Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Den Published: July 17, 2013 doi: 10.3791/50522
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 2, 2
1Department of Orthopaedic Surgery and Traumatology, Ghent University Hospital, 2Department of Radiation Oncology and Experimental Cancer Research, Ghent University, 3Department of Virology, Parasitology, and Immunology, Ghent University, 4Pathlicon

Summary

Den

Abstract

Sarkom er en meget sjelden sykdom som er heterogen i naturen, alle hindre utviklingen av nye behandlingsformer. Sarkom pasienter er ideelle kandidater for personlig medisin etter lagdeling, forklarer den nåværende interesse i å utvikle en reproduserbar og rimelig xenotransplant modell for denne sykdommen. Den dama chorioallantoic membranen er en naturlig immunodeficient vert i stand til å opprettholde podet vev og celler uten artsspesifikke restriksjoner. I tillegg er det lett tilgjengelig, manipulert og avbildes ved hjelp av optisk og fluorescens stereomikroskopi. Histologi tillater ytterligere detaljert analyse av heterotypic cellulære interaksjoner.

Denne protokollen beskriver i detalj i ovo pode av chorioallantoic membran med ferske sarkom-avledet tumorvev, deres encellede suspensjoner, og permanente og forbigående fluorescensmerkede etablerte sarkom cellelinjer (SAOS-2 og SW1353). Den dama overlevelse rottees er opptil 75%. Modellen brukes til å studere pode-(levedyktighet, Ki67 spredning indeks, nekrose, infiltrasjon) og vert (fibroblast infiltrasjon, vaskulær ingrowth) atferd. For lokaliserte poding av encellede suspensjoner, gir ECM gel betydelige fordeler fremfor inerte containment materialer. Den Ki67-indeks spredning er relatert til avstanden av cellene fra overflaten av CAM og varigheten av programmet på CAM, idet sistnevnte bestemme en tidsperiode for tilførsel av terapeutiske produkter.

Introduction

Sarkom er en sjelden svulst av bindevev med en høy dødelighet som følge av behandling motstand 1,2. Fremgang i pasientens overlevelse er hemmet av deres lave årlig insidens, deres bredt mangfold, og det faktum at sarkom celler er rapportert å være vanskelig å kultur in vitro 3,4.

Bruk av dyrkede celler for preklinisk terapi evaluering har avdekket at nye, tilsynelatende aktive molekyler in vitro ikke alltid gjenspeiler resultatene i klinisk setting. Videre genom avvik avdekket av genuttrykk arrays er ikke alltid korrelert til tumor adferdstrekk hos den enkelte pasient 5-7. For å prøve og løse disse problemene, har personlig medisin fått stadig større betydning, noe som gjenspeiles i økt søk etter xenograft modeller 8-12.

Et in vivo-forsøk har fordelen av å reflektere det komplekse samspill mellom cancer celler og verten vev miljø i solide svulster, er nødvendig for kreft spredning og invasjon 13. For tiden vi studerer bruken av Chorio-Allantoic Membrane assay (CAM-analyse) som en reproduserbar xenograft modell for sarkom 14,15. Denne analysen er mye brukt for studiet av tumor angiogenese 16,17. I litteraturen, har vi imidlertid funnet forskjellige protokoller for denne analysen, mens andre studier observert en markert forskjell i veksten eller angiogenese i henhold til forskjellige protokoller 18,19.

I denne artikkelen undersøker vi effekten av varierende forhold i CAM-analysen på celle atferd med svulst grafts, tumor-avledet encellede suspensjoner og etablerte sarkom cellekulturer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Se figur 1 for en oversikt.

Tumor materialet

En. Innhenting og forberede tumorprøver

For bruk av pasientmateriale, er godkjenning av Etisk Komité nødvendig, og informert samtykke skal innhentes fra pasienten.

  1. Innhøsting representative materiale (minimum 1 cm 3) ved tidspunktet for inngrep, enten en biopsi eller en reseksjon av et sarkom. Den riktige stedet for biopsi er definert ved hjelp av dynamisk kontrast MRI.
  2. Plasser materialet umiddelbart i en steril ampulle inneholdende DMEM supplert med 1000 U penicillin og 1 mg / ml streptomycin.
  3. Transporter ampullen straks (30-90 min) til laboratoriet.

