Summary
De
Abstract
Sarcoom is een zeer zeldzame ziekte die is heterogeen van aard, alle die de ontwikkeling van nieuwe therapieën. Sarcoom patiënten zijn ideale kandidaten voor gepersonaliseerde geneeskunde na stratificatie, het uitleggen van de huidige belangstelling voor de ontwikkeling van een reproduceerbare en low-cost xenotransplant model voor deze ziekte. Het kuiken chorioallantoïsmembraan is een natuurlijk immunodeficiënte gastheer staat is tot duurzame geënt weefsels en cellen zonder soortspecifieke beperkingen. Bovendien is het eenvoudig te bereiken, gemanipuleerd en afgebeeld met behulp van optische en fluorescentie stereomicroscopie. Histologie maakt verdere gedetailleerde analyse van heterotypische cellulaire interacties.
Dit protocol beschrijft in detail de in ovo enten van het chorioallantoïsmembraan verse sarcoom afgeleide tumorweefsels, hun enkelvoudige celsuspensies en permanente en tijdelijke fluorescent gelabelde vastgesteld sarcoma cellijnen (Saos-2 en SW1353). De kuikenoverleving rates zijn tot 75%. Het model wordt gebruikt om graft-(levensvatbaarheid, Ki67 proliferatie-index, necrose, infiltratie) en gastheer (fibroblast infiltratie, vasculaire ingroei) gedrag te bestuderen. Voor gelokaliseerde enten van enkele cel suspensies, ECM gel biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van inerte insluiting materialen. De Ki67 celproliferatie is gerelateerd aan de afstand van de cellen van het oppervlak van de CAM en de duur van de toepassing van de CAM, deze bepaling een tijdschema voor de toevoeging van therapeutische producten.
Introduction
Sarcoom is een zeldzame tumor van het bindweefsel met een hoog sterftecijfer als gevolg van therapie resistentie 1,2. Vooruitgang in overleving patiënt wordt gehinderd door hun lage jaarlijkse incidentie, hun grote diversiteit, en het feit dat sarcoom cellen worden gerapporteerd aan hard om cultuur in vitro 3,4.
Het gebruik van gekweekte cellen voor preklinische therapie evaluatie blijkt dat nieuwe, blijkbaar actieve moleculen in vitro niet altijd met resultaten in de klinische setting. Bovendien genoom afwijkingen onthuld door genexpressie arrays zijn niet altijd gecorreleerd met tumor gedragskenmerken bij de individuele patiënt 5-7. Om te proberen en het oplossen van deze problemen, is gepersonaliseerde geneeskunde aan belang gewonnen, die wordt weerspiegeld in de toegenomen zoektocht naar xenograftmodellen 8-12.
Een in vivo assay heeft het voordeel dat als gevolg van de complexe wisselwerking tussen cancer cellen en het gastheerweefsel milieu in vaste tumoren, noodzakelijk voor proliferatie en invasie 13 kanker. Momenteel bestuderen we het gebruik van het Chorio-allantoïs membraan assay (CAM-assay) als reproduceerbaar xenograft model voor sarcoom 14,15. Deze test wordt veel gebruikt voor de studie van tumorangiogenese 16,17. In de literatuur, hebben we echter verschillende protocollen voor deze test gevonden, terwijl andere studies waargenomen een duidelijk verschil in groei of angiogenese volgens verschillende protocollen 18,19.
In dit artikel wordt het effect van variabele condities van de CAM-assay op mobiele gedrag met behulp van tumor enten, tumorafgeleide enkele cel suspensies en gevestigde sarcoom celculturen onderzoeken we.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zie Figuur 1 voor een overzicht
Tumormateriaal
1. Het verkrijgen en voorbereiden tumormonsters
Voor het gebruik van patiëntenmateriaal, goedkeuring van het Ethisch Comite is noodzakelijk, en geïnformeerde toestemming moet worden verkregen van de patiënt.
- Harvest representatieve materiaal (minimaal 1 cm3) en het tijdstip van interventie, of een biopsie of resectie van een sarcoom. De juiste plaats van de biopsie wordt bepaald met behulp van dynamische contrast-MRI.
- Plaats het materiaal direct in een steriele flacon met DMEM aangevuld met 1.000 U penicilline en 1 mg / ml streptomycine.
- Vervoer de flacon onmiddellijk (30 - 90 min) naar het lab.
Alle volgende procedures worden uitgevoerd onder laminaire stroming.
- Giet de inhoud van de flacon in een steriele petrischaal.
- Zet de tumor monster in kleine delen van maximaal 1 mm 3 met een steriele scalpel. Verwijder alle verkalkte delen als ze de neiging om de verdere verwerking van het weefsel aantasten.
- Willekeurig nemen 10 tumor enten voor toepassing op de CAM.
2. Voorbereiding van de Tumor-afgeleide Single Cell Schorsingen
Geschatte tijdsduur: 3 uur
- Weeg de resterende weefsel van het monster.
- Zet 2 - 4 g weefsel in een Dissociator buis, meer dan een buis kan worden verplicht om alle resterende tumorweefsel verteren.
- Voor digestie van 2-4 g weefsel, voeg 2,5 ml collagenase oplossing 2 (500 U / ml RPMI 1640) en 2,5 ml DNase oplossing (22 KU / ml RPMI 1640).
- Werkwijze het weefsel volgens de Dissociator h_tumor protocol. Hierbij 2 cycli van incubatie bij 37 ° C in CO2 incubator terwijl de buis wordt zachtjes geschud gedurende 30 minuten.
- Filter de resterende suspensie door een 150 um cel zeef.
- Centrifugeer het lysaat bij 1000 rpm gedurende 5 min.
- Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet in 10 ml van erytrocyten lysis buffer (ELB), waardoor 10 min incubatie regelmatig suspensie.
Opmerking: erytrocyten lysis buffer wordt als volgt bereid: Aan 0.037 g EDTA, 0,99 g K 2 HPO 4, 8,29 g NH4Cl tot 1000 ml aqua, gebruik 10 N NaOH om de pH onder druk stellen tot 7,3, gefiltreerd door een 0,22 urn filteren. Bewaren bij 4 ° C.
- Voeg 25 ml kweekmedium (DMEM aangevuld met 10% foetaal bovien serum, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine) om de reactie te stoppen.
- Centrifugeer de suspensie bij 1000 rpm gedurende 5 minuten. De kleur van de pellet moet nu wit zijn.
- Verwijder het supernatant.
- Voeg 5 ml medium aan de pellet. Filter de suspensie door een 70 um cel zeef.
- Tel het aantal levende cellen / ml door middel van een automatische celteller.
3. Cancer cellijnen
SAOS2 osteosarcoomcellen (ATCC: HTB-85) expressie versterkt groen fluorescent eiwit werden geëlektroporeerd door pEGFP-C1 vector met de cellijn V Nucleofector Kit volgens het protocol van de fabrikant. Om stabiele cellijnen te stellen, werden getransfecteerde cellen in G418 (1 mg / ml) geselecteerd voor 4 weken in lijn met eerdere vastgesteld protocol 20. Daarnaast werd sortering uitgevoerd door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) volgens de instructies van de fabrikant.
Cellen van de SW1353 chondrosarcoma cellijn (ATCC nummer: HTB-94) of vers bereide tumor cel suspensies worden geëtiketteerd met een rode fluorescerende lipofiele membraan vlek.
- Verwijder de cellen van de kolf op klassieke wijze met trypsine (0,5% wt / vol) ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA, 0,2% gew / vol) oplossing.
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 1000 rpm.
- Verwijder de supernatant.
- Voeg 1 ml serum-vrij medium en 5 gl Dil (rood Vybrant) / 10 6 cellen.
- Wikkel de injectieflacon in aluminiumfolie en zet het in de CO2 incubator gedurende 10 minuten bij 37 ° C.
- Centrifugeer opnieuw gedurende 5 min bij 1000 rpm en verwijder het supernatant.
Chorioallantoïsmembraan assay
1. Ei incubatie
- Bevruchte eieren van een lokale commerciële broederij waarborgen 95% bevruchting van de eieren vereist.
- Bevruchte eieren kunnen bij kamertemperatuur worden bewaard tot 10 dagen.
Opmerking: voordat incubatie worden vuil, veren en uitwerpselen zorgvuldig verwijderd uit de eierschalen mechanisch door droog afvegen met keukenpapier, die een ruw in plaats van een zachte oppervlaktestructuur hebben. Veegde de eieren met 70% gedenatureerde ethanol of andere schoonmaakmiddelen reagens aanzienlijk vermindert de overlevingskans van de kippenembryo's.
- Doe de eieren in de incubator enerzijds markeren het bovenvlak. De dag waarop de eieren worden in de incubator wordt aangewezen dag 0 van de embryonale ontwikkeling.
- Stel de incubatietemperatuur bij 37,8 ° C en de vochtigheid op 47%. Zorg ervoor dat de automatische optie rotatie is uitgeschakeld.
2. Opening van de eieren
Duur: ± 60 min. voor 25 eieren
Op de ontwikkeling van dag 3, worden de eieren geopend onder laminaire luchtstroom. Het openen van de eieren in een verdere ontwikkelingsfase resulteert in schade aan de CAM, zoals het membraan de neiging vast te houden aan de shell. Een infrarood lamp wordt gebruikt om de eieren warm te houden tijdens de procedure. Om steriliteit te verbeteren, raden wij het gebruik van handschoenen.
- Leg het ei in het eierdopje, met de gemarkeerde zijde naar boven.
- Verlaag het niveau van de CAM door de twee ml van albumine door een 18 G naald in het uiteinde van het ei. Als de naald is stomp na perforeren verschillendeeierschalen, vervang de naald. Zo niet, te veel kracht moet worden uitgeoefend, waardoor schade aan de eidooier of breuk van de schelp. Soms is de naald wordt geblokkeerd door de chalazae, een van 2 spiraalvormige banden schorsing van de dooier in het eiwit. Dit kan worden opgelost door zachtjes op de zuiger weer naar beneden totdat het blok is opgelost. Wanneer eidooier opgezogen in de spuit, vervang de naald en de injectiespuit. Soms is het embryo sterft na deze gebeurtenis. Als een onvoldoende hoeveelheid albumine wordt verwijderd, zal de CAM worden beschadigd wanneer het reservoir wordt verwijderd.
- Breng een semi-permeabel zelfklevende folie op de gemarkeerde bovenzijde van het reservoir om te voorkomen dat morsen van shell deeltjes op de CAM tijdens het snijden het raam.
- Maak een gat voor de introductie van een kleine priem aan het oppervlak van het ei.
- Knip een raam van 1 cm 2 in de schelp, met behulp van een paar steriele puntig chirurgische schaar.
- Kloppende hart van de embryo's en de aangrenzende vaartuigen kunnen worden waargenomen bij The oppervlak van het eigeel. Verwijder de niet-bevruchte eitjes of dode embryo's. Een onderbroken aspect van de bloedvaten kenmerkt dode embryo.
- Verzegelen het raam met een semi-permeabel zelfklevende folie. Het is niet nodig de prikplaats, behalve indien het reservoir tijdens het inbrengen van de naald gekraakt.
3. Enten Procedure
Duur: ± 1 uur per cellijn
Op chick embryonale ontwikkeling dag 9, worden de eieren geïnoculeerd onder laminaire luchtstroom.
Evaluatie van kankercel verspreidt zich over het CAM vereist beheersing van de cellen aan een beperkt oppervlak tijdens inenting. Matrigel is een extracellulaire matrix (ECM) gel uit de Engelbreth-Holm-Swarm muis sarcoom vaak gebruikt in experimentele celcultuur condities. Het is een vloeistof bij afkoeling, maar thermische polymeriseren wanneer dit in 20 - 40 ° C, waardoor een stabiele gel. Gedurendede experimenten wordt Matrigel bewaard in een doos met smeltend ijs.
Opmerking: Wij dringen niet aan geperforeerde dekglaasjes gebruiken. We observeerden aanhechting en groei van kankercellen geënt op de kunststof schijf aldus vertekenende groeipotentieel van de cellen op het membraan zelf.
- Resuspendeer de cel pellet in gekoeld ECM gel bij een concentratie van 10 pl 6 cells/100 ECM gel. Bewaar deze oplossing op smeltend ijs.
- Accijns deel van het semi-permeabel membraan met een paar steriele chirurgische onder laminaire luchtstroom. Als de folie volledig is verwijderd, zal dit resulteren in een groter deel van embryonale sterfte als gevolg van verontreiniging.
- Raak de CAM direct onder het venster reservoir voorzichtig met een steriele glasstaaf om de epitheliale cellaag verwijderd. Het aanraken van de CAM met een steriele glazen staaf blijkt minder traumatisch dan het gebruik van een scalpel n ° 11, die meer handigheid en ervaring vereist zijn. Kleine bloedingen optreden.
- Eendding tumor materiaal.
- Voor tumor enten: voorzichtig onderste stukje weefsel op de CAM met een paar steriele pincet, zonder erin te knijpen.
- Voor de ECM gel procedure: Aan 4x 25 ul van de cel-ECM gelsuspensie de CAM op elkaar, waardoor de ECM gel in polymeriseren tussen de applicaties. Zo een aanhanger plaque die de kankercellen wordt gecreëerd.
- Dicht de shell venster opnieuw met een semi-permeabel zelfklevende folie.
4. Beeldvorming en oogsten van de CAM
Duur: 2 uur voor 25 eieren
Op chick embryonale ontwikkeling dag 16, worden de CAM's geoogst. Werken onder laminaire luchtstroom niet noodzakelijk.
- Vergroten het venster met een paar van chirurgische schaar. Zorg ervoor dat te laag niet te snijden, anders wordt de CAM zal worden beschadigd, wat resulteert in bloeden van de gewonde vaten.
- Zet 300-500 pi PBS D met een pipet op de CAM sekteion met de geïnoculeerde materiaal. Indien geen fluorescente probes worden gebruikt, kan gebufferde formaldehyde worden gebruikt als dit maakt het membraan stijver, vergemakkelijkt het snijden van het membraan.
- Maak een foto van de CAM in het ei via een stereo fluorescentiemicroscoop, uitgerust met een digitale kleuren camera, met behulp van zowel de GFP of de DSR-filter, en geen filter. Voor de tumor enten, zijn alle foto's gemaakt zonder filters. Verlichting van bovenaf door LED-verlichting wordt sterk aanbevolen tijdens het fotograferen (figuur 2).
- Record migratie van tumorcellen voor de gelabelde cellen. De grenzen van de tumoren kan zijn onregelmatig en gerafeld. Verspreide cellen kunnen aanwezig zijn in de buurt van de tumor grenzen zijn. In sommige exemplaren kunnen rijen tumorcellen worden waargenomen (Figuur 3).
- Snijd de membraan met een paar steriele schaar op de grens liggen tegen de houder.
- Plaats de geoogste CAM in een steriele petrischaal gevuld met PBS D of gebufferd voorformaldehyde.
- Voeg een foto van zowel de bovenzijde en de onderzijde van de CAM, met en zonder filter.
- Zet het membraan een geëtiketteerde container met gebufferde formaldehyde ten minste 72 uur.
- Integreer de CAM in paraffine en hen voor te bereiden voor histologisch onderzoek. Zorg ervoor dat de tumor grafts gesneden in het midden van het gezwel, waardoor dat het snijvlak evenwijdig aan de bodem van de cassette. Zo niet, zal de interactie tussen de CAM en de tumor transplantaat niet zichtbaar zijn. Hetzelfde geldt voor de strategie ECM gel platen: het oppervlak tegenover het mes moet loodrecht op de plaque.
5. Histologische evaluatie
Hematoxyline-eosine kleuring en Ki-67 immunohistochemie werden uitgevoerd voor verdere verduidelijking, indien nodig. Immunohistochemie werd uitgevoerd op formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde weefselcoupes van 3,5 urn dik, met behulp van een geautomatiseerde kleurmachine volgensde instructies van de fabrikant. Een muis primair monoklonaal antilichaam Ki-67 (kloon MIB-1, verdunning 1/100) gebruikt. Warmte-geïnduceerde epitoop werd uitgevoerd met behulp van Cell Conditioning 1, en visualisatie werd bereikt met de Universele DAB Detection Kit, volgens de instructies van de fabrikant. Dehydratatie van weefselsecties werd uitgevoerd met een geautomatiseerde afdekapparaat.
Voor de SAOS2 en de SW1353 cellijnen, werden het aantal Ki67-positieve en Ki67-negatieve cel nuclei/100 um 2 geteld in drie zones: een dicht bij de grens van het CAM, ene sluit het oppervlak en een in het centrum van de ECM gel plaquette. Deze procedure werd herhaald voor elk 6x Ki-67 gekleurde slide. De index van de proliferatie werd bepaald voor elke dia door het aantal Ki67-positieve cellen door het totale aantal getelde cellen.
Necrose wordt gedefinieerd door een verlies van fijne dispersie van chromatine in de celkern, vergezeld fading afzonderlijke cel marges. Voor xenotransplantaten, necrose wordt gescoord als volledige, gedeeltelijke (vaak aan de oppervlakte) of afwezig. Infiltratie van tumorcellen in de CAM wordt bepaald door de waarneming van tumorcellen in het mesoderm van de CAM en wordt gescoord als aanwezig of afwezig zijn.
Drie punten worden gescoord voor host gedrag. Fibroblast infiltratie wordt gedefinieerd als langgerekte cellen verlaten van de CAM en de invasie van de tumor graft / plaque, en wordt gescoord als aanwezig of afwezig zijn. Vasculaire ingroei kan worden waargenomen als ingroei van prolifererende kuiken schepen, gekenmerkt door de aanwezigheid van kiemvorming chick erytrocyten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Evaluatie van de CAM
Tumor grafts worden aanhanger van de CAM (Figuur 2A). Enkele cel suspensies van patiëntenmateriaal vaak weer een droge, licht verhoogd plaque (figuur 2D). Na excisie van het CAM, gemarkeerd kreuken van het membraan optreedt (figuren 2E en 2F).
Voor de commerciële cellijnen de plaque wordt meer ondoorzichtig in de tijd, met vermelding van celproliferatie. Verschillende cellijnen ECM gel hebben een duidelijke groei patroon op de CAM. SAOS2 vormt een spreiding plaquette, met een duidelijke toename van het oppervlak van dag 7 na de inenting, terwijl de GFP signaal blijft sterk, wat aangeeft levensvatbare cellen. Migratie van SAOS2 cellen kan worden gevisualiseerd parallel aan de schepen van het CAM (figuur 3) zijn. Toen waargenomen door de stereomicroscoop, kunnen bloedvaten worden gezien wanneer er wordt geen filter gebruikt. Tumorcellen kunnen niet worden onderscheiden wanneer er geen fIlter gebruikt. Het is niet mogelijk om de bloedvaten te visualiseren wanneer GFP filter is geplaatst. Door het filter aan en uit, het nauwe contact tussen de migrerende cellen en bloedvaten zichtbaar. Puntvormige bloedingen kan worden waargenomen door de plaque (figuur 4, rijen 1 en 2). De plaques die SW1353 cellen een afname oppervlak de neiging om de CAM contract, resulterend in een gerimpelde membraan na oogsten (Figuur 4, rij 5 en 6). De DSR signaal af naarmate de fluorescente probe wordt verdund na vele celdelingen. Vanaf dag 7, is bloeding vaak waargenomen. Als er een bloeding optreedt, het DSR signaal vermindert ook.
Vasculaire reactie kan na excisie van de CAM gevisualiseerd op onderaanzicht, met kronkelige vaten rondom de graft of plaque (figuur 2). Vasculaire reactie van de CAM wordt waargenomen in de Tumorgraft groep, de enkele celsuspensie groep (<strong> Figuur 2C en 2F) en de ECM gel controlegroep (figuur 2G), maar niet in celoplossing controlegroepen (Figuur 2H). Nieuwe kronkelige vaten kan worden waargenomen in het monster terecht, vertakking (figuur 2I, pijlpunten) en anastomose (figuur 2I, sterretjes) met elkaar; ook kleine gebieden van bloedingen optreden (figuur 2I, pijlen). Neovascularisatie van de tumor kan worden gekwantificeerd op H & E slides in de verschillende zones van de tumor / tumor plaque.
Histologisch bewijs dat SAOS2 cellen handhaven een cel verschijning door het volledige volume ECM gel, waardoor een grotere dikte en diameter van de plaque. Ze dringen de mesodermale laag van de CAM (figuur 5A, pijl), waarbij het vergroten van de afstand tussen de mesodermale en ectodermale de lagen van de CAM als een opening ritssluiting (figuur 5A (figuur 5B, pijl). Het aantal cellen en celgroepen gestaag toenemen in de tijd, en het aantal niet-proliferatieve cellen stijgt van dag 7, met name aan het oppervlak van de plaque. Voor SW1353, kan de samentrekking van de CAM worden ingeschat op H & E slides in vergelijking met het H & E slides van SAOS2.
Ondanks hun ectopische plaats van groei, vonden we dat essentiële kenmerken en immunohistochemische kenmerken van de oorspronkelijke sarcoom tumoren in het CAM werden gehandhaafd. Naast de tumor transplantaten worden gerevasculariseerd zoals blijkt uit het optreden van kernhoudende erytrocyten kuiken, de tumor transplantaten raken geïnfiltreerd kuiken fibroblasten en tumorcellen uit de graft geïnfiltreerd CAM gastheerweefsel, illustreren de betrouwbaarheid en Robustness van de CAM-assay (figuur 6, inzet linksonder). Voor nadere informatie verwijzen wij naar Sys et al.. 14.
Oogsttijd
Celtellingen van Ki67-positieve en Ki67-negatieve cellen toont een gestage toename van het totale aantal cellen van dag 4 voor beide cellijnen. Na deze dag het totale aantal cellen stabiel. Zeven dagen na inoculatie, het aantal Ki67-positieve cellen en het totale aantal cellen begint te dalen. Betreffende het aantal cellen, is er een significante correlatie tussen de drie zones. Echter een groter deel van Ki67-positieve cellen dichtbij de CAM en een groter deel van Ki67-negatieve cellen aan het oppervlak van de plaque waargenomen (Figuur 4, rij 3, 4, 7 en 8).
De index van proliferatie blijft relatief stabiel tot zeven dagen na inoculatie, waarna het begint ook te dalen. De proliferation-index van de SW1353 cellijn is significant lager (P <0,05) in vergelijking met de SAOS2 cellijn.
Hoewel er een significante correlatie tussen de drie zones, is het essentieel om gebieden tellen in drie gebieden in de ECM gel plaque, zoals wij een groter deel van Ki67-positieve cellen dichtbij de CAM en een groter percentage Ki67-negatieve cellen aan het oppervlak van de plaat (figuur 7).
Figuur 1. Overzicht van het protocol. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Foto's genomen tijdens de oogst Bovenste rij betreft het oogsten van een Tumorgraft van een chondrosarcoom:. A = in situ, B = bovenste oog in petrischaal, C = lagere uitzicht in petrischaal. Middelste rij betreft het oogsten van een enkele cel suspensie in ECM gel: D = in situ, E = bovenste oog in petrischaal, F = lagere view. Onderste rij G = matrigel controle, H = celoplossing controle, I = lagere view weergave vertakkende vaten en bloeden. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. GFP foto van SAOS2 
Figuur 4. Deze figuur toont foto's van zowel SAOS2 (bovenste 4 rijen) en SW1353 (lagere 4 rijen) op dag 1-8 na enten. Rij 1 (schaal bar 2 mm) toont de foto's van de CAM in situ door middel van een stereomicroscoop met GFP-filter. rij 2 (schaal bar 2 mm) toont dezelfde monsters door de stereomicroscoop terwijl verlicht door LED's van boven. Row 3 en 4 tonen de H & E (rij 3, schaal bar 200 micrometer) en Ki67-gekleurd (rij 4, schaal bar 200 of 500 micrometer) histologische beelden van dezelfde monsters. Rij 5 (schaal bar 2 mm) toont de foto's van de CAM in situ door middel van een stereomicroscoop met DSR-filter. Rij 6 (scale bar 2 mm) toont dezelfde monsters door de stereomicroscoop terwijl verlicht door LED's van boven. Rij 7 en 8 tonen de H & E (rij 7, schaal bar 200 micrometer) en Ki67-gekleurd (rij 8, schaal bar 200 en 500 pm) histologische beelden van dezelfde monsters. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken. 
Figuur 5. Vergelijking van tumorcelproliferatie van SAOS2 en SW1353. A = groei van SAOS2 B = groei van SW1353. 
Figuur 6. Genucleëerde chick erytrocyten kan worden waargenomen in de haarvaten gedurende een hoogwaardig liposarcoma Tumorgraft (HE, 100X), inzet lagerlinks. 
Figuur 7. Grafiek die Ki67 + en Ki67-cellen na verloop van tijd op basis van de afstand van de CAM voor beide cellijnen. Zone A = tegen de CAM, zone C = oppervlak van de plaque, zone B = in-tussen zone A en C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tijd van inenting en oogst
Timing de dag van inoculatie werd uitgevoerd middels SAOS2 in ECM gel (36 CAMs) en varieerde tussen embryonale ontwikkeling dag 5 en 10.
Vóór incubatie dag 9, de CAM niet altijd groot genoeg om de ECM gel pasten we ondersteunen. Bij de oogst, tumorcellen soms moest worden opgehaald uit de diepere CAM en sommige ECM gelmonsters werden los liggen in het eiwit of op de CAM. Op dag 5 en 6, het was moeilijk om te vermijden dat de tumorcellen op het kippenembryo, wat resulteert in kuiken misvormingen of overlijden. Vanaf dag 9 werd de CAM helemaal bedekt onder het venster in de meeste eieren en ECM gel plaques bleek aanhanger van de CAM op het moment van de oogst. Daarom vonden we de ideale tijd voor inenting tot dag 9 van de embryonale ontwikkeling zijn.
Voor het bepalen van de ideale tijd van de oogst, SAOS2 en SW1353 werden na respectivel geoogsty 1, 2 (alleen SAOS2-GFP), 4, 5, 6, 7 en 8 dagen na inoculatie, of tussen embryonale ontwikkeling dag 10 en 17. Naar aanleiding van deze variaties, werd een verschil in lengte van de applicatie op de CAM opgemerkt 1-12 dagen.
Knighton gepubliceerd duidelijke verschillen in tumorgroei en tumor revascularisatie volgens de embryonale dag ontwikkeling op het moment van tumor voorbeeldtoepassing 17. Celtelling van Ki67-positieve en Ki67-negatieve cellen vertoonden een gestage toename van het totale aantal cellen van dag 4 voor beide cellijnen. Dit is overeenstemmend met de bevinding van Ausprunk et al.. 21, die verklaarde dat de periode die nodig is voor revascularisatie duurt 72 uur. Na het tellen van het aantal cellen en de berekening van de index van proliferatie, kunnen we aannemen dat de cellen gedispergeerd in de ECM gel actief prolifererende van dag 4 tot dag 6 na de inoculatie. Afhankelijk van de diameter van de plaque, het totale aantal cellen en de index vanproliferatie, stellen we voor dat de ideale tijd voor de oogst is dag 16 van de embryonale ontwikkeling, of zeven dagen na inoculatie.
De voorgestelde tijdsbestek laat onderzoekers een raam van zes dagen voor de toepassing van de agenten, terwijl de cellen zijn actief delende, hetzij eenmaal op dag 4 na enten of dagelijks gedurende het gehele tijdsbestek. Voor topische toediening wordt de verbinding aangebracht op het CAM oppervlak. Deze route is de meest gebruikte men wegens de toegankelijkheid van de CAM door het eenvoudig openen van de schalen / folie 22,23. Hoewel IV toediening haalbaar, de moeilijkheid om naalden te voegen in de CAM vaten is een kritische beperking. Zodra chemotherapie tijdens het experiment; kinase remmers worden toegepast op een dagelijkse basis 24. Onze hypothese is dat het toevoegen van een verbinding eenmaal is het equivalent van de klinische behandeling met cytotoxische van cytostatica, die klassiek eens in de 3 weken worden toegediend, terwijl het toevoegen vande verbinding op een dagelijkse basis wordt de dagelijkse dosis kinase inhibitors in de klinische setting weerspiegelen. Maar we moeten in gedachten houden dat lokale toediening verschillende kinetiek / metabolisme vergeleken met orale of intraveneuze toediening bij patiënten zal laten zien.
Betekenis van de techniek en de mogelijke toekomstige toepassingen
Behoud van celmorfologie is van groot belang als celkweken gebruikt in preklinische modellen. Het gebruik van homogene extracellulaire matrices zoals collageen type I 25 of ECM gel 26 herstelt de tumorcel-omgeving, waardoor een meer natuurlijke groeipatroon.
Anders dan in vivo assays, in vitro assays kan stromale cellen zoals angiogene vasculaire cellen, infiltrerende immuuncellen of kanker-geassocieerde fibroblast cellen moeten worden gereconstrueerd de tumorigene micromilieu 27 bevatten. Wanneer de CAM-assay wordt gebruikt voor het evaluation van tumorgrafts, hebben we een typische 'invasie cone' beschreven vanuit de CAM in de richting van de tumorgrafts, als gevolg van de aanwerving van stromale cellen van het kuiken door de Tumorgraft 14.
De CAM-assay heeft een combinatie van herstel van de extracellulaire matrix door ECM gel die gastheercellen voor de reconstitutie van het tumorigene micromilieu. Als de CAM en de Tumorgraft / plaque gemakkelijk toegankelijk zijn, de toediening van verbindingen is eenvoudig. Op deze manier kan de CAM-assay opent nieuwe perspectieven naar de preklinische beoordeling van zeldzame tumortypes zoals sarcomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Cellen van de SW1353 chondrosarcoma cellijn werden vriendelijk verschaft door prof. dr. PCW Hogendoorn en prof. dr. J. Bovee van de Universiteit Leiden, Nederland. Wij danken J. Mestach en G. Wagemans voor een uitstekende technische bijstand, en G. De Bruyne voor de professionele tekening van het overzicht van ons protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 | |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 | |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 | |
| G418 | Invitrogen | 11811031 | |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 | |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 | |
| PBS | Invitrogen | 20012019 | |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 | |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 | |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 | |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX | |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 | |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII | |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 | |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA | |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 | |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 | |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
References
- Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution. Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).
- Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas. Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).
- Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M.
- Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin. Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).
- Taylor, B. S., Barretina, J., et al. Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).
- Skubitz, K. M., D'Adamo, D. R.
- Nielsen, T. O., West, R. B. Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm. Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).
- Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).
- DeRose, Y. S., Wang, G., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Bertotti, A., Migliardi, G., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Decaudin, D. Primary human tumor xenografted models ('tumorgrafts') for good management of patients with cancer. Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Sys, G., Van Bockstal, M., et al. Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model. Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).
- Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines. Cancer Research. 42, 1826-1837 (1982).
- Deryugina, E., Quigly, J. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).
- Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J. Vis. Exp. (33), e1620 (2009).
- Balke, M., Neumann, A., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Research Notes. 3, 58 (2010).
- Hendrix, A., Maynard, D., et al. Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis. Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).
- Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels. American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).
- Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).
- Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).
- De Wever, O., Hendrix, A., et al. Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices. International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).
- Albini, A., Benelli, R. The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation. Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).
- Hanahan, D., Coussens, L. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
