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Medicine

Published: July 17, 2013 doi: 10.3791/50522
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 2, 2
1Department of Orthopaedic Surgery and Traumatology, Ghent University Hospital, 2Department of Radiation Oncology and Experimental Cancer Research, Ghent University, 3Department of Virology, Parasitology, and Immunology, Ghent University, 4Pathlicon

Summary

Abstract

सारकोमा सभी नए उपचारों के विकास में बाधा, प्रकृति में विषम है कि एक बहुत ही दुर्लभ बीमारी है. सारकोमा रोगियों को इस रोग के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और कम लागत xenotransplant मॉडल को विकसित करने में वर्तमान ब्याज समझा, स्तरीकरण के बाद व्यक्तिगत दवा के लिए आदर्श उम्मीदवार हैं. लड़की chorioallantoic झिल्ली प्रजाति विशेष के प्रतिबंध के बिना grafted ऊतकों और कोशिकाओं को बनाए रखने में सक्षम एक प्राकृतिक immunodeficient मेजबान है. इसके अलावा, यह आसानी से पहुँचा छेड़छाड़ और ऑप्टिकल और प्रतिदीप्ति stereomicroscopy उपयोग imaged है. प्रोटोकॉल आगे heterotypic सेलुलर बातचीत का विस्तृत विश्लेषण की अनुमति देता है.

इस प्रोटोकॉल में विस्तार से वर्णन किया गया है ताजा सार्कोमा व्युत्पन्न ट्यूमर ऊतकों, उनकी एकल कक्ष निलंबन, और स्थायी और क्षणिक fluorescently लेबल स्थापित सार्कोमा सेल लाइनों (Saos -2 और SW1353) के साथ chorioallantoic झिल्ली की ग्राफ्टिंग ओवो में. लड़की अस्तित्व चूहातों 75% तक कर रहे हैं. मॉडल भ्रष्टाचार (व्यवहार्यता, Ki67 प्रसार सूचकांक, परिगलन, घुसपैठ) और मेजबान (तंतुप्रसू घुसपैठ, संवहनी अंतर्वृद्धि) व्यवहार का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. एकल कक्ष निलंबन की ग्राफ्टिंग स्थानीयकृत लिए, ईसीएम जेल निष्क्रिय रोकथाम सामग्री से अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है. Ki67 प्रसार सूचकांक सीएएम की सतह से कोशिकाओं की दूरी और सीएएम, चिकित्सकीय उत्पादों के अलावा के लिए एक समय सीमा निर्धारित करने के उत्तरार्द्ध पर आवेदन की अवधि से संबंधित है.

Introduction

सारकोमा चिकित्सा प्रतिरोध 1,2 के कारण एक उच्च मृत्यु दर के साथ संयोजी ऊतक का एक दुर्लभ ट्यूमर है. रोगी अस्तित्व में प्रगति उनके कम वार्षिक घटना, उनके व्यापक विविधता, और सार्कोमा कोशिकाओं इन विट्रो 3,4 में संस्कृति के लिए मुश्किल होने की सूचना है कि इस तथ्य से प्रभावित होता है.

पूर्व नैदानिक ​​चिकित्सा मूल्यांकन के लिए संवर्धित कोशिकाओं का उपयोग इन विट्रो में नए, जाहिरा तौर पर सक्रिय अणुओं हमेशा नैदानिक ​​सेटिंग में परिणामों को नहीं दर्शाती है कि पता चला है. इसके अलावा, जीन अभिव्यक्ति से पता चला जीनोम aberrations हमेशा 5-7 व्यक्ति रोगी में ट्यूमर व्यवहार विशेषताओं के लिए सहसंबद्ध नहीं कर रहे हैं. इन समस्याओं के लिए प्रयास करें और हल करने के लिए, व्यक्तिगत दवा xenograft मॉडल 8-12 के लिए वृद्धि की खोज में परिलक्षित होता है जो महत्व है, में इजाफा हुआ है.

Vivo परख में एक ग के बीच जटिल परस्पर क्रिया को दर्शाती का लाभ दिया हैकैंसर के प्रसार और आक्रमण 13 के लिए आवश्यक ancer कोशिकाओं और ठोस ट्यूमर में मेजबान ऊतक वातावरण,. वर्तमान में हम सार्कोमा 14,15 के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य xenograft मॉडल के रूप में Chorio-allantoic झिल्ली परख (सीएएम परख) के उपयोग का अध्ययन. यह परख व्यापक रूप से ट्यूमर angiogenesis 16,17 के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है. अन्य अध्ययनों से अलग प्रोटोकॉल 18,19 के अनुसार विकास या angiogenesis में एक स्पष्ट अंतर मनाया जबकि साहित्य में, हालांकि, हम इस परख के लिए अलग अलग प्रोटोकॉल पाया है.

इस लेख में हम ट्यूमर ग्राफ्ट, ट्यूमर व्युत्पन्न एकल कक्ष निलंबन और स्थापित सार्कोमा सेल संस्कृतियों का उपयोग सेल व्यवहार पर सीएएम परख की शर्तों में परिवर्तन के प्रभाव की जांच.

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Protocol

एक सिंहावलोकन के लिए चित्रा 1 देखें.

ट्यूमर सामग्री

1. ट्यूमर के नमूने प्राप्त करने और तैयारी

रोगी सामग्री के उपयोग के लिए, नैतिक समिति के अनुमोदन के लिए आवश्यक है, और सूचित सहमति रोगी से प्राप्त हो गया है.

  1. हस्तक्षेप के समय फसल प्रतिनिधि सामग्री (कम से कम 1 सेमी 3), एक बायोप्सी या एक सार्कोमा की एक लकीर या तो. बायोप्सी की उचित साइट गतिशील विपरीत एमआरआई का उपयोग कर परिभाषित किया गया है.
  2. DMEM के 1,000 यू पेनिसिलीन और 1 मिलीग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक युक्त एक बाँझ शीशी में तुरंत सामग्री रखें.
  3. प्रयोगशाला के लिए - तुरंत शीशी (90 मिनट 30) परिवहन.

सभी निम्नलिखित प्रक्रियाओं लामिना का प्रवाह के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं.

  1. एक बाँझ पेट्री डिश में शीशी की सामग्री डालो.
  2. ज़्यादा से ज़्यादा 1 के छोटे भागों में ट्यूमर नमूना रखोएक बाँझ स्केलपेल का उपयोग 3 मिमी. वे ऊतक की आगे की प्रक्रिया क्षीण करते हैं सब calcified भागों निकालें.
  3. अनियमित सीएएम पर आवेदन के लिए 10 ट्यूमर ग्राफ्ट ले.

2. ट्यूमर व्युत्पन्न एकल कक्ष निलंबन की तैयारी

लगभग अवधि: 3 घंटा

  1. नमूना के शेष ऊतक वजन.
  2. 2 रखो - एक dissociator ट्यूब में ऊतक के 4 ग्राम, एक से अधिक ट्यूब शेष सभी ट्यूमर के ऊतक को पचाने के लिए आवश्यक हो सकता है.
  3. 2 के पाचन के लिए - ऊतक के 4 ग्राम, 2.5 मिलीग्राम collagenase 2 समाधान (500 यू / मिलीलीटर RPMI 1640) और 2.5 मिलीलीटर DNase समाधान (22 यू / मिलीलीटर RPMI 1640) जोड़ें.
  4. Dissociator h_tumor प्रोटोकॉल के अनुसार ऊतक की प्रक्रिया. ट्यूब 30 मिनट के लिए धीरे हिल रहा है, जबकि यह 37 पर ऊष्मायन के 2 चक्र ° सीओ 2 इनक्यूबेटर में सी शामिल है.
  5. एक 150 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से शेष निलंबन फ़िल्टर.
  6. 5 मीटर के लिए 1000 rpm पर lysate अपकेंद्रित्रअंदर
  7. सतह पर तैरनेवाला निकालें.
  8. नियमित रूप से निलंबन के साथ ऊष्मायन के 10 मिनट की अनुमति, एरिथ्रोसाइट lysis बफर (ईएलबी) के 10 मिलीलीटर में गोली Resuspend.

नोट: एरिथ्रोसाइट lysis बफर प्रकार के रूप में निर्मित है: 0.037 छ EDTA, 0.99 ग्राम कश्मीर 2 4 HPO, 1000 मिलीलीटर पानी के लिए 8.29 ग्राम एनएच 4 सीएल जोड़ें, एक 0.22 माइक्रोन के माध्यम से दबाव में फिल्टर, 7.3 पीएच को समायोजित करने के लिए 10 एन NaOH उपयोग फिल्टर. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर

  1. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए संस्कृति मध्यम (DMEM 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन, और 100 ग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक) के 25 मिलीलीटर जोड़ें.
  2. 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर निलंबन अपकेंद्रित्र. गोली का रंग अब सफेद होना चाहिए.
  3. सतह पर तैरनेवाला निकालें.
  4. गोली के लिए माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें. एक 70 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से निलंबन फ़िल्टर.
  5. एक स्वचालित सेल काउंटर के माध्यम से जीवित कोशिकाओं / एमएल की संख्या की गणना.

3.कैंसर सेल लाइन्स

SAOS2 ऑस्टियो सार्कोमा कोशिकाओं (ATCC संख्या: HTB-85) बढ़ाया हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार सेल लाइन Nucleofector किट वी का उपयोग कर pEGFP-C1 वेक्टर द्वारा electroporated थे. स्थिर सेल लाइनों की स्थापना करने के लिए, कोशिकाओं पिछले स्थापित प्रोटोकॉल 20 के साथ लाइन में 4 हफ्तों के लिए G418 (1 मिलीग्राम / एमएल) में चयन किया गया था. इसके अलावा छँटाई निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) द्वारा किया गया था.

SW1353 उपास्थि का एक दुर्दम अर्बुद सेल लाइन (ATCC संख्या: HTB-94) से कोशिकाओं या हौसले से तैयार ट्यूमर एकल कक्ष निलंबन एक लाल फ्लोरोसेंट lipophilic झिल्ली दाग ​​का उपयोग कर चिह्नित कर रहे हैं.

  1. समाधान, ट्रिप्सिन (0.5% wt / खंड) ethylenediaminetetraacetic एसिड (0.2% wt / खंड EDTA) का उपयोग कर एक शास्त्रीय रास्ते में संस्कृति कुप्पी से कोशिकाओं को निकाल दें.
  2. 1,000 rpm पर 5 मिनट के लिए सेल निलंबन अपकेंद्रित्र.
  3. सुपर निकालेंउतरानेवाला.
  4. सीरम मुक्त मध्यम और 5 μl DiI (Vybrant लाल) / 10 6 कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
  5. एल्यूमीनियम पन्नी में शीशी लपेटें और 37 पर 10 मिनट डिग्री सेल्सियस के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में रख दिया
  6. 1,000 rpm पर 5 मिनट के लिए फिर से अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटायें.

Chorioallantoic झिल्ली परख

1. अंडे की ऊष्मायन

  1. अंडे का 95% निषेचन की गारंटी के एक स्थानीय वाणिज्यिक हैचरी से निषेचित अंडे के लिए आवश्यक हैं.
  2. निषेचित अंडे 10 दिनों के लिए आरटी पर भंडारित किया जा सकता है.

नोट: ऊष्मायन शुरू करने से पहले, गंदगी, पंख और मलमूत्र ध्यान से नहीं बल्कि एक नरम सतह की संरचना की तुलना में किसी न किसी प्रकार है जो कागज तौलिये, साथ शुष्क पोंछते द्वारा यंत्रवत् अनावश्यक कार्य से हटा रहे हैं. 70% विकृत इथेनॉल या किसी भी अन्य सफाई अभिकर्मक के साथ अंडे पोंछते काफी लड़की भ्रूण के जीवित रहने की दर कम कर देता है.

  1. Incu में अंडे रखोऊपरी सतह अंकन एक तरफ Bator,. अंडे इनक्यूबेटर में डाल रहे हैं जिस दिन भ्रूण के विकास के दिन 0 नामित है.
  2. 37.8 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन तापमान, और 47% से कम नमी निर्धारित करें. स्वचालित रोटेशन विकल्प बंद है सुनिश्चित करें.

2. अंडे का उद्घाटन

अवधि: 25 अंडे के लिए ± 60 मिनट

विकास 3 दिन, अंडे लामिना airflow के तहत खोल रहे हैं. झिल्ली खोल करने के लिए छड़ी के लिए जाता है, के रूप में सीएएम को नुकसान में और विकास मंच के परिणामों पर अंडे खोलना. एक अवरक्त दीपक प्रक्रिया के दौरान अंडों को गर्म रखने के लिए प्रयोग किया जाता है. बाँझपन में सुधार करने के लिए, हम हाथ दस्ताने के उपयोग की सलाह देते हैं.

  1. ऊपर की ओर का सामना करना पड़ उल्लेखनीय पक्ष के साथ, अंड की पात्र में अंडे रखें.
  2. अंडे की नोक पर डाला एक 18 जी सुई के माध्यम से अंडे की सफ़ेदी के दो मिलीलीटर निकाल कर सीएएम का स्तर कम है. सुई कई perforating के बाद कुंद हैअनावश्यक कार्य, सुई की जगह. यदि नहीं, तो बहुत अधिक बल अंडे की जर्दी या खोल के फ्रैक्चर को क्षति पहुंचती exerted किया जाना है. कभी कभी सुई chalazae, अंडे की सफ़ेदी में जर्दी निलंबित 2 सर्पिल बैंड के द्वारा अवरुद्ध है. इस ब्लॉक का समाधान होने तक धीरे वापस नीचे सवार धक्का द्वारा हल किया जा सकता है. अंडे की जर्दी सिरिंज में ले लिया गया है, तो सुई के साथ ही सिरिंज जगह. कभी कभी भ्रूण इस घटना के बाद मर जाता है. अंडे की सफ़ेदी के एक अपर्याप्त राशि निकाल दिया जाता है, तो खोल निकाल दिया जाता है, सीएएम क्षतिग्रस्त हो जाएगा.
  3. खिड़की काटने जबकि सीएएम पर खोल कणों की spilling रोकने के लिए खोल के रूप में चिह्नित ऊपरी पक्ष में एक semipermeable चिपकने वाली फिल्म लागू करें.
  4. अंडे की सतह पर एक छोटा सा सूआ के साथ एक परिचय छेद बनाओ.
  5. बाँझ तेज बताया शल्य कैंची की एक जोड़ी का उपयोग, खोल में 1 सेमी 2 की एक खिड़की में कटौती.
  6. भ्रूण की धमाकेदार दिल और आसपास के जहाजों टी में मनाया जा सकता हैअंडे की जर्दी का वह सतह. गैर निषेचित अंडे या मृत भ्रूण निकालें. रक्त वाहिकाओं के एक बाधित पहलू मृत भ्रूण की विशेषता है.
  7. एक semipermeable चिपकने वाली फिल्म के साथ खिड़की सील. खोल सुई की प्रविष्टि के दौरान टूट गया है, जब तक यह पंचर साइट को कवर करने के लिए आवश्यक नहीं है.

3. टीका प्रक्रिया

अवधि: सेल लाइन प्रति ± 1 घंटा

लड़की भ्रूण विकास के दिन 9, अंडे लामिना airflow के तहत टीका कर रहे हैं.

सांचा भर में फैल कैंसर कोशिका का मूल्यांकन टीका के दौरान एक सीमित सतह कोशिकाओं की रोकथाम की आवश्यकता है. Matrigel अक्सर प्रयोगात्मक सेल संस्कृति की स्थिति में इस्तेमाल किया Engelbreth-होल्म-झुंड माउस सार्कोमा से एक बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) जेल है. यह ठंडा जब एक तरल पदार्थ है, लेकिन 20 के लिए लाया जब उष्मा इकाई सक्रिय polymerization से गुजरना होगा - 40 डिग्री सेल्सियस, इस प्रकार एक स्थिर जेल बनाने. ड्यूरिनजी प्रयोगों, Matrigel बर्फ पिघलने वाले बॉक्स में रखा जाता है.

नोट: हम छिद्रित coverslips का उपयोग नहीं करने के लिए जोर देते हैं. हम इस तरह की झिल्ली पर ही कोशिकाओं के विकास को संभावित biasing प्लास्टिक डिस्क पर लगाव और grafted कैंसर कोशिकाओं के विकास को मनाया.

  1. 10 6 cells/100 μl ईसीएम जेल के एक एकाग्रता में ठंडा ईसीएम जेल में एक सेल गोली Resuspend. बर्फ पिघलने पर इस समाधान रखें.
  2. लामिना airflow के तहत बाँझ शल्य चिकित्सा की एक जोड़ी के साथ अर्द्ध पारगम्य झिल्ली के आबकारी हिस्सा. चिपकने वाली फिल्म पूरी तरह से हटा दिया जाता है, इस संक्रमण के कारण भ्रूण की मौत का एक बड़ा अनुपात में परिणाम होगा.
  3. उपकला कोशिका परत को हटाने के क्रम में, एक बाँझ गिलास छड़ी के साथ हल्के से खोल खिड़की से नीचे सीएएम सही स्पर्श करें. एक बाँझ गिलास छड़ी के साथ सीएएम मार्मिक एक छुरी एन ° 11, अधिक handiness और अनुभव की आवश्यकता है जिसके उपयोग से भी कम दर्दनाक साबित होता है. लघु हेमोरेज हो सकती है.
  4. ट्यूमर सामग्री जोड़ना.
  5. ट्यूमर grafts के लिए: यह निचोड़ बिना बाँझ संदंश की एक जोड़ी के साथ सांचा पर ऊतक का धीरे कम एक टुकड़ा.
  6. ईसीएम जेल प्रक्रिया के लिए: ईसीएम जेल अनुप्रयोगों के बीच में भाजन करने की इजाजत दी, एक दूसरे के शीर्ष पर, सीएएम के लिए सेल ईसीएम जेल निलंबन की 4x 25 μl जोड़ें. इस रास्ते में कैंसर कोशिकाओं से युक्त एक पक्षपाती पट्टिका बनाई गई है.
  7. एक semipermeable चिपकने वाली फिल्म के साथ फिर से खोल खिड़की सील.

4. इमेजिंग और सीएएम की कटाई

अवधि: 25 अंडे के लिए 2 घंटा

लड़की भ्रूण विकास के दिन 16, cams खेती कर रहे हैं. लामिना airflow के तहत कार्य करना आवश्यक नहीं है.

  1. शल्य कैंची की एक जोड़ी के साथ खिड़की बढ़ा करें. घायल वाहिकाओं का खून बह रहा है, जिसके परिणामस्वरूप अन्यथा सीएएम क्षतिग्रस्त हो जाएगा, बहुत कम कटौती नहीं करने के लिए सुनिश्चित करें.
  2. 300 जोड़ें - पीबीएस डी के 500 μl सीएएम सेकंड पर एक विंदुक के साथटीका सामग्री युक्त मोर्चे. कोई फ्लोरोसेंट जांच इस्तेमाल कर रहे हैं तो यह झिल्ली कड़ी में आता है, के रूप में बफर फॉर्मेल्डीहाइड झिल्ली के काटने की सुविधा इस्तेमाल किया जा सकता है.
  3. GFP या DSR फिल्टर, और कोई फिल्टर का उपयोग दोनों एक डिजिटल कैमरा रंग से सुसज्जित एक स्टीरियो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप,, के माध्यम से अंडे में सीएएम की एक तस्वीर बना. ट्यूमर grafts के लिए, सभी तस्वीरों बिना फिल्टर किया जाता है. एलईडी रोशनी से ऊपर से रोशनी दृढ़ता (चित्रा 2) photographing के दौरान की सिफारिश की है.
  4. लेबल कोशिकाओं रिकॉर्ड ट्यूमर सेल प्रवास. ट्यूमर की सीमाओं अनियमित और अस्तव्यस्त हो सकता है. आंशिक रूप से कोशिकाओं को ट्यूमर की सीमाओं के पास मौजूद हो सकता है. कुछ नमूनों में, ट्यूमर कोशिकाओं की पंक्तियों (चित्रा 3) देखा जा सकता है.
  5. खोल के खिलाफ झूठ बोल सीमा पर बाँझ कैंची की एक जोड़ी के साथ झिल्ली कट.
  6. पीबीएस डी से भरा एक बाँझ पेट्री डिश में काटा सांचा रखें या के लिए बफरrmaldehyde.
  7. ऊपरी तरफ और साथ और फिल्टर के बिना दोनों सीएएम के निचले पक्ष, दोनों की एक तस्वीर बना.
  8. कम से कम 72 घंटे के लिए बफर formaldehyde के साथ एक लेबल कंटेनर में झिल्ली रखो.
  9. आयल में CAMs एम्बेड और ऊतकीय परीक्षा के लिए उन्हें तैयार करते हैं. कटौती की सतह कैसेट के तल के समानांतर है, यकीन है कि गुत्थी के केंद्र में ट्यूमर ग्राफ्ट कटौती करने के लिए ध्यान रखना. यदि नहीं, सीएएम और ट्यूमर भ्रष्टाचार के बीच बातचीत नहीं दिखाई देंगे. इसी रणनीति ईसीएम जेल सजीले टुकड़े करने के लिए लागू होता है: काटने ब्लेड का सामना करना पड़ सतह पट्टिका के लिए खड़ा होना चाहिए.

5. ऊतकीय मूल्यांकन

अगर जरूरत hematoxylin-eosin धुंधला और की 67 immunohistochemistry, आगे स्पष्टीकरण के लिए प्रदर्शन किया गया. Immunohistochemistry एक स्वचालित स्लाइड बदनाम करने वाला accordin का उपयोग कर, मोटाई में 3.5 माइक्रोन की formalin-तय आयल एम्बेडेड ऊतक वर्गों पर प्रदर्शन किया गया थानिर्माता के निर्देशों के छ. की 67 (क्लोन एमआईबी -1, कमजोर पड़ने 1/100) के लिए एक माउस प्राथमिक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया गया था. गर्मी प्रेरित मिलान पुनर्प्राप्ति सेल कंडीशनिंग 1 का उपयोग किया गया था, और दृश्य यूनिवर्सल थपका जांच किट के साथ हासिल की थी, निर्माता के निर्देशों के अनुसार. ऊतक वर्गों के Dehydratation एक स्वचालित coverslipper का उपयोग किया गया था.

SAOS2 और SW1353 सेल लाइनों के लिए, Ki67 पॉजिटिव और Ki67 नकारात्मक सेल nuclei/100 माइक्रोन 2 की संख्या तीन क्षेत्रों में गिना गया: एक करीबी सीएएम की सीमा तक, एक के केंद्र में सतह और एक बंद ईसीएम जेल पट्टिका. यह प्रक्रिया प्रत्येक की 67 दाग स्लाइड के लिए 6x दोहराया गया था. प्रसार के सूचकांक में गिना कोशिकाओं की कुल संख्या से Ki67 पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या से विभाजित करके प्रत्येक स्लाइड के लिए निर्धारित किया गया था.

परिगलन सनक के साथ सेल नाभिक में chromatin के ठीक फैलाव का नुकसान, द्वारा परिभाषित किया गया हैअलग सेल हाशिये की रही. Xenografts के लिए, परिगलन पूरा, (अक्सर सतह पर) आंशिक, या अनुपस्थित रूप में रन बनाए है. सीएएम में ट्यूमर कोशिकाओं की घुसपैठ सीएएम के मध्य त्वक स्तर के भीतर ट्यूमर कोशिकाओं के अवलोकन से परिभाषित किया गया है, और उपस्थित या अनुपस्थित होने के रूप में रन बनाए है.

तीन आइटम मेजबान व्यवहार के लिए बना रहे हैं. Fibroblast घुसपैठ लम्बी कोशिकाओं सीएएम जा रही है और ट्यूमर भ्रष्टाचार / पट्टिका पर हमले के रूप में परिभाषित किया गया है, और उपस्थित या अनुपस्थित होने के रूप में रन बनाए है. संवहनी अंतर्वृद्धि केन्द्रक लड़की एरिथ्रोसाइट्स की उपस्थिति की विशेषता लड़की जहाजों, proliferating के कुदी तसवीर की छाप के रूप में देखा जा सकता है.

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Representative Results

सीएएम का मूल्यांकन

ट्यूमर ग्राफ्ट सीएएम (2A चित्रा) के अनुयायी बन गए. रोगी सामग्री से एकल कक्ष निलंबन अक्सर एक सूखे, थोड़ा उठाया पट्टिका (चित्रा 2 डी) प्रदर्शित करते हैं. सीएएम के छांटना के बाद, झिल्ली के wrinkling (2 ई और 2 एफ आंकड़े) होता है चिह्नित.

वाणिज्यिक सेल लाइनों के लिए पट्टिका सेल प्रसार का संकेत है, समय में अधिक अपारदर्शी हो जाता है. ईसीएम जेल में अलग सेल लाइनों सीएएम पर एक अलग विकास पैटर्न है. GFP संकेत मजबूत बनी हुई है, जबकि SAOS2 व्यवहार्य कोशिकाओं का संकेत है, टीका के बाद सुबह 7 से सतह का एक अलग वृद्धि के साथ, एक प्रसार पट्टिका रूपों. SAOS2 कोशिकाओं के प्रवास सीएएम के जहाजों के लिए कल्पना समानांतर (चित्रा 3) हो सकता है. कोई फिल्टर किया जाता है जब stereomicroscope के माध्यम से देखा है, जब रक्त वाहिकाओं को देखा जा सकता है. जब कोई च ट्यूमर कोशिकाओं को पहचाना नहीं जा सकताilter प्रयोग किया जाता है. यह एक GFP फिल्टर डाला जाता है जब रक्त वाहिकाओं कल्पना करना संभव नहीं है. बंद फिल्टर पर मोड़ और करके, पलायन कोशिकाओं और रक्त वाहिकाओं के बीच निकट संपर्क में देखा जा सकता है. Punctiform रक्तस्राव पट्टिका (चित्रा 4, के माध्यम से देखा जा सकता है पंक्तियों 1 और 2). SW1353 कोशिकाओं से युक्त सजीले टुकड़े सतह में कमी दिखाने के लिए और यह (चित्रा 4, पंक्तियों 5 और 6) कटाई के बाद एक झुर्रियों वाली झिल्ली में जिसके परिणामस्वरूप, सीएएम अनुबंध करने के लिए करते हैं. फ्लोरोसेंट जांच कई कोशिका विभाजन के बाद पतला हो जाता है के रूप में dsr के संकेत कम हो जाती है. सुबह 7 से खून बह रहा है बार बार मनाया जाता है. खून बह रहा होता है, तो dsr के संकेत भी कम हो जाती है.

संवहनी प्रतिक्रिया भ्रष्टाचार या पट्टिका (चित्रा 2) के आसपास के कपटपूर्ण वाहिकाओं दिखा, कम देखने में सीएएम के छांटना के बाद देखे जा सकते हैं. सीएएम के संवहनी प्रतिक्रिया Tumorgraft समूह, एकल कक्ष निलंबन समूह (<में मनाया जाता हैमजबूत> चित्रा -2 और 2 एफ) और ईसीएम जेल नियंत्रण समूह (चित्रा 2 जी), लेकिन नहीं सेल समाधान नियंत्रण समूहों में (चित्रा 2H). नई कपटपूर्ण वाहिकाओं शाखाओं में बंटी (चित्रा 2I, तीर) और anastomosing (चित्रा 2I, नमूना प्रवेश कर देखा जा सकता है भी रक्तस्राव के छोटे क्षेत्रों (चित्रा 2I, तीर) होते हैं, एक दूसरे के साथ तारक). ट्यूमर के neovascularization ट्यूमर / ट्यूमर पट्टिका के विभिन्न क्षेत्रों में एच एंड ई स्लाइड पर मात्रा निर्धारित किया जा सकता है.

ऊतकीय सबूत SAOS2 कोशिकाओं एक वृद्धि की मोटाई और पट्टिका का व्यास, जिससे ईसीएम जेल की पूरी मात्रा में एक एकल कक्ष उपस्थिति बनाए रखना है दिखाता है. वे इस तरह एक खोलने जिपर तरह endodermal और सीएएम की बहिर्जनस्तरीय परतों के बीच की दूरी (चित्रा 5A विस्तार, सीएएम के mesodermal परत (चित्रा 5 ए, तीर) पर आक्रमण (चित्रा 5 ब, तीर) के साथ, क्लस्टर है. कोशिकाओं और सेल समूहों की संख्या समय में तेजी से वृद्धि हुई है, और विशेष रूप से पट्टिका की सतह पर सुबह 7 से गैर proliferative कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती. SW1353 के लिए, सीएएम के संकुचन भी SAOS2 के एच एंड ई स्लाइड जब की तुलना में एच एंड ई स्लाइड पर सराहना की जा सकती.

विकास के अपने अस्थानिक साइट के होते हुए भी, हम आवश्यक सुविधाओं और मूल सार्कोमा ट्यूमर के immunohistochemical विशेषताओं सीएएम में बनाए रखा गया है कि पाया. ट्यूमर ग्राफ्ट विश्वसनीयता और robu illustrating, सीएएम मेजबान ऊतक घुसपैठ भ्रष्टाचार से लड़की fibroblasts और ट्यूमर कोशिकाओं द्वारा घुसपैठ हो जाते केन्द्रक लड़की एरिथ्रोसाइट्स की उपस्थिति, इसका सबूत के रूप में इसके अलावा ट्यूमर ग्राफ्ट revascularized बननेसीएएम परख की stness (चित्रा 6, इनसेट निचले बाएं). आगे की विस्तृत जानकारी के लिए हम व्यवस्था एट अल के लिए देखें. 14.

फसल के समय

Ki67 पॉजिटिव और Ki67 नकारात्मक कोशिकाओं की कोशिका गिनती सेल लाइनों दोनों के लिए सुबह 4 से कोशिकाओं की कुल संख्या में लगातार वृद्धि से पता चलता है. इस दिन के बाद कोशिकाओं की कुल संख्या स्थिर बनी हुई है. सात दिनों टीका के बाद, Ki67 पॉजिटिव कोशिकाओं और कोशिकाओं की कुल संख्या की संख्या में गिरावट शुरू होता है. कोशिकाओं की संख्या के संबंध में, तीन क्षेत्रों के बीच एक महत्वपूर्ण संबंध है. हालांकि, Ki67 पॉजिटिव करीब सीएएम के लिए कोशिकाओं, और पट्टिका की सतह पर Ki67 नकारात्मक कोशिकाओं का एक बड़ा अनुपात का एक बड़ा अनुपात (चित्रा 4, पंक्तियों 3, 4, 7 और 8) मनाया जाता है.

प्रसार का सूचकांक सात दिनों टीका के बाद जब तक अपेक्षाकृत स्थिर बनी हुई है, यह भी गिरावट शुरू होता है whereafter. proliferatioSW1353 सेल लाइन के n सूचकांक काफी कम है (पी <0.05) SAOS2 सेल लाइन की तुलना में.

तीन क्षेत्रों के बीच एक महत्वपूर्ण संबंध है हालांकि हम करीब सीएएम को Ki67 पॉजिटिव कोशिकाओं का एक बड़ा अनुपात और Ki67 नकारात्मक का एक बड़ा अनुपात का पालन के रूप में, यह, ईसीएम जेल पट्टिका में सभी तीन क्षेत्रों में खेतों गिनती करने के लिए आवश्यक है पट्टिका की सतह पर कोशिकाओं (चित्रा 7).

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रोटोकॉल का अवलोकन. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2 चित्रा 2. फोटो फसल के दौरान लिए गए एक उपास्थि का एक दुर्दम अर्बुद से एक Tumorgraft की कटाई ऊपरी पंक्ति चिंताओं:. एक = बगल में, बी पेट्री डिश, सी में = ऊपरी दृश्य पेट्री डिश में = कम देखने. ईसीएम जेल में एक एकल कक्ष निलंबन की कटाई मध्य पंक्ति चिंताओं: डी = बगल में, ई पेट्री डिश में = ऊपरी दृश्य, एफ = कम देखने. लोअर पंक्ति जी = Matrigel नियंत्रण, एच = सेल समाधान नियंत्रण, मैं शाखाओं में बंटी वाहिकाओं और खून बह रहा है प्रदर्शित = कम देखने. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. SAOS2 के GFP तस्वीर

चित्रा 4
4 चित्रा. टीका. पंक्ति 1 (पैमाने बार 2 मिमी) GFP फिल्टर के साथ एक stereomicroscope के माध्यम से बगल में सीएएम की तस्वीरों से पता चलता है के बाद यह आंकड़ा 8 से दिन 1 बजे SAOS2 (4 पंक्तियों ऊपरी) और SW1353 दोनों की तस्वीरें (4 पंक्तियों कम) से पता चलता है. पंक्ति 2 (पैमाने बार 2 मिमी) ऊपर से एल ई डी द्वारा प्रबुद्ध जबकि stereomicroscope के माध्यम से एक ही नमूनों से पता चलता है. पंक्ति 3 और 4 एच एंड ई (पंक्ति 3, पैमाने बार 200 माइक्रोन) और Ki67 से सना हुआ दिखाने (पंक्ति 4, पैमाने बार 200 या 500 माइक्रोन) एक ही नमूने हैं. पंक्ति 5 (पैमाने बार 2 मिमी) से ऊतकीय छवियों dsr के फिल्टर के साथ एक stereomicroscope के माध्यम से बगल में सीएएम की तस्वीरों से पता चलता है. पंक्ति 6 (एसयुक्ति बार 2 मिमी) ऊपर से एल ई डी द्वारा प्रबुद्ध जबकि stereomicroscope के माध्यम से एक ही नमूनों से पता चलता है. पंक्ति 7 और 8 एच एंड ई (पंक्ति 7, पैमाने बार 200 माइक्रोन) और Ki67 से सना हुआ दिखाने (पंक्ति 8, पैमाने बार 200 और 500 माइक्रोन) एक ही नमूनों से ऊतकीय छवियों. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 5
चित्रा 5. SAOS2 और SW1353 के ट्यूमर सेल प्रसार की तुलना करें. SAOS2 के एक = वृद्धि बी = SW1353 का विकास.

चित्रा 6
6 चित्रा. कम nucleated लड़की एरिथ्रोसाइट्स (एचई, 100X) एक उच्च ग्रेड liposarcoma Tumorgraft भर केशिकाओं में मनाया जा सकता है, इनसेटछोड़ दिया है.

7 चित्रा
चित्रा 7. दोनों सेल लाइनों के लिए सीएएम से दूरी के अनुसार समय के साथ + और ​​Ki67 कोशिकाओं Ki67 दिखा. जोन सीएएम के खिलाफ एक = ग्राफ़, जोन सी पट्टिका का = सतह, जोन बी = बीच में जोन ए और सी.

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Discussion

टीका और फसल का समय

टीकाकरण के दिन ईसीएम जेल (36 cams) में SAOS2 का उपयोग किया और भ्रूण विकास के दिन 5 और 10 के बीच विभिन्न था समय.

ऊष्मायन सुबह 9 से पहले, सीएएम लगातार हम लागू ईसीएम जेल का समर्थन करने के लिए पर्याप्त नहीं था. फसल में, ट्यूमर कोशिकाओं कभी कभी गहरी सीएएम से पुनः प्राप्त किया जा सकता था, और कुछ ईसीएम जेल नमूने अंडे की सफ़ेदी में या सीएएम पर ढीला झूठ बोल रहे थे. दिन 5 और 6 पर, यह लड़की विरूपताओं या मौत में जिसके परिणामस्वरूप, लड़की भ्रूण पर ट्यूमर कोशिकाओं डालने से बचने के लिए मुश्किल था. सुबह 9 से, सीएएम पूरी तरह से सबसे अधिक अंडे में खिड़की के नीचे की सतह को कवर किया गया था, और ईसीएम जेल सजीले टुकड़े फसल के क्षण में सीएएम के अनुयायी साबित कर दिया. इसलिए, हम भ्रूण के विकास की 9 दिन होने की टीका के लिए आदर्श समय मिला.

कटाई का आदर्श समय के निर्धारण के लिए, SAOS2 और SW1353 respectivel के बाद काटा गयावाई 1, 2 (SAOS2-GFP केवल), 4, 5, 6, 7 और 8 दिन बाद टीका, या 10 भ्रूण विकास के दिन और 17 के बीच. 12 दिन - इन बदलावों के बाद, सीएएम पर आवेदन की लंबाई में एक फर्क 1 से उल्लेख किया गया था.

नाईटन ट्यूमर नमूना आवेदन 17 के क्षण में भ्रूण के विकास के दिन के अनुसार ट्यूमर के विकास और ट्यूमर revascularization में चिह्नित मतभेद प्रकाशित. Ki67 पॉजिटिव और Ki67 नकारात्मक कोशिकाओं की गिनती सेल सेल लाइनों दोनों के लिए सुबह 4 से कोशिकाओं की कुल संख्या में लगातार वृद्धि देखी गई. इस Ausprunk एट अल की खोज के साथ सहमत है. Revascularisation के लिए आवश्यक अवधि 72 घंटा लेता है कि जो कहा गया है, 21. कोशिकाओं और प्रसार के सूचकांक की गणना की संख्या की गणना करने के बाद, हम ईसीएम जेल में छितरी हुई कोशिकाओं को सक्रिय रूप से टीका के बाद सुबह 6 तक दिन 4 से proliferating हैं कि ग्रहण कर सकते हैं. पट्टिका का व्यास, कोशिकाओं की कुल संख्या और के सूचकांक के आधार परप्रसार, हम फसल के लिए आदर्श समय भ्रूण के विकास, या सात दिनों टीका के बाद के दिन 16 सुझाव है कि.

कोशिकाओं को सक्रिय रूप से एक बार 4 दिन पर, या तो proliferating हैं जबकि सुझाए गए समय सीमा के टीका के बाद या दैनिक पूरे समय सीमा के दौरान शोधकर्ताओं एजेंटों के आवेदन के लिए छह दिनों की एक खिड़की छोड़ देता है. सामयिक प्रशासन के लिए, यौगिक सीएएम सतह पर लागू किया जाता है. यह मार्ग सबसे अधिक बस खोल / चिपकने वाली फिल्म 22,23 खोलकर कारण सांचा के लिए पहुँच के लिए, एक प्रयोग किया जाता है. चतुर्थ प्रशासन संभव है, सीएएम वाहिकाओं में सुई डालने के लिए कठिनाई का एक महत्वपूर्ण सीमा है. Kinase inhibitors एक दैनिक आधार पर 24 लागू कर रहे हैं, कीमोथेरपी एक बार प्रयोग के दौरान. उनका कहना है, जब तक हम एक यौगिक जोड़कर एक बार प्रतिष्ठित हर 3 सप्ताह एक बार प्रशासित रहे हैं जो cytostatic एजेंटों के साइटोटोक्सिक साथ चिकित्सीय उपचार के बराबर है कि परिकल्पनाएक दैनिक आधार पर परिसर नैदानिक ​​सेटिंग में kinase inhibitors की दैनिक खुराक को प्रतिबिंबित करेगा. हालांकि, हम सामयिक प्रशासन रोगियों में मौखिक या चतुर्थ प्रशासन के साथ तुलना में अलग कैनेटीक्स / चयापचय दिखा देंगे कि दिमाग में रखना चाहिए.

तकनीक और संभव भविष्य अनुप्रयोगों का महत्व

सेल संस्कृतियों preclinical मॉडल में इस्तेमाल किया जाता है जब सेल आकारिकी के संरक्षण के प्रधानमंत्री महत्व का है. ऐसे कोलेजन प्रकार मैं 25 या ईसीएम जेल 26 के रूप में सजातीय कोशिकी matrices का उपयोग एक अधिक प्राकृतिक वृद्धि पद्धति की अनुमति, ट्यूमर सेल पर्यावरण पुनर्स्थापित करता है.

विवो assays में के विपरीत, इन विट्रो assays में इस तरह पुनर्गठित tumorigenic microenvironment के 27 के लिए आवश्यक प्रतिरक्षा कोशिकाओं या कैंसर से जुड़े तंतुप्रसू कोशिकाओं घुसपैठ वाहिकाजनक संवहनी कोशिकाओं, के रूप में stromal कोशिकाओं शामिल नहीं है. सीएएम परख evaluat के लिए प्रयोग किया जाता हैtumorgrafts के आयन, हम Tumorgraft 14 से लड़की से stromal कोशिकाओं की भर्ती को दर्शाती है, tumorgrafts ओर सीएएम से एक ठेठ 'आक्रमण कोन' का वर्णन किया है.

सीएएम परख ईसीएम जेल से बाह्य मैट्रिक्स बहाल करने और tumorigenic microenvironment के पुनर्गठन के लिए मेजबान कोशिकाओं प्रदान करने का एक संयोजन प्रदान करता है. सीएएम और Tumorgraft / पट्टिका सहज सुलभ हैं, यौगिकों के प्रशासन के लिए आसान है. इस तरह, सीएएम परख ऐसे sarcomas के रूप में दुर्लभ प्रकार के ट्यूमर के preclinical मूल्यांकन के प्रति नया दृष्टिकोण को खोलता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

SW1353 उपास्थि का एक दुर्दम अर्बुद सेल लाइन की कोशिकाएं कृपया प्रो डॉ. PCW Hogendoorn और Leiden विश्वविद्यालय, नीदरलैंड के प्रो डॉ. जे Bovée द्वारा प्रदान किया गया. हम अपने प्रोटोकॉल के अवलोकन के पेशेवर ड्राइंग के लिए जे Mestach और जी Wagemans उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए, और जी डी Bruyne धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Line Nucleofector Kit V Amaxa VCA-1003
collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) Sigma Aldrich C6885
DMEM Invitrogen 41965-039
DMSO Sigma D8418
Dnase solution Sigma Aldrich DN25
G418 Invitrogen 11811031
Matrigel Sigma-Aldrich E1270
mouse primary monoclonal antibody Ki67 Dako Denmark MIB-1
Paraformaldehyde Fluka D76240
PBS Invitrogen 20012019
PBSD Invitrogen 14040083
peGFP-C1 vector Clontech 632470
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140163
RPMI Invitrogen 22409-015
Trypsin-EDTA solution Invitrogen 25300054
Vybrant cell-labeling DiI Lifetechnologies 22885
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10227
digital color camera Leica DFC 340 FX
Digital Egg Incubator Auto Elex Co R-COM 50
FACS BD Biosciences FACSAriaIII
Gentlemacs C-Tube Miltenyi Biotech 130-093-237
Gentlemacs Dissociator Miltenyi Biotech 130-093-235
Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol Miltenyi Biotech
Name Company Catalog Number Comments
semipermeable adhesive film (Suprasorb F) Lohmann&Rauscher 20468
stereo fluorescence microscope Leica M205 FA
Tissue-Tek Film automated Coverslipper Sakura 6400
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana Medical Systems Inc 760-500
Ventana Automated Slide Stainer Ventana Medical Systems Benchmark XT

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References

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Sys, G. M. L., Lapeire, L., Stevens, N., Favoreel, H., Forsyth, R., Bracke, M., De Wever, O. The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522, doi:10.3791/50522 (2013).

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