Alle etterfølgende prosedyrer ble utført under laminær strømning.

  1. Hell innholdet i hetteglasset i en steril petriskål.
  2. Sett svulsten prøven i små deler av maksimalt 1mm 3 ved hjelp av en steril skalpell. Fjern alle forkalkede deler som de har en tendens til å svekke videre behandling av vev.
  3. Tilfeldig ta 10 tumor grafts for søknad på CAM.

2. Utarbeidelse av Tumor-avledet enkelt celle utestengelse

Omtrentlig varighet: 3 hr

  1. Veie den gjenværende vev av prøven.
  2. Put 2-4 g vev i et dissociator rør, mer enn ett rør kan være nødvendig å fordøye alle de gjenværende tumorvev.
  3. For fordøyelse av 2-4 g vev, tilsett 2,5 ml kollagenase 2 oppløsning (500 U / ml RPMI 1640) og 2,5 ml DNase-løsning (22 KU / ml RPMI 1640).
  4. Behandle vev i henhold til dissociator h_tumor protokollen. Dette omfatter to sykluser med inkubasjon ved 37 ° C i CO2-inkubator mens røret er rystet forsiktig i 30 min.
  5. Filtrere den gjenværende suspensjon gjennom en 150 mikrometer celle sil.
  6. Sentrifuger lysatet ved 1000 rpm i 5 mi.
  7. Fjern supernatanten.
  8. Resuspender pelleten i 10 ml erytrocytt lyseringsbuffer (ELB), slik at 10 min med inkubasjon med vanlig suspensjon.

Merk: erytrocytt lyseringsbuffer fremstilt som følger: til 0.037 g EDTA, 0,99 g K HPO 2 4, 8,29 g NH4Cl til 1000 ml aqua ved å bruke 10 N NaOH for å justere pH til 7,3, filter under trykk gjennom et 0,22 mikrometer filtrere. Oppbevar ved 4 ° C.

  1. Tilsett 25 ml dyrkingsmedium (DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin) for å stoppe reaksjonen.
  2. Sentrifuger suspensjonen ved 1000 rpm i 5 min. Fargen av pellets skal være hvitt nå.
  3. Fjern supernatanten.
  4. Tilsett 5 ml av medium til pelleten. Filtrere suspensjonen gjennom et 70 mikrometer celle sil.
  5. Tell antall levende celler / ml ved hjelp av en automatisk celleteller.

3.Kreftcellelinjer

SAOS2 osteosarkom celler (ATCC nummer: HTB-85) uttrykker forbedret grønt fluorescerende protein ble electroporated av peGFP-C1 vektor bruker Cell Linje Nucleofector Kit V i henhold til produsentens protokoll. For å etablere stabile cellelinjer, ble transfekterte celler velges i G418 (1 mg / ml) i 4 uker i tråd med tidligere etablerte protokoll 20.. I tillegg sortering ble utført av fluorescens aktivert celle sortering (FACS) i henhold til produsentens instruksjoner.

Celler fra SW1353 chondrosarcoma cellelinje (ATCC nummer: HTB-94) eller nylagde tumor encellede suspensjoner er merket med en rød fluorescerende lipofile membran flekken.

  1. Fjerne cellene fra kulturen kolbe i en klassisk måte ved hjelp av Trypsin (0,5% vekt / volum) etylendiamin-tetraeddiksyre (EDTA, 0,2% vekt / volum) oppløsning.
  2. Sentrifuger cellesuspensjonen i 5 min ved 1000 rpm.
  3. Fjern supernatant.
  4. Tilsett 1 ml serum-fritt medium og 5 pl DII (Vybrant Red) / 10 6 celler.
  5. Pakk hetteglass i aluminiumsfolie og legg den i CO 2 inkubator i 10 min ved 37 ° C.
  6. Sentrifuger på nytt i 5 min ved 1000 rpm og fjern supernatanten.

Chorioallantoic membran analysen

En. Egginkubasjon

  1. Befruktede egg fra en lokal kommersiell klekkeri garanterer 95% befruktning av eggene er nødvendig.
  2. Befruktede egg kan lagres ved romtemperatur i opptil 10 dager.

Merk: før inkubering smuss, fjær og ekskrementer omhyggelig fjernet fra eggeskall mekanisk ved å tørke med papirhåndklær, som har en grov snarere enn en myk overflatestruktur. Tørke eggene med 70% denaturert etanol eller noen annen rengjøring reagens reduserer overlevelsen av kyllingembryo.

  1. Sett eggene i inkuberingbator på den ene siden, som markerer den øvre overflaten. Den dagen da eggene er lagt i kuvøse er utpekt dag 0 av embryonale utvikling.
  2. Sett inkubasjonstemperaturen ved 37,8 ° C, og fuktigheten i det 47%. Pass på at den automatiske alternativet er slått av.

2. Åpning av eggene

Varighet: ± 60 min for 25 egg

På utviklingen dag 3, blir eggene åpnes under laminær luftstrøm. Åpning eggene på ytterligere utviklingsstadiet resulterer i skader på CAM, som membran har en tendens til å holde seg til skallet. En infrarød lampe brukes til å holde eggene varme under prosedyren. For å forbedre sterilitet, anbefaler vi bruk av hånd hansker.

  1. Plasser egg i eggeglass, med den markerte siden oppover.
  2. Senke nivået av CAM ved å fjerne to ml av eggehvitestoff gjennom en 18 G nål inn på spissen av egget. Hvis nålen er sløv etter perforering flereeggeskall, bytt nålen. Hvis ikke, har for mye kraft som må utøves, noe som resulterer i skade på eggeplomme eller brudd av skallet. Noen ganger nålen er blokkert av chalazae, en av 2 spiral band suspendering av eggeplomme i eggehvitestoff. Dette kan løses ved å trykke stempelet forsiktig ned til blokken er løst. Hvis eggeplomme blir suget opp i sprøyten, nålen byttes, så vel som i sprøyten. Noen ganger embryoet dør etter denne hendelsen. Dersom en utilstrekkelig mengde albumen er fjernet, vil CAM bli skadet når skallet er fjernet.
  3. Påfør en semipermeabel klebefilmen på det merkede oversiden av skallet for å forhindre søl av skallpartikler på CAM mens kutte vinduet.
  4. Foreta en innføring hull med en liten syl ved overflaten av egget.
  5. Skjær et vindu på 1 cm 2 i skallet, ved hjelp av et par sterile spisse kirurgisk saks.
  6. Embryoet pulserende hjerte og tilstøtende fartøy kan observeres på than overflaten av eggeplommen. Fjerne ikke-befruktede egg eller døde embryoer. En avbrutt aspekt av blodårene karakteriserer døde embryoer.
  7. Tett vinduet med en semipermeabel selvklebende film. Det er ikke nødvendig å dekke punkteringsstedet, med mindre skallet har sprukket under innføring av kanylen.

3. Inoculation Prosedyre

Varighet: ± 1 time per cellelinje

På chick embryonale utviklingen dag 9, blir eggene vaksinert i henhold laminær luftstrøm.

Evaluering av kreftcelle sprer seg over CAM krever oppsamling av cellene til en begrenset overflate under inokulasjon. Matrigel er en ekstracellulær matrix (ECM) gel fra Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom ofte brukt i eksperimentelle cellekultur forhold. Det er en væske når avkjølt, men vil gjennomgå termiske aktivering av polymerisasjonen når de bringes til 20 - 40 ° C, hvorved det dannes en stabil gel. During forsøkene, er Matrigel oppbevares i en boks som inneholder smeltende is.

Merk: Vi insisterer ikke å bruke perforerte Dekkglass. Vi observerte vedlegg og vekst av podet kreftceller på plast plate dermed forspenning vekst potensialet i cellene på membranen.

  1. Resuspender cellepelleten i en avkjølt ECM gel med en konsentrasjon på 10 6 cells/100 mL ECM gel. Hold denne løsningen om issmelting.
  2. Avgifts del av den semi-permeable membran med et par av sterile kirurgiske henhold laminær luftstrøm. Hvis limet filmen fjernes helt, vil dette resultere i en større andel av embryonale død på grunn av forurensning.
  3. Trykk-modulen rett under skallet vinduet lett med en steril glass-stang, for å fjerne epitelcellelaget. Berøring av CAM med en steril glass stang viser seg å være mindre traumatisk enn å bruke en skalpell n ° 11, noe som krever mer handiness og erfaring. Små blødninger kan oppstå.
  4. Legge svulst materiale.
  5. For svulst grafts: senk ett stykke vev på CAM med et par steril tang, uten å klemme den.
  6. For ECM-gel fremgangsmåte: til 4 x 25 pl av celle-ECM gel suspensjonen til CAM, på toppen av hverandre, slik at ECM gel å polymerisere i mellom applikasjonene. På denne måte en fastsittende plakk som inneholder kreftceller er opprettet.
  7. Tett shell vinduet igjen med en semipermeabel selvklebende film.

4. Bildebehandling og Høsting av CAM

Varighet: 2 timer for 25 egg

På chick embryonale utviklingen dag 16, er CAM høstes. Arbeider under laminær luftstrøm er ikke nødvendig.

  1. Forstørre vinduet med et par kirurgisk saks. Pass på at du ikke kutter for lavt, ellers CAM vil bli skadet, noe som resulterer i blødning av de skadde fartøy.
  2. Legg 300-500 mL PBS D med en pipette på CAM seksjon som inneholder det inokulerte materiale. Dersom ingen fluorescerende prober blir brukt, kan bufret formaldehyd brukes som dette gjør membranen stivere, lette kuttingen av membranen.
  3. Gjør et fotografi av CAM i egget gjennom en stereo fluorescens mikroskop, utstyrt med en digital farge kamera, med både GFP eller DSR filter, og ingen filter. For svulsten grafts, er alle bildene tatt uten filter. Belysning ovenfra av LED-lys anbefales sterkt under fotografering (figur 2).
  4. Record svulst celle migrasjon for de merkede cellene. Grensene til svulstene kan være uregelmessig og frynsete. Spredte celler kan være til stede nær svulsten grenser. I enkelte prøver, kan rader av tumorceller bli observert (figur 3).
  5. Skjær membranen med et par av steril saks ved grensen ligger mot skallet.
  6. Plasser det høstede CAM i en steril petriskål fylt med PBS D eller bufret formaldehyde.
  7. Lag et fotografi av både den øvre side og den nedre side av CAM, både med og uten filter.
  8. Sette membranen i en merket beholder med bufret formaldehyd i minst 72 timer.
  9. Bygge inn CAM i parafin og forberede dem for histologisk undersøkelse. Vær nøye med å skjære tumor grafts i senter av den nodul, slik at snittflaten er parallell med bunnen av kassetten. Hvis ikke, vil samspillet mellom CAM og svulsten pode ikke være synlig. Den samme strategien gjelder ECM gel plaques: overflaten som vender mot skjærebladet skal være vinkelrett på plakk.

5. Histologisk evaluering

Hematoxylin-Eosin flekker og Ki-67 immunhistokjemi ble utført for nærmere avklaring om nødvendig. Immunhistokjemi ble utført på formalin-fast parafininnstøpte vev seksjoner av 3,5 mikrometer i tykkelse, ved hjelp av en automatisert lysbilde Stainer according til produsentens instruksjoner. En primær mus monoklonalt antistoff til Ki-67 (klon MIB-1, fortynning 1/100) ble benyttet. Heat-indusert epitope gjenfinning ble utført ved hjelp av Cell Conditioning 1, og visualisering ble oppnådd med Universal DAB Detection Kit, i henhold til produsentens instruksjoner. Dehydrering av vevsdelene ble utført ved hjelp av en automatisert coverslipper.

For SAOS2 og SW1353 cellelinjer, ble antall Ki67-positive og Ki67-negative celle nuclei/100 mikrometer 2 telles i tre soner: en nær grensen til CAM, en nær overflaten og ett i sentrum av ECM gel plakk. Denne prosedyren ble gjentatt 6 ganger for hver Ki-67 farget lysbilde. Indeksen av proliferasjon ble bestemt for hvert bilde ved å dividere antall Ki67-positive celler ved det totale antall celler telles.

Nekrose er definert ved et tap av fin dispersjon av kromatin i cellekjernen, ledsaget av fading av forskjellige celle marginer. For xenograftene er nekrose scoret som fullstendig, partiell (ofte ved overflaten), eller fraværende. Infiltrasjon av tumorceller inn i CAM er definert ved observasjon av tumorceller innenfor mesoderm av CAM er i scoret som å være tilstede eller fraværende.

Tre elementer er scoret for host atferd. Fibroblast infiltrasjon er definert som langstrakte celler forlater CAM og invaderende svulsten pode / plakk, og scoret som å være tilstede eller fraværende. Vaskulær innvekst kan observeres som innvekst av prolifererende chick fartøy, karakterisert ved tilstedeværelse av kjerneholdige chick erytrocytter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Evaluering av CAM

Tumor grafts bli tilhenger til CAM (Figur 2A). Encellede suspensjoner fra pasientmateriale ofte vise en tørket, litt hevet plakk (figur 2D). Etter fjerning av CAM, markerte rynker av membranen skjer (Tall 2E og 2F).

For den kommersielle cellelinjer plakk blir mer ugjennomsiktig i tid, noe som indikerer celleproliferasjon. Forskjellige cellelinjer i ECM gel har en tydelig vekst mønster på CAM. SAOS2 danner en spredning plakk, med en tydelig økning av overflaten fra dag 7 etter inokulering, mens GFP signalet forblir sterk, noe som indikerer levedyktige celler. Migrasjon av SAOS2 celler kan bli visualisert parallelt med karene i CAM (figur 3). Når observeres gjennom stereomikroskop, kan blodårer sees når ingen filter er brukt. Tumor celler kan ikke skjelnes når ingen fIlter brukes. Det er ikke mulig å visualisere de blodkar når en GFP filter settes inn. Ved å vri på filteret av og på, kan den nære kontakten mellom de trekkende celler og blodkar bli sett. Konsentrert blødning kan observeres gjennom den plakk (figur 4, radene 1 og 2). Plaketter som inneholder SW1353 cellene vise en nedgang i overflaten og har en tendens til å trekke sammen CAM, noe som resulterer i en rynket membran etter høsting den (figur 4 rader 5 og 6). DSR-signalet avtar som fluorescerende probe blir utvannet etter mange celledelinger. Fra dag 7, er blødning hyppig observert. Hvis blødningen oppstår, reduseres DSR-signalet også.

Vaskulær Reaksjonen kan bli visualisert etter eksisjon av CAM ved den nedre visning, som viser kroket fartøy rundt transplantatet eller plakk (figur 2). Vaskulær reaksjon av CAM er observert i tumorgraft gruppe, den eneste cellesuspensjon gruppe (<sterk> Figur 2C og 2F) og ECM gel kontrollgruppen (figur 2G), men ikke i celleløsning kontrollgrupper (figur 2H). Nye kroket fartøy kan observeres inn prøven, forgrening (figur 2I, pilspisser) og anastomering (figur 2I, skjult) med hverandre, også små områder av blødning forekommer (figur 2I, piler). Neovascularization av svulsten kan kvantifiseres på H & E lysbilder i ulike soner av svulst / tumor plakk.

Histologisk bevis viser at SAOS2 celler opprettholder en enkelt celle utseende over hele den fullstendige volumet av ECM gel, forårsaker en økt tykkelse og diameter av plakk. De invadere mesodermlaget av CAM (figur 5A, pil), for derved å forstørre avstanden mellom endodermal og ectodermal lag av CAM som en åpning glidelås (figur 5A (figur 5B, pil). Antallet av celler og celle grupper øker jevnt i tid, og antallet av ikke-formerende celler øker fra dag 7, spesielt på overflaten av plakk. For SW1353, kan sammentrekning av CAM også bli verdsatt på H & E lysbilder i forhold til H & E lysbilder av SAOS2.

Uavhengig av deres ektopisk vokseplass, fant vi at viktige funksjoner og immunhistokjemiske kjennetegn ved de opprinnelige sarkom svulster ble opprettholdt i CAM. I tillegg svulsten grafts bli revascularized som gjenspeiles av utseendet av kjerneholdige chick erytrocytter, tumor grafts blir infiltrert av chick fibroblaster og kreftceller fra pode infiltrert CAM verten vev, illustrerer pålitelighet og Robustness av CAM-analysen (figur 6, innfelt nederst til venstre). For ytterligere informasjon henviser vi til Sys et al. 14..

Tid for innhøsting

Celletelling av Ki67-positive og Ki67-negative celler viser en jevn økning i det totale antall av celler fra dag 4 til begge cellelinjer. Etter denne dagen det totale antall celler er stabil. Syv dager etter vaksinasjonen, igangsetting av Ki67-positive celler og det totale antall celler til å avta. Når det gjelder antallet av celler, er det en signifikant korrelasjon mellom de tre soner. Imidlertid er en større andel av Ki67-positive celler nær kammen og en større andel av Ki67-negative celler på overflaten av plakk observert (figur 4, radene 3, 4, 7 og 8).

Indeksen for spredning fortsatt relativt stabilt fram til sju dager etter vaksinasjonen, hvoretter det også begynner å avta. Den proliferatioN-indeksen av den SW1353 cellelinjen er signifikant lavere (P <0,05) sammenlignet med den SAOS2 cellelinje.

Selv om det er en signifikant sammenheng mellom de tre sonene, er det viktig å telle felt i alle de tre regionene i ECM gel plakk, som vi observerer en større andel av Ki67-positive celler nær CAM og en større andel av Ki67-negative celler på overflaten av plakk (figur 7).

Figur 1
Figur 1. Oversikt over protokollen. Klikk her for å se større figur .

Figur 2 Figur 2. Fotografier tatt under innhøstingen øverste rad bekymringer høsting av en tumorgraft fra en chondrosarcoma:. A = in situ, B = øvre visning i petriskål, C = lavere visning i petriskål. Midterste rad bekymringer høsting av en enkelt celle suspensjon i ECM gel: D = in situ, E = øvre visning i petriskål, F = lavere visning. Nederste raden G = matrigel kontroll, H = celleløsning kontroll, I = lavere visning som viser forgreninger fartøy og blødninger. Klikk her for å se større figur .

Figur 3
Figur 3. GFP fotografi av SAOS2

Figur 4
Figur 4. Denne figuren viser fotografier av både SAOS2 (øvre fire rader) og SW1353 (senke fire rader) på dag 1 til 8 etter vaksinasjonen. Rad 1 (skala bar 2 mm) viser fotografier av CAM in situ gjennom et stereomikroskop med GFP filter. Rad 2 (skala bar 2 mm) viser de samme prøvene gjennom stereomikroskop mens opplyst av lysdioder ovenfra. Row 3 og 4 viser H & E (rad tre, skala bar 200 mikrometer) og Ki67-farget (rad 4, skala bar 200 eller 500 mikrometer) histologiske bildene fra de samme prøvene. Row 5 (skala bar 2 mm) viser fotografier av CAM in situ gjennom et stereomikroskop med DSR filter. Rad 6 (scale bar 2 mm) viser de samme prøvene gjennom stereomikroskop mens opplyst av lysdioder ovenfra. Rad 7 og 8 viser H & E (rad 7, skala bar 200 mikrometer) og Ki67-farget (rad 8, skala bar 200 og 500 mikrometer) histologiske bilder fra de samme prøvene. Klikk her for å se større figur.

Figur 5
Figur 5. Sammenligning av svulst celle spredning av SAOS2 og SW1353. A = vekst på SAOS2 B = vekst på SW1353.

Figur 6
Figur 6. Kjerneholdige chick erytrocytter kan observeres i kapillærene gjennom en høy karakter liposarcoma tumorgraft (HE, 100X), innfelt lavereigjen.

Figur 7
Figur 7. Graf som viser Ki67 + og Ki67-celler over tid i henhold til avstanden fra CAM for begge cellelinjer. Sone A = mot CAM, sone C = overflaten av plakk, sone B = i mellom sone A og C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tid for vaksinasjon og innhøsting

Timing dagen for vaksinasjonen ble utført ved hjelp av SAOS2 i ECM gel (36 CAM) og varierte mellom embryonale utvikling dag 5 og 10 år.

Før inkubasjon dag 9, var CAM ikke konsekvent stor nok til å støtte ECM gel vi søkte. Ved innhøsting, kreftceller noen ganger måtte hentes fra dypere CAM, og noen ECM gel prøvene ble liggende løs i albumen eller på CAM. På dag 5 og 6, var det vanskelig å unngå å sette kreftceller på chick embryo, noe som resulterer i chick misdannelser eller død. Fra dag 9, ble CAM helt dekker overflaten under vinduet i de fleste egg, og ECM gel plaketter viste tilhenger til CAM i øyeblikket for innhøsting. Derfor har vi funnet det ideelle tidspunktet for vaksinasjon skal være dag 9 av embryonal utvikling.

For å bestemme den ideelle tiden for høsting, ble SAOS2 og SW1353 høstes etter respectivel1 y, 2 (SAOS2-GFP bare), 4, 5, 6, 7 og 8 dager etter inokulering, eller mellom embryoutvikling dag 10 og 17. Etter disse variasjonene, ble en forskjell i lengden på programmet på CAM bemerket 1-12 dager.

Knighton publisert markerte forskjeller i tumorvekst og tumor revaskularisering ifølge embryoutvikling dag i øyeblikket av tumor prøvepåføring 17.. Celletellingen av Ki67-positive og Ki67-negative celler viste en jevn økning i det totale antall av celler fra dag 4 til begge cellelinjer. Dette er overensstemmende med funn av Ausprunk et al. 21. som uttalte at perioden trengs for revaskularisering tar 72 timer. Etter å telle antall celler og indeksberegningene for spredning, kan vi anta at cellene spredt i ECM-gel er aktivt voksende fra dag 4 til dag 6 etter vaksinasjonen. Basert på diameteren av plakk, det totale antall av celler og indeksspredning, foreslår vi at den ideelle tiden for innhøsting er dag 16 av fosterutviklingen, eller sju dager etter vaksinasjonen.

Den foreslåtte tidsrammen etterlater forskerne en vindu på seks dager for anvendelse av agenter mens cellene er aktivt voksende, enten en gang på dag 4 etter inokulering eller daglig under hele tidsramme. For topisk tilførsel kan forbindelsen påføres på kamflaten. Denne ruten er den mest brukte ett, på grunn av tilgjengelighet til CAM ved å åpne eggeskallet / selvklebende film 22,23. Selv IV administrasjon er gjennomførbart, er det problemer med å sette nåler inn i CAM skipene en kritisk begrensning. Kinase-inhibitorer er brukt på en daglig basis 24; kjemoterapi gang i løpet av eksperimentet. Vi hypotese at å legge et sammensatt når tilsvarer den kliniske behandling med cytotoksisk av cytostatika, som er klassisk gitt en gang hver 3. uke, mens du leggersammensatt på en daglig basis vil reflektere den daglige dose av kinase hemmere i klinisk setting. Men vi må huske på at lokal administrasjon vil vise forskjellige kinetikk / metabolisme sammenlignet med oral eller intravenøs administrering hos pasienter.

Betydningen av teknikk og mulige fremtidige søknader

Bevaring av cellemorfologi er av største viktighet når cellekulturer anvendes i prekliniske modeller. Bruken av homogene ekstracellulære matrikser som kollagen type I 25 eller ECM gel 26 gjenoppretter den tumorcelle-miljø, slik at en mer naturlig vekstmønster.

I motsetning til in vivo, in vitro analyser ikke inneholde stromaceller som angiogenetiske vaskulære celler, infiltrere immunceller eller kreft-tilknyttede fibroblastisk celler nødvendig for å gjeninnføre den tumorigent microenvironment 27. Når CAM-analysen brukes til evaluereion av tumorgrafts har vi beskrevet en typisk 'invasjon kjegle "fra CAM mot tumorgrafts, reflekterer rekruttering av stromaceller fra dama ved tumorgraft 14.

CAM-analysen gir en kombinasjon av å gjenopprette den ekstracellulære matrix av ECM gel og gi vertsceller for tilberedning av tumorigent microenvironment. Som CAM og tumorgraft / plakett er lett tilgjengelig, er administrasjonen av forbindelser enkelt. På denne måten åpner CAM-analysen nye perspektiver mot preklinisk evaluering av sjeldne tumor typer som sarkomer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Celler fra SW1353 chondrosarcoma cellelinje ble vennlig levert av professor dr. PCW Hogendoorn og professor Dr. J. Bovee av Leiden University, Nederland. Vi takker J. Mestach og G. Wagemans for utmerket teknisk assistanse, og G. De Bruyne for den profesjonelle tegning av oversikt over protokollen vår.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Line Nucleofector Kit V Amaxa VCA-1003
collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) Sigma Aldrich C6885
DMEM Invitrogen 41965-039
DMSO Sigma D8418
Dnase solution Sigma Aldrich DN25
G418 Invitrogen 11811031
Matrigel Sigma-Aldrich E1270
mouse primary monoclonal antibody Ki67 Dako Denmark MIB-1
Paraformaldehyde Fluka D76240
PBS Invitrogen 20012019
PBSD Invitrogen 14040083
peGFP-C1 vector Clontech 632470
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140163
RPMI Invitrogen 22409-015
Trypsin-EDTA solution Invitrogen 25300054
Vybrant cell-labeling DiI Lifetechnologies 22885
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10227
digital color camera Leica DFC 340 FX
Digital Egg Incubator Auto Elex Co R-COM 50
FACS BD Biosciences FACSAriaIII
Gentlemacs C-Tube Miltenyi Biotech 130-093-237
Gentlemacs Dissociator Miltenyi Biotech 130-093-235
Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol Miltenyi Biotech
Name Company Catalog Number Comments
semipermeable adhesive film (Suprasorb F) Lohmann&Rauscher 20468
stereo fluorescence microscope Leica M205 FA
Tissue-Tek Film automated Coverslipper Sakura 6400
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana Medical Systems Inc 760-500
Ventana Automated Slide Stainer Ventana Medical Systems Benchmark XT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution. Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).
  2. Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas. Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).
  3. Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M. Cancer statistics, 2001. CA A Cancer Journal for Clinicians. 51, 15-36 (2001).
  4. Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin. Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).
  5. Taylor, B. S., Barretina, J., et al. Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).
  6. Skubitz, K. M., D'Adamo, D. R. Sarcoma. Mayo Clinic Proceedings. 82, 1409-1432 (2007).
  7. Nielsen, T. O., West, R. B. Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm. Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).
  8. Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).
  9. DeRose, Y. S., Wang, G., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
  10. Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
  11. Bertotti, A., Migliardi, G., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
  12. Decaudin, D. Primary human tumor xenografted models ('tumorgrafts') for good management of patients with cancer. Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).
  13. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  14. Sys, G., Van Bockstal, M., et al. Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model. Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).
  15. Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines. Cancer Research. 42, 1826-1837 (1982).
  16. Deryugina, E., Quigly, J. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).
  17. Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).
  18. Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J. Vis. Exp. (33), e1620 (2009).
  19. Balke, M., Neumann, A., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Research Notes. 3, 58 (2010).
  20. Hendrix, A., Maynard, D., et al. Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis. Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).
  21. Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels. American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).
  22. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).
  23. Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).
  24. Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).
  25. De Wever, O., Hendrix, A., et al. Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices. International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).
  26. Albini, A., Benelli, R. The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation. Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).
  27. Hanahan, D., Coussens, L. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).

Tags

Cancer Biology medisin cellebiologi molekylær biologi Biomedical Engineering bioteknologi Developmental Biology anatomi fysiologi onkologi kirurgi svulster fettvev bindevev Svulst muskelvev Sarkom forsøk med dyr Cell Culture teknikker svulster Eksperimentelle Svulst Transplantasjon biologisk analyse Sarkomer CAM-analysen xenograft spredning invasjon kreft svulst, CAM analysen kliniske teknikker dyremodell
Den<em&gt; I ovo</em&gt; CAM-analysen som en Xenograftmodel for Sarkom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sys, G. M. L., Lapeire, L., Stevens, … More

Sys, G. M. L., Lapeire, L., Stevens, N., Favoreel, H., Forsyth, R., Bracke, M., De Wever, O. The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522, doi:10.3791/50522 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter