Summary
Vi beskriver en fremgangsmåde til passivering af en glasoverflade under anvendelse af polyethylenglycol (PEG). Denne protokol dækker overflade rengøring, overflade funktionalisering og PEG-belægning. Vi introducerer en ny strategi for at behandle overfladen med PEG-molekyler over to runder, som giver overlegen kvalitet af passivering i forhold til eksisterende metoder.
Abstract
Single-molekyle fluorescens spektroskopi har vist sig at være medvirkende til at forstå en bred vifte af biologiske fænomener på nanoskala. Vigtige eksempler på, hvad denne teknik kan give til biologiske videnskaber er de mekanistiske indsigt i protein-protein og protein-nukleinsyre-interaktioner. Når interaktioner af proteiner probet på enkelt-molekyle niveau proteinerne eller deres substrater ofte immobiliseret på en glasoverflade, hvilket muliggør en langvarig observation. Denne immobilisering ordning kan indføre uønskede overflade artefakter. Derfor er det vigtigt at passivere glasoverfladen til at gøre det inaktivt. Overfladebelægning anvendelse af polyethylenglycol (PEG) skiller sig ud for sin høje ydeevne i forebyggelsen proteiner fra ikke-specifikt at interagere med en glasoverflade. Det er imidlertid vanskeligt polymerbelægningen procedure på grund af komplikation af en række overfladebehandlinger og de strenge krav om, at en overflade skalvære fri for fluorescerende molekyler ved slutningen af proceduren. Her giver vi en robust protokol med trin-for-trin instruktioner. Det dækker overflade rengøring, herunder Piranha ætsning, overflade funktionalisering med aminogrupper, og endelig PEG-belægning. For at opnå en høj tæthed af en PEG lag, introducerer vi en ny strategi for at behandle overfladen med PEG-molekyler over to runder, hvilket bemærkelsesværdigt forbedrer kvaliteten af passivering. Vi giver repræsentative resultater samt praktiske råd for hver kritisk trin, så alle kan opnå den høje kvalitet overfladepassivering.
Introduction
Når du udfører en enkelt molekyle protein undersøgelse er det vigtigt at opnå en høj kvalitet af overfladepassivering så forsøget er fri for enhver overflade-induceret protein funktionsfejl eller denaturering 1,2. Mens en glasoverflade behandlet med overfladeaktive midler, såsom bovint serumalbumin, er almindeligt anvendt til enkelt-molekyle nukleinsyre undersøgelse 3, graden af dens passivering ikke er høj nok til proteinholdige studier. Et glas overflade belagt med polymer (polyethylenglycol, PEG) er overlegen i passivering ydeevne 4-6. Derved er det blevet almindeligt brugt til enkelt-molekyle protein studier lige siden det blev introduceret til et enkelt molekyle fluorescens undersøgelse 7-10. Polymerovertrækket procedure kræver flere overfladebehandlinger 7,11,12. Derfor er det vanskeligt at følge hele proceduren uden detaljerede instruktioner. Ofte graden af overfladepassivering varierer afhængigt af, hvilken protokol is følges. Her præsenterer vi en robust protokol med trin-for-trin-vejledning, som vil fjerne en af de største flaskehalse for enkelt-molekyle protein studier. Se figur 1 for overblik.
Protocol
1.. Slide Forberedelse og rengøring
Mikrofluidisk kammer består af en kvarts dias og et dækglas. I prisme type total indre refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi, er overfladen af kvarts slide afbildes. Derfor er det vigtigt at rense en kvarts slide grundigt med H2O, acetone, KOH og Piranha løsninger. Th er multi-trins rensning fjerner fluorescerende organiske molekyler på en overflade, der interfererer med enkelt molekyle fluorescens målinger. Derudover Piranha ætsning gør kvarts overflade hydrofil ved at generere hydroxylgrupper. De frie hydroxylgrupper er afgørende for amino-silaniseringen reaktion i trin 3.
- Boring kvarts dias. Bor et par huller i en kvarts objektglas med en 3/4 mm diamantborsprogram (figur 2a). Hvis der ønskes flere kanaler, bore mere pairs huller (figur 2b). Disse huller anvendes til at injicere opløsninger til en mikrofluid kammer i trin 7.
- Hold boret våd i H2O under boringen. H2O optræder som et smøremiddel, der øger levetiden for boret.
