igen med en semipermeabel selvklæbende film.

4.. Imaging og Høst af CAM

Varighed: 2 timer til 25 æg

På chick fosterudvikling dag 16, er CAM'erne høstet. Arbejde under laminar luftstrøm er ikke nødvendig.

  1. Forstør vinduet med et par af kirurgiske sakse. Sørg for ikke at skære for lavt, ellers CAM blive beskadiget, hvilket resulterer i blødning af de tilskadekomne fartøjer.
  2. Tilføj 300 - 500 pi PBS D med en pipette på CAM secning indeholdende den podede materiale. Hvis der ikke fluorescerende prober anvendes, kan bufret formaldehyd anvendes som det gør membranen stivere, lette skæring af membranen.
  3. Gør et fotografi af CAM i ægget gennem en stereo fluorescensmikroskop udstyret med et digitalt farvekamera, med både GFP eller DSR filter, og filtret. For tumor transplantater, er alle fotografier lavet uden filtre. Belysning fra oven ved LED-lys anbefales kraftigt under fotografere (Figur 2).
  4. Optag tumorcelle migrering de mærkede celler. Grænserne for tumorer kan være uregelmæssig og flosset. Spredte celler kan være til stede nær tumor grænser. I nogle prøver, kan rækker af tumorceller observeres (figur 3).
  5. Skær membranen med et par steril saks ved grænsen ligger an mod skallen.
  6. Placer høstede CAM i et sterilt petriskål fyldt med PBS D eller buffered formaldehyde.
  7. Gør et fotografi af både den øvre side og den nedre side af CAM, både med og uden filter.
  8. Sæt membranen i en mærket beholder med pufret formaldehyd i mindst 72 timer.
  9. Integrer CAM'erne i paraffin og forberede dem til histologisk undersøgelse. Sørge for at skære tumor transplantater i midten af ​​knuden, og sørg snitfladen er parallel med bunden af ​​kassetten. Hvis ikke, vil samspillet mellem CAM og tumor graft ikke være synlige. Den samme strategi gælder for ECM gel plaques: den overflade, der vender skærekniven skal være vinkelret på pladen.

5.. Histologisk evaluering

Hæmatoxylin-eosinfarvning og Ki-67 immunhistokemi blev udført for yderligere afklaring, hvis det er nødvendigt. Immunhistokemi blev udført på formalin-fikserede paraffin-indlejrede vævssnit på 3,5 um i tykkelse, anvendelse af et automatiseret slide farvningsværktøjet according til producentens anvisninger. En mus primært monoklonalt antistof Ki-67 (klon MIB-1, fortynding 1/100) blev anvendt. Heat-epitopgenfinding blev udført ved hjælp Cell Conditioning 1, og visualisering blev opnået med den universelle DAB Detection Kit, i henhold til producentens anvisninger. Dehydrering af vævssnit blev udført under anvendelse af en automatiseret coverslipper.

For SAOS2 og SW1353 cellelinier, blev antallet af Ki67-positive og Ki67-negativ celle nuclei/100 um 2 tælles i tre zoner: en tæt på grænsen til CAM, en lukke overfladen og en i midten af ECM gel plak. Denne procedure blev gentaget 6x for hver Ki-67-farvede objektglas. Indekset for proliferation blev bestemt for hvert objektglas ved at dividere antallet af Ki67-positive celler med det totale antal talte celler.

Nekrose er defineret ved et tab af fin dispersion af kromatin i cellekernen, ledsaget af fading af distinkte celle marginer. For implanteret er nekrose scores som komplet, partiel (ofte på overfladen), eller fraværende. Infiltration af tumorceller i CAM'et er defineret ved observation af tumorceller i mesoderm af CAM, og scores som værende til stede eller fraværende.

Tre punkter er scoret for vært adfærd. Fibroblast infiltration er defineret som aflange celler forlader CAM og invaderer tumor graft / plak og er scoret som værende til stede eller fraværende. Vaskulær indvækst kan iagttages indvækst af prolifererende chick skibe, kendetegnet ved tilstedeværelsen af ​​kerneholdige chick erytrocytter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Evaluering af CAM

Tumor podninger bliver klæbende til CAM (figur 2A). Single cellesuspensioner fra patientmateriale ofte vise en tørret, lidt hævet plaque (Figur 2D). Efter udskæring af CAM, markerede rynker af membranen forekommer (figur 2E og 2F).

For kommercielle cellelinjer plak bliver mere uigennemsigtige tid, hvilket indikerer celleproliferation. Forskellige cellelinjer i ECM gel har en tydelig vækst mønster på CAM'en. SAOS2 danner en spreder plak, med en tydelig forøgelse af overfladen fra dag 7 efter podning, mens GFP signalet forbliver stærk, hvilket indikerer levedygtige celler. Migration af SAOS2 celler kan visualiseres parallelt med fartøjer af CAM (Figur 3). Når observeret gennem stereomikroskop, kan blodkarrene kan ses, når der ikke filter bruges. Tumorceller kan ikke skelnes, når ingen filter anvendes. Det er ikke muligt at visualisere blodkar når en GFP filter indsættes. Ved at dreje filteret til og fra, kan den tætte kontakt mellem de migrerende celler og blodkarrene kan ses. Punktformede blødninger kan iagttages gennem plak (figur 4, række 1 og 2). Plaques indeholdende SW1353 celler viser et fald i overflade og tendens til at sammentrække CAM, hvilket resulterer i en rynket membranen efter høst det (figur 4, rækker 5 og 6). DSR-signalet falder som den fluorescerende probe bliver fortyndet efter mange celledelinger. Fra dag 7, blødning observeres ofte. Hvis der opstår blødning, DSR-signalet også falder.

Vaskulær reaktion kan visualiseres efter udskæring af CAM ved den nedre opfattelse viser snoede fartøjer omgiver transplantatet eller plak (figur 2). Vaskulær reaktion CAM er observeret i tumorgraft gruppe, enkelt celle suspension gruppe (<strong> Figur 2C og 2F) og ECM gel kontrolgruppen (figur 2G), men ikke i celle opløsning kontrolgrupperne (Figur 2H). Nye snoede fartøjer kan observeres indgå i prøven, forgrening (figur 2I, pilespidser) og anastomoserende (figur 2I, asterisker) med hinanden, også små områder på blødning forekomme (figur 2I, pile). Neovaskularisering af tumoren kan kvantificeres på H & E slides i de forskellige zoner af tumor / tumor plak.

Histologiske tegn viser, at SAOS2 celler opretholder en enkelt celle udseende under hele mængden af ​​ECM gel, der forårsager en øget tykkelse og diameter af pladen. De invadere mesodermal lag af CAM (figur 5A, pil), derved udvide afstanden mellem endodermal og Ectodermal lag af CAM som en åbning lynlås (figur 5A (figur 5B, pil). Antallet af celler og celleklynger stige støt i gang, og antallet af ikke-proliferative celler stiger fra dag 7, især på overfladen af ​​pladen. For SW1353, kan sammentrækningen af ​​CAM også forstås på H & E dias sammenlignet med H & E lysbilleder af SAOS2.

Uanset deres ektopisk sted med vækst, fandt vi, at væsentlige træk og immunhistokemiske egenskaber af den oprindelige sarkom tumorer blev opretholdt i CAM. Desuden tumor transplantater bliver revascularized som det fremgår af fremkomsten af ​​kerneholdige chick erythrocytter, tumor transplantater bliver infiltreret af chick fibroblaster og tumorceller fra transplantatet infiltreret CAM værtsvævet illustrerer pålidelighed og Robustness CAM-assay (fig. 6, indsat nederst til venstre). For yderligere detaljerede oplysninger henviser vi til Sys et al. 14..

