Summary
Den
Abstract
Sarkom är en mycket sällsynt sjukdom som är heterogen till sin karaktär, allt hämmar utvecklingen av nya terapier. Sarkom patienter är perfekta kandidater för personlig medicin efter stratifiering, förklarar den nuvarande intresse av att utveckla en reproducerbar och billig xenotransplantat modell för denna sjukdom. Den chick korioallantoismembranet är en naturlig immunodeficient värd kan upprätthålla ympade vävnader och celler utan artspecifika begränsningar. Dessutom är det lätt att komma åt, manipuleras och avbildas med optisk och fluorescens stereomikroskopi. Histologi tillåter även en detaljerad analys av heterotypiska cellulära interaktioner.
Detta protokoll beskriver i detalj i ovo ympning av korioallantoinmembranet med färska sarkom-härledda tumörvävnad, deras enda cellsuspensioner, samt permanenta och tillfälliga fluorescerande etablerade sarkom cellinjer (Saos-2 och SW1353). Den chick överlevnad råttaes är upp till 75%. Modellen används för att studera graft-(livskraft, Ki67 proliferationsindex, nekros, infiltration) och värd (fibroblast infiltration, vaskulär inväxt) beteende. För lokaliserad ympning av enkelcellsuspensioner, ger ECM gel betydande fördelar jämfört med inerta inneslutande material. Den Ki67 proliferationsindex är relaterad till avståndet mellan celler från ytan av CAM och varaktigheten av ansökan om CAM, den senare fastställa en tidsram för tillsättning av terapeutiska produkter.
Introduction
Sarkom är en sällsynt tumör i bindväv med en hög dödlighet i terapi motstånd 1,2. Framsteg i patientens överlevnad hämmas av deras låga årliga incidensen, deras breda mångfald, och det faktum att sarkomceller rapporteras vara svårt att odling in vitro 3,4.
Användningen av odlade celler för preklinisk terapi utvärdering har visat att nya, till synes aktiva molekyler in vitro inte alltid återspeglar resultat i klinisk miljö. Dessutom genomet avvikelser avslöjas av arrayer genuttryck är inte alltid korrelerade till tumoruppförande egenskaper hos den individuella patienten 5-7. För att försöka lösa dessa problem, har personlig medicin ökat i betydelse, vilket återspeglas i den ökade sökandet efter xenograft modeller 8-12.
Ett test in vivo har fördelen av att reflektera det komplexa samspelet mellan cancer celler och värdvävnaden miljön i solida tumörer, som är nödvändiga för cancer proliferation och invasion 13. För närvarande studerar vi användningen av Chorio-allantois membrananalys (CAM-assay) som en reproducerbar xenograftmodell för sarkom 14,15. Denna analys är allmänt används för studier av tumörangiogenes 16,17. I litteraturen har vi dock funnit olika protokoll för denna analys, medan andra studier observerade en markant skillnad i tillväxt eller angiogenes enligt olika protokoll 18,19.
I denna artikel kommer vi undersöka effekten av varierande förhållanden i CAM-analys på cellens beteende med hjälp av tumör transplantat, tumörhärledda ensamstående cellsuspensioner och etablerade sarkom cellkulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Se figur 1 för en översikt
Tumör material
Ett. Erhålla och förbereda tumörprover
För användning av patienten material, är godkännande av etisk kommitté behövs, och informerat samtycke måste inhämtas från patienten.
- Harvest representativt material (minst 1 cm 3) vid tidpunkten för interventionen antingen en biopsi eller en resektion av ett sarkom. Den rätta platsen för biopsi definieras med hjälp av dynamisk kontrast MRI.
- Placera materialet omedelbart i en steril flaska innehållande DMEM kompletterat med 1,000 U penicillin och 1 mg / ml streptomycin.
- Transporter flaskan omedelbart (30 - 90 min) till labbet.
Alla följande procedurer utförs under laminärt flöde.
- Häll flaskans innehåll i en steril petriskål.
- Sätt tumörprovet i små delar av maximalt 1 mm 3 med en steril skalpell. Ta bort alla förkalkade delar eftersom de tenderar att försämra ytterligare bearbetning av vävnaden.
- Slumpmässigt ta 10 tumör transplantat för tillämpning på CAM.
2. Framställning av tumörhärledd Enkelcellsuspensioner
Ungefärlig längd: 3 tim
- Väg den kvarvarande vävnaden av provet.
- Sätt 2 - 4 för g vävnad i en dissociator tub, mer än ett rör kan krävas för att smälta all den kvarvarande tumörvävnad.
- För rötning av 2 - 4 g vävnad, tillsätt 2,5 ml kollagenas 2-lösning (500 U / ml RPMI 1640) och 2,5 ml DNas-lösning (22 KU / ml RPMI 1640).
- Bearbeta vävnad enligt den dissociator h_tumor protokollet. Detta omfattar två cykler av inkubering vid 37 ° C i CO2 inkubator medan röret skakades försiktigt under 30 min.
- Filtrera den återstående suspensionen genom en 150 | im cellfilter.
- Centrifugera lysatet vid 1000 rpm under 5 min.
- Avlägsna supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 10 ml erytrocyt lyseringsbuffert (ELB), vilket gör att 10 minuters inkubation med regelbunden suspension.
Obs: erytrocyt lysbuffert bereds som följer: Lägg 0,037 g EDTA, 0,99 g K 2 HPO 4, 8,29 g NH4CI till 1000 ml aqua, använda 10 N NaOH för att justera pH till 7,3, filtret under tryck genom ett 0,22 pm filtrera. Förvara vid 4 ° C.
- Tillsätt 25 ml odlingsmedium (DMEM med tillsats av 10% fetalt bovint serum, 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin) för att stoppa reaktionen.
- Centrifugera suspensionen vid 1000 rpm under 5 min. Färgen av pelleten ska vara vit nu.
- Avlägsna supernatanten.
- Tillsätt 5 ml medium till pelleten. Filtrera suspensionen genom ett 70 | im cellfilter.
- Räkna antalet levande celler / ml med hjälp av en automatisk cellräknare.
Tre. Cancer cellinier
SAOS2 osteosarkomceller (ATCC nummer: HTB-85) som uttrycker förbättrade grönt fluorescerande protein elektroporerades av pEGFP-C1 vektorn med användning av cellinje Nucleofector Kit V enligt tillverkarens protokoll. För att etablera stabila cellinjer, transfekterade celler selekterades i G418 (1 mg / ml) under 4 veckor i linje med tidigare etablerat protokoll 20. Dessutom sortering utfördes genom fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) enligt tillverkarens anvisningar.
Celler från SW1353 chondrosarcoma cellinje (ATCC nummer: HTB-94) eller nylagade tumör enstaka cellsuspensioner är märkta med en röd fluorescerande lipofilt membran fläck.
- Avlägsna cellerna från odlingskolven på ett klassiskt sätt med användning av trypsin (0,5% vikt / volym) etylendiamintetraättiksyra (EDTA; 0,2% vikt / volym) lösning.
- Centrifugera cellsuspensionen under 5 min vid 1000 rpm.
- Avlägsna supernatant.
- Tillsätt 1 ml serum-fritt medium och 5 pl Dil (Vybrant Röd) / 10 6 celler.
- Slå in flaskan i aluminiumfolie och lägg den i CO 2 inkubator för 10 min vid 37 ° C.
- Centrifugera igen i 5 min vid 1000 rpm och avlägsna supernatanten.
Korioallantoinmembranet assay
Ett. Egg Inkubering
- Befruktade ägg från en lokal kommersiell kläckeri garanterar 95% befruktning av äggen krävs.
- Befruktade ägg kan lagras vid RT upp till 10 dagar.
Obs: innan inkubation smuts, fjädrar och avföring försiktigt bort från äggskal mekaniskt genom torra avtorkning med hushållspapper, som har en grov snarare än en mjuk ytstruktur. Torka äggen med 70% denaturerad etanol eller någon annan rengöring reagens signifikant minskar överlevnaden av kycklingembryon.
- Sätt äggen i incubtören på ena sidan, som markerar den övre ytan. Den dag då äggen läggs i kuvös betecknas dag 0 av embryots utveckling.
- Ställ in inkubationstemperatur vid 37,8 ° C och luftfuktigheten på 47%. Kontrollera att automatisk rotering alternativet är avstängd.
2. Öppnande av ägg
Varaktighet: ± 60 min för 25 ägg
Den utveckling dag 3, äggen öppnas under laminärt luftflöde. Öppna äggen vid ytterligare utvecklingsstadium resulterar i skador på CAM, som membranet tenderar att hålla sig till skalet. En infraröd lampa användes för att hålla äggen varma under förfarandet. För att förbättra sterilitet, rekommenderar vi användning av handen handskar.
- Placera ägget i eggcup, med den märkta sidan uppåt.
- Sänk nivån av CAM genom att ta bort två ml äggvita genom en 18 G nål införd på spetsen av ägget. Om nålen är trubbig efter perforering fleraäggskal, byt ut nålen. Om inte, har för mycket kraft utövas, vilket resulterar i skador på äggula eller fraktur av skalet. Ibland nålen blockeras av chalazae, en av två spiralformade band avbryter äggula i äggvitan. Detta kan lösas genom att försiktigt trycka tillbaka kolven tills blocket är löst. Om äggula sugs in i sprutan, byt ut nålen och sprutan. Ibland embryot dör efter denna händelse. Om en otillräcklig mängd äggvita tas bort, kommer CAM skadas när skalet avlägsnats.
- Applicera ett semipermeabelt limfilm på markerad övre sidan av skalet för att förhindra spill av skal-partiklar på CAM samtidigt minska fönstret.
- Gör en introduktion hål med en liten syl vid ytan av ägget.
- Skär ett fönster av 1 cm 2 i skalet, användning av ett par av sterila spetsiga kirurgiska saxar.
- Embryots pulserande hjärta och angränsande kärl kan observeras på the ytan av äggulan. Ta bort de icke-befruktade ägg eller döda embryon. En avbruten aspekt av blodkärlen präglar döda embryon.
- Täta fönster med en semipermeabel limfilm. Det är inte nödvändigt att täcka punktionsstället, såvida skalet har spruckit under införande av nålen.
Tre. Inokulerar
Varaktighet: ± 1 tim per cellinje
På chick embryonal utveckling dag 9, äggen ympades under laminärt luftflöde.
Utvärdering av cancer cell sprider sig över CAM kräver inneslutning av cellerna till en begränsad yta under ympning. Matrigel är en extracellulär matrix (ECM) gel från Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkom ofta används i experimentella cellodlingsbetingelser. Det är en vätska när de kyls, men kommer att genomgå termiskt aktiverad polymerisation när de bringas till 20 - 40 ° C, och bildar således en stabil gel. Underexperimenten, är Matrigel förvaras i en låda innehållande smältande is.
OBS: Vi insisterar att inte använda perforerade täckglas. Vi observerade vidhäftning och tillväxt av transplanterade cancerceller på plastskivan så förspänning tillväxtpotential cellerna på själva membranet.
- Resuspendera en cellpellet i kylt ECM gel vid en koncentration av 10 6 celler/100 pl ECM gel. Förvara lösningen på smältande is.
- Excise del av den semi-permeabla membranet med ett par sterila kirurgiska under laminärt luftflöde. Om limmet filmen tas bort helt och hållet, kommer detta att resultera i en större andel av embryonal död på grund av föroreningar.
- Tryck på CAM precis under skalet fönstret lätt med en steril glasstav, i syfte att avlägsna epitelceller lagret. Röra CAM med en steril glasstav visar sig vara mindre traumatiskt än att använda en skalpell nr 11, vilket kräver mer händighet och erfarenhet. Små blödningar kan förekomma.
- ETTdding tumörvävnad.
- För tumör transplantat: försiktigt sänka en bit vävnad på CAM med ett par av steril pincett, utan att klämma.
- För ECM gel förfarandet: Lägg till 4x 25 pl av cell-ECM gelsuspensionen till CAM, ovanpå varandra, vilket gör att ECM gelen att polymerisera in mellan applikationerna. På detta sätt en vidhäftande plack innehåller cancerceller skapas.
- Täta skalet fönstret igen med ett semipermeabelt vidhäftande film.
4. Imaging och skörden av CAM
Längd: 2 tim för 25 ägg
På chick embryonal utveckling dag 16, är CAM skördas. Att arbeta under laminärt luftflöde är inte nödvändigt.
- Större fönstret med ett par av kirurgiska saxar. Se till att inte skära för låg, annars CAM skadas, vilket resulterar i blödningar av de skadade fartygen.
- Lägg 300 - 500 l PBS D med en pipett på CAM sektjoninnehållande den ympade materialet. Om inga fluorescerande prober används kan buffrad formaldehyd användas eftersom detta gör att membranet styvare, vilket underlättar skärningen av membranet.
- Gör ett fotografi av CAM i ägget genom en stereo fluorescensmikroskop, utrustad med en digital färgkamera, med användning av både GFP eller DSR filtret, och inget filter. För tumör transplantat, är alla fotografier gjorda utan filter. Belysning från ovan av LED-lampor rekommenderas starkt under fotografering (Figur 2).
- Record tumör cell migration för de märkta cellerna. Gränserna för tumörer kan vara oregelbunden och nött. Spridda celler kan vara närvarande nära tumören gränserna. I vissa exemplar, kan rader av tumörceller observeras (Figur 3).
- Skär membranet med ett par steril sax vid gränsen som ligger mot skalet.
- Placera skördade CAM i en steril petriskål fylld med PBS D eller buffras förformaldehyd.
- Gör ett fotografi av både den övre sidan och den nedre sidan av CAM, både med och utan filter.
- Sätt membranet i en märkt behållare med buffrad formaldehyd i minst 72 timmar.
- Bädda CAM i paraffin och förbereda dem för histologisk undersökning. Var noga med att skära tumören transplantat vid centrum av knutan, att se till den skurna ytan är parallell med botten av kassetten. Om inte, kommer samspelet mellan CAM och tumören transplantatet inte syns. Samma strategi gäller för ECM gel plack: ytan vänd mot kniven bör vara vinkelrätt mot plack.
Fem. Histologisk utvärdering
Hematoxylin-eosin färgning och Ki-67 immunohistokemi utfördes för ytterligare förtydligande, om det behövs. Immunohistokemi utfördes på formalinfixerade paraffininbäddade vävnadssnitt av 3,5 ^ m i tjocklek, med användning av en automatiserad slide Stainer enligttillverkarens instruktioner. En mus primär monoklonal antikropp till Ki-67 (klon MIB-1, spädning 1/100) användes. Heat-epitopåtervinning utfördes med Cell Conditioning 1, och visualisering uppnåddes med Universal DAB Detection Kit, enligt tillverkarens instruktioner. Dehydrering av vävnadssnitt utfördes med användning av en automatiserad coverslipper.
För SAOS2 och SW1353 cellinjer, var antalet Ki67-positiva och Ki67-negativ cell nuclei/100 im 2 räknades i tre zoner: en nära gränsen av CAM, en nära ytan och en i mitten av ECM gel plack. Detta förfarande upprepades 6x för varje Ki-67 färgade objektglaset. Indexet av proliferation bestämdes för varje bild genom att dividera antalet av Ki67-positiva celler med det totala antalet räknade celler.
Nekros definieras av en förlust av fin dispersion av kromatin i cellkärnan, tillsammans med fading av distinkta cell marginaler. För xenografter är nekros gjorde så fullständig, partiell (ofta på ytan), eller frånvarande. Infiltration av tumörceller in i CAM definieras av observation av tumörceller inom mesoderm av CAM, och görs som närvarande eller frånvarande.
Tre punkter poängsätts för mottagande beteende. Fibroblast infiltration definieras som långsträckta celler lämnar CAM och invadera tumören graft / plack, och görs som närvarande eller frånvarande. Vaskulär inväxt kan observeras som inväxt av förökande chick fartyg, som kännetecknas av närvaron av kärnförsedda chick erytrocyter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utvärdering av CAM
Tumör transplantat blir vidhäftande till CAM (Figur 2A). Enkelcellsuspensioner från patientmaterial visar ofta en torkad, lätt upphöjda plack (Figur 2D). Efter excision av CAM, markerade rynkor av membranet sker (figur 2E och 2F).
För de kommersiella cellinjer plack blir mer täckande i tid, vilket indikerar celltillväxt. Olika cellinjer i ECM-gel har en tydlig tillväxt mönster på CAM. SAOS2 bildar en spridning plack, med en tydlig ökning av ytan från dag 7 efter ympning, medan GFP-signalen är fortsatt stark, vilket tyder på levande celler. Migration av SAOS2 celler kan visualiseras parallellt kärlen i CAM (Figur 3). När observeras genom stereomikroskop, kan blodkärl ses när inget filter används. Tumörceller kan inte urskiljas när ingen filter används. Det är inte möjligt att visualisera blodkärl när en GFP filter är insatt. Genom att vrida filtret på och av, kan den nära kontakten mellan de migrerande celler och blodkärl ses. Punktformig blödning kan observeras genom plack (Figur 4, raderna 1 och 2). Placken innehållande SW1353-celler visar en minskning av yta och tenderar att dra samman CAM, vilket resulterar i en skrynklig membran efter skörd det (Figur 4, raderna 5 och 6). DSR-signalen minskar när fluorescerande sond blir utspätt efter många celldelningar. Från dag 7, blöder ofta observeras. Om blödning uppstår, minskar DSR-signalen också.
Vaskulär reaktion kan visualiseras efter excision av CAM vid den lägre översikt som visar slingrande kärl omger transplantatet eller plack (Figur 2). Vaskulär reaktion av CAM observeras i tumorgraft gruppen, den enkelcellsuspension gruppen (<strong> Figur 2C och 2F) och ECM-gel kontrollgruppen (figur 2G), men inte i cellösning kontrollgrupper (Figur 2H). Nya slingriga kärl kan observeras ingå i urvalet, förgrening (figur 2I, pilspetsar) och anastomosing (figur 2I, asterisker) med varandra, även små områden med blödning (Figur 2I, pilar). Neovaskularisation av tumören kan kvantifieras på H & E diabilder i de olika zonerna av tumören / tumör plack.
Histologiska tecken visar att SAOS2 celler upprätthåller en enda cell utseende genom hela volymen av ECM-gel, vilket orsakar en ökad tjocklek och diameter av plack. De invadera mesodermal skiktet hos CAM (figur 5A, pil) och som därmed utvidgar avståndet mellan endodermalt och ektodermala skikten av CAM som en öppning blixtlås (figur 5A (Figur 5B, pil). Antalet celler och cellkluster öka stadigt i tid, och antalet icke-proliferativ celler ökar från dag 7, speciellt vid ytan av plattan. För SW1353, kan sammandragning av CAM också inses på H & diabilder E jämfört med H & E diabilder av SAOS2.
Trots deras ektopisk plats för tillväxt, fann vi att viktiga funktioner och immunhistokemiska egenskaper ursprungliga sarkom tumörer bibehölls i CAM. Dessutom tumören transplantat blir revascularized vilket bevisas av uppkomsten av kärnförsedda chick erytrocyter, tumör transplantat blir infiltreras av chick fibroblaster och tumörceller från transplantatet infiltrerat CAM värdvävnaden, illustrerande tillförlitligheten och Robustness av CAM-analysen (figur 6, inlägg nedre vänster). För mer detaljerad information hänvisar vi till Sys et al. 14.
Tid för skörd
Cellräkning av Ki67-positiva och Ki67-negativa celler visar en stadig ökning av antalet celler från dag 4 för båda cellinjer. Efter denna dag det totala antalet celler är fortsatt stabil. Sju dagar efter inokulering, börjar antalet Ki67-positiva celler och det totala antalet av celler att minska. Beträffande antalet celler, det finns ett signifikant samband mellan de tre zonerna. Men en större andel av Ki67-positiva celler nära till CAM, och en större andel av Ki67-negativa celler på ytan av plack observeras (Figur 4, raderna 3, 4, 7 och 8).
Indexet för spridningen är relativt stabil fram till sju dagar efter inokulering, varefter det också börjar sjunka. Den proliferation index för SW1353 cellinjen är signifikant lägre (P <0,05) jämfört med den SAOS2 cellinjen.
Även om det finns ett signifikant samband mellan de tre zonerna, är det viktigt att räkna fält i samtliga tre regioner i ECM-gel plack, som vi observerar en större andel av Ki67-positiva celler nära till CAM och en större andel av Ki67-negativ celler vid ytan av plattan (Figur 7).
Figur 1. Översikt av protokollet. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Fotografier tagna under skörden Övre raden gäller skörd av en tumorgraft från en chondrosarcoma:. A = in situ, B = övre vy i petriskål, C = lägre vy i petriskål. Mellersta raden gäller skörd av en enda cell suspension i ECM-gel: D = in situ, E = övre vy i petriskål, F = lägre vy. Nedre raden G = matrigel kontroll, H = cellösningen styrning, I = nedre vyn visar förgrenade kärl och blödningar. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. GFP fotografi av SAOS2 
Figur 4. Denna figur visar fotografier av både SAOS2 (övre 4 v) och SW1353 (nedre 4 rader) på dag 1 till 8 efter ympning. Varv 1 (skala bar 2 mm) visar fotografier av CAM in situ genom ett stereomikroskop med GFP filter. Varv 2 (skala bar 2 mm) visar samma prov genom stereomikroskop medan upplysta av lysdioder från ovan. Varv 3 och 4 visar H & E (rad 3, skala bar 200 um) och Ki67-färgade (rad 4, skala bar 200 eller 500 nm) histologiska bilder från samma prover. Varv 5 (skala bar 2 mm) visar fotografier av CAM in situ genom ett stereomikroskop med DSR-filter. Varv 6 (scale bar 2 mm) visar samma prov genom stereomikroskop medan upplysta av lysdioder från ovan. Varv 7 och 8 visar H & E (rad 7, skala bar 200 um) och Ki67-färgade (rad 8, skala bar 200 och 500 nm) histologiska bilder från samma prover. Klicka här för att visa en större bild. 
Figur 5. Jämförelse av tumörcellproliferation av SAOS2 och SW1353. A = tillväxt av SAOS2 B = tillväxt av SW1353. 
Figur 6. Kärnförsedda chick erytrocyter kan observeras i kapillärerna under en höggradig liposarkom tumorgraft (HE, 100X), inlägg lägrevänster. 
Figur 7. Diagram som visar Ki67 + och Ki67-celler över tiden beroende på avståndet från CAM för båda cellinjer. Zon A = mot CAM, zon C = ytan av plack, zon B = i-mellan zon A och C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidpunkten för ympning och skörd
Timing dagen för ympning utfördes med användning SAOS2 i ECM-gel (36 CAMs) och varierade mellan embryonal utveckling dag 5 och 10.
Innan inkubation dag 9, var CAM inte konsekvent tillräckligt stor för att stödja ECM gelen vi tillämpat. Vid skörd, hade tumörceller ibland hämtas från djupare CAM, och vissa ECM gelproverna låg lös i äggvitan eller på CAM. På dag 5 och 6, var det svårt att undvika att tumörcellerna på chick embryo, vilket resulterar i chick missbildningar eller dödsfall. Från dag 9 var CAM täcker helt ytan under fönstret i de flesta ägg, och ECM gel plack visade anhängare till CAM vid tidpunkten för skörden. Därför hittade vi den perfekta tiden för ympning vara dag 9 av embryonal utveckling.
För bestämning av den ideala tiden för skörd, var SAOS2 och SW1353 skördats efter respectivel1 y, 2 (SAOS2-GFP endast), 4, 5, 6, 7 och 8 dagar efter ympning, eller mellan embryonal utveckling dag 10 och 17. Efter dessa variationer, var en skillnad i längd ansökan om CAM noterades 1-12 dagar.
Knighton publicerade markanta skillnader i tumörtillväxt och tumör revaskularisering enligt den embryonala utvecklingen dag vid tidpunkten för tumörprov ansökan 17. Cellräkning av Ki67-positiva och Ki67-negativa celler visade en stadig ökning av antalet celler från dag 4 för båda cellinjer. Detta är samstämmig med konstaterandet av Ausprunk et al. 21, som uppgav att den tid som krävs för revaskularisering tar 72 timmar. Efter att räkna antalet celler och beräkning av index för spridning, kan vi anta att cellerna dispergerade i ECM gelen aktivt frodas från dag 4 till dag 6 efter ympning. Baserat på diametern på plack, det totala antalet celler och index förspridning, föreslår vi att den perfekta tiden för skörd är dag 16 av embryonal utveckling, eller sju dagar efter ympning.
Den föreslagna tidsramen lämnar forskarna ett fönster på sex dagar för tillämpningen av agenter medan cellerna aktivt föröka, antingen en gång på dag 4 efter ympning eller dagligen under hela tidsramen. För topisk administrering är föreningen appliceras på CAM-ytan. Denna rutt är den vanligast använda en, på grund av tillgängligheten till CAM genom att öppna äggskal / limfilmen 22,23. Även iv administrering är möjlig, är svårigheten att sätta nålar i CAM fartygen en kritisk begränsning. Kinasinhibitorer tillämpas på en daglig basis 24, när kemoterapi under experimentet. Vår hypotes är att lägga till en förening när motsvarar den kliniska behandlingen med cytotoxisk av cytostatika, som klassiskt administreras en gång var 3 veckor, samtidigt som du läggerföreningen på daglig basis kommer att återspegla den dagliga dosen av kinasinhibitorer i den kliniska inställningen. Vi måste dock hålla i minnet att topikal administration kommer att visa olika kinetik / metabolism jämfört med oral eller intravenös administrering hos patienter.
Betydelsen av tekniken och eventuella framtida tillämpningar
Bevarande av cellmorfologin är av största vikt när cellkulturer används i prekliniska modeller. Användningen av homogena extracellulära matriser såsom kollagen typ I 25 eller ECM-gel 26 återställer tumorcellen miljön, så att en mer naturlig tillväxt mönster.
I motsats till in vivo-analyser, har in vitro-analyser inte innehålla stromaceller såsom angiogena vaskulära celler, infiltrerande immunceller eller cancer-associerade fibroblastceller nödvändigt att rekonstruera den tumörogen microenvironment 27. När CAM-analys används för att utvärderaion av tumorgrafts, har vi beskrivit en typisk "invasion kon" från CAM mot tumorgrafts, speglar rekryteringen av stromalceller från chick från tumorgraft 14.
CAM-analysen ger en kombination av att återställa den extracellulära matrisen av ECM-gel och ger värdceller för beredning av tumörogen mikroomgivningen. Som CAM och tumorgraft / plack är lättillgängliga, är administrationen av föreningarna lätt. På detta sätt öppnar CAM-analysen nya perspektiv mot preklinisk utvärdering av sällsynta tumörtyper såsom sarkom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Authors har ingenting att lämna.
Acknowledgments
Celler från SW1353 chondrosarcoma cellinje vänligen tillhandahållen av Prof. Dr PCW Hogendoorn och Prof. Dr J. Bovee av Leiden University, Nederländerna. Vi tackar J. Mestach och G. Wagemans för utmärkt tekniskt bistånd, och G. De Bruyne för professionell ritning av en översikt av våra protokoll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 | |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 | |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 | |
| G418 | Invitrogen | 11811031 | |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 | |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 | |
| PBS | Invitrogen | 20012019 | |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 | |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 | |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 | |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX | |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 | |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII | |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 | |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA | |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 | |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 | |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
References
- Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution. Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).
- Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas. Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).
- Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M.
- Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin. Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).
- Taylor, B. S., Barretina, J., et al. Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).
- Skubitz, K. M., D'Adamo, D. R.
- Nielsen, T. O., West, R. B. Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm. Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).
- Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).
- DeRose, Y. S., Wang, G., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Bertotti, A., Migliardi, G., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Decaudin, D. Primary human tumor xenografted models ('tumorgrafts') for good management of patients with cancer. Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Sys, G., Van Bockstal, M., et al. Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model. Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).
- Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines. Cancer Research. 42, 1826-1837 (1982).
- Deryugina, E., Quigly, J. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).
- Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J. Vis. Exp. (33), e1620 (2009).
- Balke, M., Neumann, A., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Research Notes. 3, 58 (2010).
- Hendrix, A., Maynard, D., et al. Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis. Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).
- Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels. American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).
- Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).
- Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).
- De Wever, O., Hendrix, A., et al. Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices. International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).
- Albini, A., Benelli, R. The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation. Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).
- Hanahan, D., Coussens, L. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