- Lejlighedsvis tørre spidsen af boret hjælper bore huller.
- Efter boring af huller, markere den ene side af slide for nem identifikation under pegyleringsfremgangsmåden. Markørerne kan anvendes som reference for at undgå forvirring senere. Til mærkning, kan en diamant bore bit anvendes. Brug ikke nogen pen, da blækket kan få på overfladen.
- Rengøring med H 2 O. Anbring dine dias i et glas farvning krukke. Typisk 5 til 15 slides kan anbringes i en enkelt beholder. Skyl objektglassene med MilliQ H 2 O. Gentag det 3 gange og sonikeres dias med MilliQ H 2 O i 5 min for at fjerne snavs. Aflever vandet og glassene skylles igen 3 gange medMilliQ H 2 O. Bemærk, at 130 W er sonikeringen strøm, der bruges til denne protokol. Højere sonication magt kan nedsætte levetiden af kvarts dias.
- Rengøring med acetone. Udskift MilliQ H 2 O med acetone. Lydbehandle dias med acetone i 20 min eller længere.
- Skylning med H 2 O. Kassér acetone og glassene skylles med MilliQ H 2 O. Gentag det til 3 gange for at fjerne enhver acetone rester.
- Rengøring med KOH. Udskift vandet med 1 M KOH og sonikeres dias i 20 min eller længere. Overdreven ætsning (fx natten over KOH behandling), vil forbedre kvaliteten af overfladen, men vil introducere ridser, der kan interferere med fluorescens billeddannelse.
- Skylning med H 2 O. Skyl objektglassene med MilliQ H 2 O til 3 gange for at fjerne spor af KOH.
- Piranha ætsning.
- Overfør dias til en Duran diasholder eller en skræddersyet Teflon holder og place dem i et bægerglas (1 liter), der er placeret i et kemisk stinkskab.
- Fyld bægeret med 450 ml H 2 SO 4.
- Tilføjes 150 ml H 2 O 2 til 3:1 mellem H 2 SO 4 og H 2 O 2. Når opløsningen begynder at koge spontant temperaturen stiger over 90 ° C. Sørg for, at H 2 O 2 løsning er ved stuetemperatur, før du starter reaktionen. Ellers kan temperaturen af kogende opløsning være lavere end 90 ° C.
- Opløsningen omrøres korrekt blanding og lade bægeret uforstyrret i 20 minutter.
- Tag dias ud af Piranha løsning sammen med slide holderen, og læg dem i et dias holder indeholdende MilliQ H 2 O. I mellemtiden, Piranha løsning kassere i en udpeget affald flaske, når den når stuetemperatur.
- Skyl objektglassene 3 gange med MilliQ H 2 O. Ekstra pleje bør tages yderligere steps at undgå enhver mulig forurening af dias. Fortsæt til trin 3. Det tilrådes at straks fortsætte med følgende trin.
* Forsigtig: Piranha løsning er særdeles reaktivt. Ved håndtering af denne løsning ekstra forsigtighed bør træffes. Hertil kommer, når ved en fejltagelse blandet med organiske opløsningsmidler såsom acetone, kan det forårsage en eksplosion.
2.. Coverslip Rengøring
Mikrofluidisk kammer består af en kvarts dias og et dæksel s læben. Når en prisme-typen TIRF mikroskop anvendes, overfladen af et dækglas ikke afbildes. Derfor er det nok til at rense et dækglas kun med H2O og KOH. I tilfælde skal afbildes (fx via målet type TIRF mikroskopi) et dækglas, anbefales det at behandle dækglassene med Piranha-opløsning (trin 1.7). Bemærk, at hvis PEGylering af dækglasset overfladen ikke er af høj kvalitet, kan det fungere som et dræn for proteiner enville give anledning til variationer i proteinkoncentrationen.
- Skylning med H 2 O. Placer dækglas (24 x 30, 24 x 40 eller 24 x 50 mm 2) i et glas farvning krukke. Typisk 5 til 15 dækglas kan anbringes i en enkelt beholder. Skyl dækglas 3 gange med MilliQ H 2 O.
- Rengøring med KOH. Udskift vandet med 1M KOH og sonikeres dækglas i 20 min eller længere.
- Skylning med H 2 O. Skyl dækglassene 3 gange med MilliQ H2O at fjerne spor af KOH. Fortsæt til trin 3.
3.. Amino-silanisering af Slides og Dækglas
Funktionalisere overfladen af kvarts objektglas og dækglas med amingruppe via amino-silanisering kemi. Methanol anvendes som opløsningsmiddel og eddikesyre som katalysator for amino-silanisering reaktion.
- Skylning med methanol. Udskift MilliQ H 2 O i farvningsresultaterne retter (fra STEP 1 og 2) med methanol. Hold dias og dækglas i methanol, indtil trin 3.3. Opbevar ikke slides og dækglassene i methanol i unødig lang tid (fx flere timer), da urenheder i methanol vil adsorbere til overfladen.
- Forberedelse amino-silanisering løsning.
- Skyl en Pyrex kolbe flere gange med methanol. Lydbehandle kolben med methanol i 5 min eller længere. Det tilrådes at have en dedikeret kolbe, der opretholdes rent.
- Hæld 100 ml methanol i kolben.
- Der tilsættes 5 ml eddikesyre.
- Tilsæt 3 ml APTES (3-aminopropyltrimethoxysilan) og bland forsigtigt ved at ryste det.
- Amino-silanisering. Udskift methanol i farvningsresultaterne retter, der indeholder dias og dækglas med aminosilanization reaktionsblandingen.
- Inkuber i 20-30 min. Under inkubation sonikeres gang i 1 min.
- Skylning med methanol. Udskift enminosilanization reaktion med methanol. Kassér methanol og tilføje en metanol-opløsning. Gentag denne procedure tre gange.
4.. Overfladepassivering Brug Polymer (første runde)
Passivering amin-coatede overflade af kvarts dias og dækglas ved at konjugere NHS-ester af polyethylenglycol (PEG). Denne reaktion udføres med mættende koncentration af PEG-opløsning ved pH 8,5 natten over.
- Tørring dias og dækglas. Tør dias og dækglas hjælp N2 gas og placere dem i rene pipette kasser på en sådan måde, at den side, der skal være PEGyleret vender opad. Pipetten boks er delvist fyldt med MilliQ H 2 O. Det fugtige miljø forhindrer PEGylering løsning fra udtørring under inkubation natten over.
- Forberedelse reaktionsbuffer. Forbered 0,1 M frisk natriumbicarbonat-puffer (pH 8,5) ved opløsning af 84 mg natriumbicarbonat i 10 mlMilliQ H 2 O. Der er ikke behov for at justere pH. Denne opløsning kan opbevares nedfrosset til næste brug (f.eks Trin 6.1).
- Forbereder PEGylering løsning.
- Forbered en PEG-blanding af 0,2 mg biotinylerede NHS-ester PEG (5000 Da) 13 og 8 mg NHS-ester MPEG (5000 Da) i et 1,5 ml rør. Ved udarbejdelsen af N antal dias, forberede N gange større mængde af PEG-blandingen i et enkelt rør.
- Tilføj 64 pi (eller N gange 64 pi for N antallet af objektglas) i frisk fremstillet puffer (trin 4.2). Pipette den op og ned for at opløse dem helt.
- Centrifuger med 16.100 x g i 1 minut for at fjerne luftbobler. Må ikke pipette bagefter. Ellers vil der dannes luftbobler, der interfererer med PEGylering på trin 4.4.
- PEGylering.
- Drop 70 ul af PEGylering blandingen til en tørret kvarts slide fra trin 4.1. Brug 90 pi i tilfælde af 24 x 50 mm 2 coverslip.
- Forsigtigt placere en tørret dækglas fra trin 4.1 over løsningen.
- At have en ensartet og høj kvalitet af PEGylering, passe på ikke at indføre luftbobler. På grund af overfladespænding, kan de fleste af de luftbobler spontant lader reaktionen volumen inden for fem minutter på grund af overfladespænding.
- Glassene inkuberes i et mørkt og fugtigt miljø. Halveringstiden af NHS-ester PEG, som vi bruger ved pH 8 er omkring en time. På et minimum, inkuberes dem i 2 timer. Inkubation natten fører til højere kvalitet af PEGylering (data ikke vist).
5.. Langsigtet Opbevaring
Lagring af PEGylerede dias og dækglas i N2 ved -20 º C.
- Tørring dias og dækglas. Demontere forsigtigt dias og dækglasset ved at skubbe dækglasset til en side, skyl dem med MilliQ H 2 O, og tør dem med N2.
- Lagring dias og dækglas. For øjeblikkelig brug, skal du følge proceduren for den anden runde af PEGylering (trin 6). For at gemme en længere periode, skal du følge de næste skridt.
- Anbring et par af slæden og dækglasset i et 50 ml rør, således at PEGylerede overflader vender væk fra hinanden.
- Delvist luk røret, vakuum røret, og derefter udfylde den med N2. Disse trin hjælper med at bevare PEGyleret overflade i en længere periode. Skru slangen stramt og opbevar det ved -20 ° C. Kvaliteten af de dias stadig godt for op til 3 måneder (figur 3A, højre).
6.. Overfladepassivering Brug Polymer (anden runde)
Yderligere runde af PEGylering at PEG lag tættere og også for at standse eventuelle tilbageværende amingrupper på overfladen. Anvendelsen af korte NHS-ester PEG-molekyler (333 Da) kan være effektiv i at trænge ind i en eksisterende PEG lag. Det er recfales at gøre dette på anden runde af PEGylering lige før du bruger et dias.
- Forberedelse reaktionsbuffer. Forbered 0,1 M frisk natriumbicarbonat-puffer (pH 8,5). Den frosne opløsning fra trin 4.2, kan også anvendes.
- Forbereder PEGylering løsning. Opløs 7 pi 250 mM MS4-PEG i 63 pi af natriumbicarbonatpuffer.
- PEGylering. Følg samme procedure som i trin 4.4. Der inkuberes i 30 min op til natten.
- Tørring dias og dækglas. Skil par af dias og dækglasset, skyl dem med MilliQ H 2 O, tørre dem med N2, og holde dem i en ren pipette kassen. Fortsæt til samling en mikrofluid kammer i trin 7.
7.. Samling af en Mikrofluid afdeling
Samling af en mikrofluid kammer ved hjælp af et par af en PEGyleret kvarts dias og et dækglas. Dobbeltsidet tape anvendes som et afstandsstykke. Kammeret er forseglet med Epoxy lim, og såløsninger bliver introduceret gennem hullerne i kvarts dias.
- Placer en kvarts dias på en flad overflade med PEGylerede opad.
- Lav en kanal (bredde 5 til 7 mm) diagonalt på PEGylerede overflade ved at sætte dobbeltsidet klæbrige bånd over glideren. Kontroller, at hullerne er placeret ved midten af kanalen. Pas på ikke at ødelægge den PEGylerede overfladen under processen med at gøre et kammer. Det er muligt at lave et multi-kanal dias ved at placere og stikning dobbeltsidet klæbrige bånd forskelligt (se figur 2).
- Forsigtigt placere en PEGyleret dækglas på toppen for at fuldføre kammeret. Den PEGylerede side skal vende nedad.
- Forsegle kammeret ved at trykke på dækglasset over det område, hvor dobbeltsidede bånd er placeret. Gør det forsigtigt, men grundigt, således at kammeret bliver vand-tæt forseglet.
- Luk kanterne af kammeret med Epoxy lim.
- Immobilisere Streptavidin eller neutravidin påbiotinyleret PEG lag ved tilsætning af 50 pi 0,1 mg / ml streptavidin eller neutravidin opløsning i T50 (10 mM Tris-HCI [pH 8,0], 50 mM NaCI puffer) under anvendelse af en p200 pipette. Efter 1 min inkubation, skylles med 100 ul T50 buffer.
- Tilføj biotinylerede biologiske molekyler til din single-molekyle billeddannelse.
8.. Slide Genbrug
Genbrug kvarts dias. Brugte slides genbruges ved at tage dækglas og dobbelt-klæbende tape.
- Efter brug opbevares kamrene i vand fra hanen. Langsigtet inkubation i vand letter demontering af kamrene.
- Kog kamre i vand fra hanen ved hjælp af en mikrobølgeovn. Brug en Pyrex bægerglas. Kog i 10 minutter eller længere.
- Tag dækglas og dobbelt-klæbende tape ved hjælp af et barberblad. Tryk ikke på en kvarts dias vinkelret på sit plan. Ellers bryder. Hold barberblad væk fra kanalen. Otherwise, indfører ridser på kanalen.
- Skyl dias ved hjælp af et almindeligt rengøringsmiddel ved at gnide dem med fingrene.
- Anbring dine dias i et glas farvning krukke. Typisk 5 til 15 slides kan anbringes i en enkelt beholder. Tilsæt 10% almindeligt rengøringsmiddel og sonikeres dias i 20 min eller længere. Skyl objektglassene med en stor mængde fanen vand.
- Gå til trin 1.2.
Representative Results
Efter mikrofluid kammerkonstruktionen (Trin 7,1-7,6) og før udførelse af trin 7.7, anbefales det at udføre kvalitetskontrol af PEGyleret overflade.
Hvis overfladen passivering er blevet gjort med succes, der er mindre end 10 ikke-specifikt adsorberet proteiner pr billedområde (25 mm x 25 mm) observeres, når 1-10 nM fluorescensmærket protein indsættes i kammeret (figur 3a, til venstre).
Når en af de rengøring eller reaktionsprodukter trin ikke er blevet gennemført korrekt, at antallet af ikke-specifikt adsorberet proteiner øger, og CCD-skærmen kan blive mættet af fluorescens signaler. For eksempel, hvis Piranha ætsning springes over, er der 100 gange større mængde af ikke-specifik adsorption observeret (figur 3a, sammenlign venstre for midten). Når den anden PEGylering trin springes over, der var cirka 3 tidsa større mængde af ikke-specifik adsorption observeret (figur 3b). Der observeres en lav grad af PEGylering når der anvendes udløbet kemikalier (f.eks APTES opbevares ved stuetemperatur i adskillige måneder) (data ikke vist). Kvaliteten af overfladen falder også ned, når en betydelig mængde tid er gået, siden det var PEGyleret (figur 3a sammenligne tilbage med højre).
Til vores bedste viden, det er første gang, at de to runder af PEGylering introduceres til enkelt-molekyle studier. De to runder af PEGylering garanterer den højeste kvalitet af PEG lags dannelse (figur 3b). Den overlegne karakter af den dobbelte PEGylering er tydeligt vist i filmene (Sammenlign Movie 1a med Movie 1b). I disse film Baggrundskoncentrationerne signaler fra fluorescerende molekyler i opløsning observeret at være meget svagere, når den dobbelte PEGylering var anvendes, hvilket indikerer, at proteiner frastødes mere effektivt ved den dobbelt PEGyleret lag. Selvom dette to-trins proces anbefales kraftigt, kan det andet PEGylering trin springes over, hvis dit eksperiment er tolerabel til ikke-optimal passivering.
Figur 1:. Skematisk af overfladebehandlinger (a) Et objektglas rengøres med acetone, KOH, og Piranha-løsninger. Det er funktionaliseret med APTES og PEGyleret med NHS-ester PEG. (B) En dækglas rengøres med KOH, samt med Piranha løsning, hvis det er nødvendigt. Det er funktionaliseret med APTES og PEGyleret med NHS-ester PEG.
fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2:. Mikrofluid kammer (a) En enkelt-kanals kammer. Mikroskopobjektglasset har to borede huller. Den er samlet med et dækglas under anvendelse af to skiver af en dobbeltsidet tape. (B) En tre-kanals kammeret. Mikroskopobjektglasset har seks huller boret. Den er samlet med et dækglas med fire skiver af en dobbeltsidet tape.
Figur 3: CCD billeder taget med dye-mærkede proteiner i opløsning. (A) CCD billeder blev taget af prisme type total indre refleksion fluorescensmikroskopi ved hjælp af en 60X objektiv med 10 nM Cy3-labeld Rep i opløsning. (Venstre) En overflade blev udarbejdet efter protokollen i denne artikel. (Middle) En overflade var udarbejrød efter protokollen i denne artikel, men Piranha ætsning blev sprunget over. (Højre) En overflade blev fremstillet ifølge protokollen i denne artikel, og lagres i 3 måneder ved -20 º C under nitrogen. (B) CCD billeder taget med 10 nM Cy3-labeld Rep i opløsning. (Venstre) En overflade blev udarbejdet efter protokollen i denne artikel. (Højre) En overflade blev udarbejdet efter protokollen i denne artikel, men i anden runde af PEGylering blev sprunget over. Scale bar = 5 um.
Movie 1: CCD-film taget med dye-mærkede proteiner i opløsning. CCD-film blev taget af prisme type total indre refleksion fluorescensmikroskopi ved hjælp af en 60X objektiv med 10 nM Cy3-labeld Rep i opløsning. Tiden opløsning er 100 msek. (A) En overflade blev udarbejdet efter protokollen i denne artikel. (B) En overflade blev udarbejdet efter protokollen i denne artikel, men i anden runde af PEGyltion blev sprunget over. Klik her for at se film 1a og klik her for at se film 1b.
Discussion
Kritiske trin i denne protokol
Det er vigtigt at gøre overfladen hydrofil før amino-silaniseringen reaktion. Dette blev opnået gennem Piranha ætsning, der genererer frie hydroxylgrupper på et glas / kvarts overflade. Det anbefales ikke at holde piratfisk ætset overflade, der udsættes for enten H 2 O eller luft i en lang periode siden hydrofiliciteten af overfladen går ned gradvist.
NHS-ester PEG-molekyler er reaktive. Det tilrådes at lave portioner og gemme dem under nitrogen i -20 º C. Holdbarheden af APTES kemisk på rumtemperaturen er kort. Det tilrådes at udskifte den med en ny hver måned.
Ændringer af denne protokol
Når du ikke kan bruge Piranha ætsning for nogen praktisk grund, kan du etch anvendelse af KOH i en længere periode (fx overnight), som også vil gøre hydroxylgrupper udsat for. Den faldgrube af denne alternative fremgangsmåde er, at slæden bliver ubrugelig efter et par genbruger på grund af alvorlige ridser.
Det er ofte praktiseret at brænde et glas / kvarts overflade ved hjælp af propan fakkel, som er effektiv til at fjerne fluorescerende organiske materialer 7. Denne procedure blev ikke medtaget i denne protokol, fordi det er overflødigt at Piranha ætsning. Bemærk, at denne procedure vil potentielt føre til oxidation af hydroxylgrupper. Derfor bør denne procedure ikke udføres, når en overflade blev ætset med KOH eller Piranha løsning.
Når en buffer med pH-værdi lavere end 7, som anvendes til enkelt-molekyle billedbehandling, konformationen af PEG skifter fra "svamp" til "pensel", hvilket reducerer graden af passivering. Når pH lavere end 7,0 er brugt, anbefales det derfor, at yderligere passivere overfladen med disuccinimidyl tartarate <sup> 7..
Perspektiver
Dette arbejde har givet en robust protokol for at opnå en høj kvalitet overfladepassivering. Denne protokol vil være nyttigt for enkelt-molekyle fluorescens undersøgelser, der er involveret med proteiner 14 samt protein-komplekser i celleekstrakter og immunpræcipitater 15. Det vil blive udbredt til andre enkelt-molekyle teknikker såsom force spektroskopi og drejningsmoment spektroskopi 16. Det vil også være nyttige til forebyggelse af celler fra adsorption til en overflade 17.
Oplysningerne i dette arbejde protokol er krævende for sine multi-trin procedurer. Overfladepassivering hjælp lipid-PEG 8 og poly-lysin PEG 9 er tilgængelig som en alternativ tilgang. Da de ikke kræver nogen kemiske reaktioner er det let at gennemføre. Graden passivering er ikke så høj som den, der opnås ved kemisk modifgement af en overflade.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
SDC, ACH, og CJ blev støttet af Starting Grants (ERC-StG-2012 til 309.509) gennem Det Europæiske Forskningsråd. J.-MN blev støttet af National Research Foundation (NRF) (2011 til 0.018.198), Korea; og Pioneer Research Center Program (2012-009586) gennem NRF Korea finansieret af Ministeriet for Videnskab, IKT og fremtidig planlægning (MSIP). Dette arbejde blev også støttet af Center for BioNano Sundhed-Guard finansieret af MSIP Korea som Global Frontier Project (H-GUARD_2013-M3A6B2078947). YKL og J.-HH blev støttet af Seoul Science Fellowship Program for Seoul City, Korea. Det mærkede Rep protein var en generøs gave fra Dr. Sua Myong.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Slide preparation and cleaning | |||
| Acetone | Sigma | 32201 | 1 L |
| Coverslips | VWR | 631-0136 631-0144 631-0147 | 24 x 32 mm2, 22 x 40 mm2, 24 x 50 mm2 (No.1½, Rectangular) |
| Diamond drill bits | MTN-Giethoorn, The Netherlands | LA-0564-00DB | 3/4 mm |
| Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
| Glass staining dishes | Fisher Scientific | 300101 | |
| H2O2 | Boom | 6233905 | 1 L, hydrogen peroxide 30%. Opened bottles should be stored at 4 °C. |
| H2SO4 | Boom | 80900627.9010 | Sulfuric acid 95-98% |
| KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
| Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| Quartz slides | Finkenbeiner | 1” x 3”, 1 mm thick | |
| 2. Coverslip cleaning | |||
| Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
| KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| 3. Amino-silanization of slides and coverslips | |||
| Acetic acid | Sigma | 320099-500ML | Acetic acid, glacial |
| APTES | Sigma-Aldrich | 281778-100ML | 3-aminopropyl trimethoxysilane. Store at the room temperature under N2. Replace once in a month. |
| Flask (200 ml) | VWR | Flask (200 ml) | Pyrex flask. Have one flask dedicated for aminosilanization. |
| Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| 4. Surface passivation using polymer (the first round) | |||
| Biotin-mPEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 Da. Store aliquots of 1-2 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. |
| mPEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000-1g | mPEG-succinimidyl valerate (SVA), MW 5,000 Da. Store aliquots of 80 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
| 5. Surface passivation (the second round) | |||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Dimethyl sulfoxide BioReagent, for molecular biology, ≥99.9% |
| DST | Pierce | 20589 | Disuccinimidyl tartarate |
| MS4-PEG | Pierce | 22341 | Short NHS-ester PEG, MW 333 Da. Dissolve 100 mg MS4-PEG in 1.1 ml DMSO. Store 20 µl aliquots at -20 °C. |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
| 6. Assembling a microfluidic chamber | |||
| Double sticky tape | Scotch | 10 mm wide | |
| Epoxy | Thorlabs | G14250 | Devcon 5 minute epoxy |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-1 KG | Sodium chloride |
| Neutravidin | Pierce | 31000 | ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein. Stock in 5 mg/ml in H2O at 4 °C. |
| Streptavidin | Invitrogen | S-888 | Stock 5 mg/ml in H2O or T50 at 4 °C. |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1 KG | Tris |
References
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Surfaces and orientations: much to FRET about. Acc Chem Res. 38 (7), 542-548 (2005).
- Lamichhane, R., Solem, A., Black, W., Rueda, D. Single-molecule FRET of protein-nucleic acid and protein-protein complexes: surface passivation and immobilization. Methods. 52 (2), 192-200 (2010).
- Di Fiori, N., Meller, A. Automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules. J Vis Exp. (33), 1542-1510 (2009).
- Kingshott, P., Griesser, H. J.
- Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu Rev Mater Sci. 26, 365-394 (1996).
- Zalipsky, S., Preface Harris, J. M. Poly(theylene glycol). , 11-12 (1997).
- Selvin, P. R., Ha, T. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2007).
- Finkelstein, I. J., Greene, E. C. Supported lipid bilayers and DNA curtains for high-throughput single-molecule studies. Methods Mol Biol. 745, 447-461 (2011).
- Kenausis, G. L., et al. Poly(L-lysine)-g-Poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: attachment mechanism and effects of polymer architecture on resistance to protein adsorption. J Phys Chem B. 104 (14), 3298-3309 (2000).
- Groll, J., Star Moeller, M. polymer surface passivation for single-molecule detection. Method Enzymol. 472, 1-18 (2010).
- Bahmani, B., Gupta, S., Upadhyayula, S., Vullev, V. I., Anvari, B. Effect of polyethylene glycol coatings of uptake of indocyanine green loaded nanocapsules by human spleen macrophages in vitro. J Biomed Opt. 16 (5), (2011).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay. J Vis Exp. (37), e1689 (2010).
- Upadhyayula, S., et al. Coatings of polyethylene glycol for suppressing adhesion between solid microspheres and flat surfaces. Langmuir. 28 (11), 5059-5069 (2012).
- Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications. Nat Rev Genet. 14, 9-22 (2012).
- Joo, C., Fareh, M., Narry Kim, V. Bringing single-molecule spectroscopy to macromolecular protein complexes. Trends Biochem Sci. 38 (1), 30-37 (2012).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5, 491-505 (2008).
- Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318, 426-430 (2007).