Høsttidspunktet

Celletælling af Ki67-positive og Ki67-negative celler viser en støt stigning i det samlede antal af celler fra dag 4 til begge cellelinier. Efter denne dag det samlede antal celler forbliver stabil. Syv dage efter inokulering, begynder antallet af Ki67-positive celler og det samlede antal celler at falde. Om antallet af celler, er der en betydelig korrelation mellem de tre zoner. Imidlertid er en større andel af Ki67-positive celler tæt på CAM, og en større andel af Ki67-negative celler på overfladen af pladen observeret (figur 4, række 3, 4, 7 og 8).

Indekset for spredning er fortsat relativt stabilt indtil syv dage efter podning, hvorefter det også begynder at falde. Den proliferation indeks over SW1353 cellelinien er betydeligt lavere (p <0,05) sammenlignet med den SAOS2 cellelinie.

Selv om der er en signifikant sammenhæng mellem de tre zoner, er det vigtigt at tælle felter i alle tre regioner i ECM gel plak, som vi observerer en større andel af Ki67-positive celler tæt på CAM og en større andel af Ki67-negativ celler på overfladen af pladen (figur 7).

Figur 1
Figur 1. Overblik af protokollen. Klik her for at se større figur .

Figur 2 Figur 2. Fotografier taget under høsten øverste række bekymringer Høsten af en tumorgraft fra en chondrosarcoma:. A = in situ, B = øvre visning i petriskål, C = lavere visning i petriskål. Midterste række bekymringer høst af en enkelt celle suspension i ECM-gel: D = in situ, E = øvre visning i petriskål, F = lavere visning. Nederste række G = matrigel kontrol, H = celle løsning kontrol I = lavere view viser forgrenede skibe og blødning. Klik her for at se større figur .

Figur 3
Figur 3. GFP fotografi af SAOS2

Figur 4
Figur 4.. Denne figur viser fotografier af både SAOS2 (øverste 4 rækker) og SW1353 (Lower 4 rækker) på dag 1 til 8 efter podning. Række 1 (skala bar 2 mm) viser fotografier af CAM in situ gennem et stereomikroskop med GFP filter. Række 2 (skala bar 2 mm) viser de samme prøver gennem stereomikroskopet mens oplyst af lysdioder fra oven. Række 3 og 4 viser H & E (række 3, Målestokken 200 um) og Ki67-farves (række 4, Målestokken 200 eller 500 um) histologiske billeder fra de samme prøver. række 5 (skala bar 2 mm) viser fotografier af CAM in situ gennem et stereomikroskop med DSR filter. Række 6 (rcale bar 2 mm) viser de samme prøver gennem stereomikroskopet mens oplyst af lysdioder fra oven. Række 7 og 8 viser H & E (række 7, Målestokken 200 um) og Ki67-farves (række 8, Målestokken 200 og 500 um) histologiske billeder fra de samme prøver. Klik her for at se større figur.

Figur 5
Figur 5. Sammenligning af tumorcelleproliferation af SAOS2 og SW1353. A = vækst på SAOS2 B = vækst SW1353.

Figur 6
Figur 6.. Kerneholdige chick erythrocytter kan observeres i kapillærerne gennem en høj kvalitet liposarkom tumorgraft (HE, 100X), indsat laveretilbage.

Figur 7
Figur 7. Graf, der viser Ki67 + og Ki67-celler over tid i henhold til afstanden fra CAM for begge cellelinier. Zone A = mod CAM, zone C = overflade af pladen, zone B = i-mellem zone A og C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tidspunkt for podning og høst

Timing dagen for podning blev udført ved hjælp SAOS2 i ECM gel (36 CAMs) og varierede mellem fosterudviklingen dag 5 og 10.

Før inkubation dag 9, var CAM ikke konsekvent stor nok til at understøtte ECM gelen vi anvendte. Ved høst, undertiden tumorceller skulle hentes fra dybere CAM, og nogle ECM gelprøver lå løs i æggehviden eller på CAM. På dag 5 og 6, var det svært at undgå at tumorcellerne på hønseembryo, hvilket resulterer i chick misdannelser eller død. Fra dag 9 blev CAM fuldstændigt dækker overfladen under vinduet i de fleste æg, og ECM gel plaques viste klæbende til CAM ved høsttidspunktet. Derfor fandt vi det ideelle tidspunkt for podning for at være dag 9 i fosterudviklingen.

Til bestemmelse af det ideelle tidspunkt for høst, blev der SAOS2 og SW1353 høstes efter respectively 1, 2 (SAOS2-GFP kun), 4, 5, 6, 7 og 8 dage efter indpodning eller mellem fosterudvikling dag 10 og 17 år. Efter disse variationer blev en forskel i længden af ​​ansøgning på CAM noteret 1-12 dage.

Knighton offentliggjort markante forskelle i tumorvækst og revaskularisering ifølge den embryonale udvikling dag på tidspunktet for tumorprøven ansøgning 17.. Celletælling af Ki67-positive og Ki67-negative celler udviste en støt stigning i det samlede antal celler fra dag 4 til begge cellelinier. Dette er overensstemmende med den konklusion Ausprunk et al. 21., som erklærede, at den periode, der er nødvendige for revaskularisering tager 72 timer. Efter at tælle antallet af celler og beregning af indekset for spredning, kan vi antage at cellerne spredt i ECM gel aktivt breder fra dag 4 indtil dag 6 efter podning. Baseret på diameteren af ​​plak, det totale antal celler og indekset forspredning, foreslår vi, at det ideelle tidspunkt for høsten er dag 16 af fosterudviklingen, eller syv dage efter podningen.

Den foreslåede tidsramme efterlader forskerne et vindue af seks dage til anvendelse af agenter, mens cellerne aktivt prolifererende, enten en gang på dag 4 efter podning eller dagligt under hele tidsramme. Til topisk indgivelse påføres forbindelsen på CAM-overfladen. Denne rute er den mest almindeligt anvendte, henset til adgang til CAM ved blot at åbne æggeskallen / klæbefolie 22,23. Selvom intravenøs administration er muligt, at det er vanskeligt at indsætte nåle ind i CAM skibe er et kritisk begrænsning. Kinaseinhibitorer anvendes på daglig basis 24, kemoterapi gang under eksperimentet. Vi hypotesen, at tilføje et stof, når svarer til den kliniske behandling med cytotoksisk af cytostatika, som er klassisk administreret én gang hver 3. uge, samtidig med at tilføjeforbindelsen på en daglig basis vil afspejle den daglige dosis af kinaseinhibitorer i kliniske omgivelser. Men vi skal huske på, at topikal administration vil vise forskellige kinetik / metabolisme sammenlignet med oral eller intravenøs administration hos patienter.

Betydningen af ​​teknik og mulige fremtidige applikationer

Bevarelse af cellemorfologi er af afgørende betydning, når cellekulturer anvendes i prækliniske modeller. Brugen af homogene ekstracellulære matricer såsom collagen type I 25 eller ECM gel 26 genskaber tumorceller miljø, hvilket giver en mere naturlig vækstmønster.

I modsætning til in vivo-analyser, gør in vitro-analyser ikke indeholde stromalceller såsom angiogene vaskulære celler, infiltrerende immunceller eller cancer-associerede fibroblastceller nødvendigt at rekonstruere den tumorigen mikromiljø 27. Når CAM-assayet anvendes til stillingtagenion af tumorgrafts har vi beskrevet en typisk 'invasion kegle' fra CAM mod tumorgrafts, hvilket afspejler rekruttering af stromalceller fra chick ved tumorgraft 14..

CAM-analysen giver en kombination af at genoprette den ekstracellulære matrix ved ECM gel og give værtsceller til rekonstituering af tumorigen mikromiljø. Som CAM og tumorgraft / plaque er let tilgængelige, indgivelse af forbindelser er nemt. På denne måde åbner CAM-assayet nye perspektiver til den prækliniske evaluering af sjældne tumortyper, såsom sarkomer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Acknowledgments

Celler fra SW1353 chondrosarcoma cellelinje blev venligst stillet til rådighed af Prof. Dr. PCW Hogendoorn og Prof. Dr. J. Bovee af Leiden Universitet, Holland. Vi takker J. Mestach og G. Wagemans for fremragende teknisk bistand og G. De Bruyne til den professionelle tegning af overblik over vores protokol.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Line Nucleofector Kit V Amaxa VCA-1003
collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) Sigma Aldrich C6885
DMEM Invitrogen 41965-039
DMSO Sigma D8418
Dnase solution Sigma Aldrich DN25
G418 Invitrogen 11811031
Matrigel Sigma-Aldrich E1270
mouse primary monoclonal antibody Ki67 Dako Denmark MIB-1
Paraformaldehyde Fluka D76240
PBS Invitrogen 20012019
PBSD Invitrogen 14040083
peGFP-C1 vector Clontech 632470
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140163
RPMI Invitrogen 22409-015
Trypsin-EDTA solution Invitrogen 25300054
Vybrant cell-labeling DiI Lifetechnologies 22885
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10227
digital color camera Leica DFC 340 FX
Digital Egg Incubator Auto Elex Co R-COM 50
FACS BD Biosciences FACSAriaIII
Gentlemacs C-Tube Miltenyi Biotech 130-093-237
Gentlemacs Dissociator Miltenyi Biotech 130-093-235
Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol Miltenyi Biotech
Name Company Catalog Number Comments
semipermeable adhesive film (Suprasorb F) Lohmann&Rauscher 20468
stereo fluorescence microscope Leica M205 FA
Tissue-Tek Film automated Coverslipper Sakura 6400
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana Medical Systems Inc 760-500
Ventana Automated Slide Stainer Ventana Medical Systems Benchmark XT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution. Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).
  2. Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas. Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).
  3. Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M. Cancer statistics, 2001. CA A Cancer Journal for Clinicians. 51, 15-36 (2001).
  4. Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin. Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).
  5. Taylor, B. S., Barretina, J., et al. Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).
  6. Skubitz, K. M., D'Adamo, D. R. Sarcoma. Mayo Clinic Proceedings. 82, 1409-1432 (2007).
  7. Nielsen, T. O., West, R. B. Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm. Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).
  8. Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).
  9. DeRose, Y. S., Wang, G., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
  10. Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
  11. Bertotti, A., Migliardi, G., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
  12. Decaudin, D. Primary human tumor xenografted models ('tumorgrafts') for good management of patients with cancer. Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).
  13. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  14. Sys, G., Van Bockstal, M., et al. Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model. Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).
  15. Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines. Cancer Research. 42, 1826-1837 (1982).
  16. Deryugina, E., Quigly, J. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).
  17. Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).
  18. Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J. Vis. Exp. (33), e1620 (2009).
  19. Balke, M., Neumann, A., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Research Notes. 3, 58 (2010).
  20. Hendrix, A., Maynard, D., et al. Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis. Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).
  21. Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels. American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).
  22. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).
  23. Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).
  24. Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).
  25. De Wever, O., Hendrix, A., et al. Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices. International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).
  26. Albini, A., Benelli, R. The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation. Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).
  27. Hanahan, D., Coussens, L. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).

Tags

Cancer Biology medicin cellebiologi molekylærbiologi Biomedical Engineering Bioengineering Developmental Biology anatomi fysiologi Oncology Surgery neoplasmer fedtvæv bindevæv Neoplasma muskelvæv Sarkom dyreforsøg Cell Culture Teknikker neoplasmer Eksperimentelle Neoplasma Transplantation Biologisk Assay sarkomer CAM-assay xenograft proliferation invasion kræft tumor, CAM assay kliniske teknikker dyremodel
Den<em&gt; I ovo</em&gt; CAM-assay som et Xenograftmodel til Sarkom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sys, G. M. L., Lapeire, L., Stevens, … More

Sys, G. M. L., Lapeire, L., Stevens, N., Favoreel, H., Forsyth, R., Bracke, M., De Wever, O. The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522, doi:10.3791/50522 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter